Le cimici dei letti si affidano ai neuroni recettori olfattivi alloggiati nei loro sensilli olfattivi antennali per rilevare le sostanze semiochimiche nell'ambiente. Utilizzando la registrazione di un singolo sensillo, dimostriamo un metodo per valutare la risposta delle cimici dei letti alle semiosostanze chimiche ed esploriamo il processo di codifica coinvolto.
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Articolo metodologico
Utilizzando Sensillum singolo controllo per rilevare olfattiva Neuron Risposte di cimici a semiochimici
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il sistema olfattivo insetto svolge un ruolo importante nella rilevazione semiochimici nell'ambiente. In particolare, il sensilla antennale che ospitano neuroni singoli o multipli all'interno, sono considerati per rendere l'importante contributo nel rispondere agli stimoli chimici. Con la registrazione direttamente potenziale d'azione nel sensillum olfattiva dopo l'esposizione a stimoli, la registrazione singola sensillum (SSR) tecnica fornisce un approccio potente per studiare le risposte neurali di insetti agli stimoli chimici. Per il bug letto, che è un parassita umano noto, sono state caratterizzate più tipi di sensillum olfattiva. In questo studio, abbiamo dimostrato risposte neurali di bug letto sensilli olfattivi a due stimoli chimici e le risposte di dose-dipendente di uno di loro utilizzando il metodo SSR. Questo approccio consente ai ricercatori di condurre screening precoce per i singoli stimoli chimici sul olfattiva sensilla cimici, che forniscono informazioni preziose per lo sviluppo di nuovi attrattivi cimici dei letti o repellenti e benefici il letto sforzi di controllo bug.
Introduzione
Il letto bug comune Cimex lectularius L (Hemiptera: Cimicidae), come un ectoparassita temporanea, è un insetto succhia-sangue obbligato, il che significa che la loro sopravvivenza, lo sviluppo e la riproduzione richiedono fonti di sangue da padroni di casa, compresi gli esseri umani e gli animali 1,2. Anche se la trasmissione del virus è stato raramente segnalato a causa di C. lectularius, il fastidio generato da mordere una infestazione incide gravemente padroni di casa sia fisicamente che psicologicamente 3. L'introduzione e l'uso diffuso di insetticidi chimici, soprattutto DDT, abbassato il rischio di infestazioni e per la fine delle infestazioni 1950 erano ad un livello così basso che non erano più un serio interesse pubblico. Tuttavia, una serie di possibili fattori hanno portato ad rinascita delle popolazioni delle cimici dei letti in tutto il mondo, come l'uso ridotto di insetticidi, un calo di sensibilizzazione del pubblico, aumentato viaggiare attività, e lo sviluppo della resistenza agli insetticidi 4-9.
Segnali chimici nell'ambiente vengono rilevati e riconosciuti dagli insetti attraverso organi olfattivi, quali antenne e palpi mascellari. La sensilla olfattiva sulle antenne degli insetti svolgono un ruolo cruciale nel rilevare questi segnali chimici. Le molecole chimiche entrano nella cuticola antennale attraverso i pori sulla superficie cuticola. Odorizzante proteine leganti nella linfa legano antennale a queste molecole chimiche e trasportarli sui recettori olfattivi 10. I recettori olfattivi e la loro co-recettore dal canale ionico cationico non selettivo sulla membrana neuronale, che sarà depolarizzata volta queste molecole chimiche sono riconosciuti dai recettori olfattivi 11.
Singola registrazione sensillum (SSR) è stato sviluppato per rilevare la modifica extracellulare del potenziale d'azione provocata dall'applicazione di entrambi stimoli chimici o non chimici. Inserendo un elettrodo di registrazione nella linfa sensillum ed un elettrodo di riferimentoin qualche altra parte del corpo dell'insetto (di solito o gli occhi composti o dell'addome), la frequenza di scarica dei neuroni in risposta a stimoli possibile registrare 12. Le variazioni del numero di picchi rappresentano la sensibilità dell'insetto a stimoli specifici. Stimoli chimici di diverse identità e concentrazione saranno suscitare diverse risposte neurali, con diversi tassi di cottura e strutture temporali, e possono quindi essere utilizzati per studiare il processo di codifica degli insetti ai prodotti chimici specifici.
Per il bug letto comune, entrambe le forme sessuali condividono lo stesso modello di sensilli olfattivi sulle antenne: nove scanalato sensilli perno C, 29 capelli come E (E1 ed E2) sensilli, e un paio ciascuno di Dα, Dβ, Dγ peg liscio sensilli 13,14. Come multipli neuroni sono stati identificati in ogni tipo di sensillum, non è facile distinguere i potenziali di azione di diversi neuroni sistemati nella stessa sensillum, quindi per questo esperimento la totanumeri l di potenziali d'azione sono stati contati off-line per un periodo di 500 msec prima e dopo la stimolazione. Il numero di potenziali d'azione dopo la stimolazione è stata poi sottratto il numero dei potenziali d'azione prima della stimolazione e moltiplicato per due per quantificare le variazioni del tasso di fuoco in ogni singolo sensillum in spighe al secondo 15.
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Protocollo
1. Preparazione degli strumenti, stimoli Solutions, e Bed Bugs
- Preparare una soluzione al 50% KNO 2 (w / v) in un flacone da 20 ml.
- Affilare due microelettrodi di tungsteno in soluzione KNO 2 a 5 V ripetutamente immergendo gli elettrodi di tungsteno in e fuori della soluzione.
- Circa affilare il filo di tungsteno mediante immersione di circa 10 mm di filo di tungsteno in e fuori della soluzione KNO 2 alla velocità di 2 salse / sec per circa 5 minuti, che può notevolmente consumare l'estremità anteriore del filo di tungsteno.
- Delicatamente affinare l'elettrodo immergendo circa 1 mm della punta del filo e dalla soluzione alla velocità di 2 salse / sec per almeno 1 minuto in modo da rendere un punto dell'elettrodo fine e tagliente. Verificare il diametro punta dell'elettrodo sotto il microscopio spesso fino a raggiungere 0.2-0.5 micron, che dovrebbe essere abbastanza bene per forare la cuticola di bug letto sensillum olfattiva.
Nota: Durante manualmente taglientezare l'elettrodo, la velocità di immersione del filo di tungsteno nella soluzione KNO 2 non è costante per tutto il tempo. Con più pratica, è molto più facile da mantenere una velocità relativamente costante affilatura dell'elettrodo. Il tempo di affilatura è anche incerta a seconda di quanto bene l'elettrodo dovrebbe essere. Qui, un elettrodo con il diametro di ~ 0,2 micron è sufficiente per perforare attraverso il sensillum olfattiva.
- Diluire ciascun stimoli chimici in dimetilsolfossido (DMSO) dal composto pulito per una concentrazione iniziale di 1:10 v / v in soluzione madre. Creare una serie di diluizioni decadici seconda di quanti dosi necessarie nell'esperimento, sempre con DMSO, da ciascuna delle soluzioni madre per ogni sostanza chimica. Qui, utilizzare 10% (+) - β-pinene e eucaliptolo.
- Posizionare i giorni digiuni o sette post-alimentazione cimici adulto (maschio o femmina) dal Ft. Dix colonia (un dono del Dr. Haynes in Università del Kentucky) da utilizzare in tegli sperimentare in una capsula di Petri.
Nota: Non esiste un numero esatto di cimici collocate nella scatola di Petri. Può essere pochi o molti.
2. Bed Bug Antenne Preparazione
- Anestetizzare le cimici in ghiaccio (2-3 minuti).
- Fissare sia le antenne e il corpo degli insetti su un vetrino da microscopio con nastro biadesivo e rimuovere le gambe con le forbici sottili.
- Utilizzare un piccolo spillo per toccare delicatamente le antenne in modo tale da attaccarli sul nastro continuo.
- Posizionare il vetrino contro una piccola sfera (~ 1 cm di diametro) di cera dentale per facilitare la manipolazione e regolare a un angolo appropriato (~ 90 °) per l'elettrodo di registrazione (Figura 1).
- Una volta assicurato, posizionare il bug del letto al microscopio stereo, accendere la sorgente di luce fredda e regolare l'intensità della luce fino a quando l'antenna è chiaramente presentato, e mettere a fuoco il microscopio sul secondo flagellum dell'antenna bed bug ad alto ingrandimento (720x) .
Nota: L'intensità di illuminazione usato nell'esperimento non viene quantificata, che dipende molto da come occhi dello sperimentatore sentire l'intensità di illuminazione.
3. Sensillum singolo Recording
- Collegare il preamplificatore (10X) con il controller di acquisizione del segnale, che è collegata al computer per la registrazione del segnale e visualizzazione. Accendere il computer e avviare il software, ad esempio, AutoSpike32 e cliccare la modalità "Record" dalla barra dei menu. Quindi scegliere la "onda", in modo da avviare la registrazione dei segnali ad onda.
Nota: Una linea piatta che va da sinistra a destra del monitor ripetutamente dovrebbe essere visibile. Qui, la finestra di registrazione dura 40 sec. Registrazione Max onda è 10 sec. Frequenza di campionamento selezionata è 96000 e frequenza di campionamento digitale è 240. C'è 0% di offset e nessuna filtrazione, nessuna rettifica per i segnali di registrazione. Tutte queste impostazioni dei parametri nel software possono essere modificati in base alle esigenze. - Accendere l'altoparlante collegato al preamplificatore, che viene utilizzato per presentare la modalità tonificazione per le risposte neuronali da sensillum antenne.
- Inserire l'elettrodo di riferimento nell'addome del letto bug stabilizzato.
Nota: L'elettrodo di riferimento è stato tenuto da un basamento del metallo fissata magneticamente al-tavolo dell'aria. - Dopo l'elettrodo di riferimento è stato collegato addome dell'insetto letto, spostare l'elettrodo di registrazione, che è collegato al preamplificatore e manipolata da un micromanipolatore, verso l'estremità posteriore dell'antenna dell'insetto letto.
- Quando l'elettrodo di registrazione è in contatto con la giusta punta dell'antenna, accendere il microscopio e localizzare l'elettrodo a basso ingrandimento.
- Regolare l'elettrodo di registrazione aumentando gradualmente l'ingrandimento fino sia l'elettrodo e il sensillum antennale sono nello stesso piano e chiaramente visibili al microscopio.
Nota: A questo punto, il microscopio è usualemente al massimo ingrandimento. - Inserire l'elettrodo di registrazione nel pozzo del sensillum utilizzando il micromanipolatore e andare un po 'più in profondità, se il rumore di fondo è alto rispetto al potenziale d'azione.
- Una volta che i potenziali d'azione chiari sono osservate dal sensillum registrato, riempire una micropipetta con il 10% (+) - β-pinene. Utilizzare la micropipetta depositare 10 microlitri aliquota del 10% (+) - β-pinene su una striscia di carta filtro (~ 3 x 15 mm) posta all'interno di una pipetta Pasteur di vetro.
- Collegare la pipetta caricata alla presa del tubo di flusso di impulso del regolatore stimolo e posizionare la punta della pipetta nel piccolo foro nel tubo orientato verso l'antenna.
- Quando tutte queste connessioni sono stabilizzati, premere il pedale del controller stimolo per fornire 0,5 sec soffio di stimolo (0,5 L / min) nel flusso d'aria umidificata continuo. Sarà avviata la registrazione dei potenziali d'azione simultaneamente quando l'footswitch è depresso. Il processo di registrazione sarà l'ultimo per 10 secondi a partire dal 1 sec prima della stimolazione.
- Contare le potenziali d'azione off-line per due periodi 500 msec, uno prima e uno dopo la stimolazione. Sottrarre qualsiasi cambiamento del tasso di picco durante il 500 msec dopo stimolazione dalla attività spontanea registrata durante i precedenti 500 msec e convertire i conteggi nella scala convenzionale di picchi / s moltiplicandoli per 2.
4. stimolo sostituzione nel SSR
- Una volta che il pedale è stato attivato, consegnare il 10% (+) - β-pinene nella pipetta sul baco antenne letto e registrare la risposta a questo specifico odorizzante per 10 secondi, dopo di che la pipetta viene rimosso.
- Etichetta un'altra nuova pipetta con l'eucaliptolo 0,001% da testare. Mettere un piccolo pezzo di carta da filtro su cui 10 ml di stimolo è stato applicato, nel nuovo pipetta.
- Attendere 2-5 minuti fino a quando lo stimolo è completamente vaporized nella pipetta di vetro. Fissare la pipetta sul uscita del tubo di flusso di impulsi.
- Inserire la punta della pipetta nel piccolo foro del tubo orientato verso l'antenna. Premere il pedale e avviare la registrazione 10 sec.
- Scollegare la pipetta e preparare un altro pipetta con 0,01% eucaliptolo.
- Prova tutto il resto delle dosi di eucaliptolo (dal 0,001% al 10%) sul sensilli antennali di osservare le risposte dose dipendenti. Prova dal più diluito ai minimi diluire dosi.
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Risultati
Registrazione sensillum singolo è una potente tecnica investigativa utilizzata negli studi di insetti ecologia chimica e fisiologia neurale. Indagare le risposte neurali di insetti a composti volatili diversi, in particolare quelli pensato per essere ecologicamente legata alla sopravvivenza e lo sviluppo degli insetti, non solo ci dà preziose intuizioni nel processo olfatto insetto, ma apre anche nuove e promettenti strade che potrebbero provocare allo sviluppo di nuovi reagenti utili pe...
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Discussione
La tecnica Sensillum singolo di registrazione è stato ampiamente utilizzato nel testare le risposte neurali di insetti come moscerini della frutta, zanzare e cimici dei letti a diversi stimoli chimici nell'ambiente. Questi stimoli chimici sono spesso sciolti e diluiti in un solvente comune per preparare differenti dosi di trattamenti. Tuttavia, i solventi possono produrre differenti tassi di rilascio ben diversi per gli stimoli. Precedenti studi su alcuni insetti ampiamente studiate, come Drosophila melanogaster...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il progetto è stato supportato dal premio AAES 461Hatch/Multistate Grants ALA08-045 e ALA015-1-10026 a N.L.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Filo di tungsteno | A-M SYSTEMS | #716500 | Utilizzato per preparare l'elettrodo |
| KNO2 | Sigma | #310484 | Utilizzato per affilare il filo di tungsteno |
| Alimentatore CA | BK Precision | 1653A | Fornisce la tensione per affilare il filo di tungsteno |
| Leica Z6 APO Microscopio | Leica | 10447424 | Utilizzato per osservare i sensilli sulle antenne |
| Controller Simulus | Syntech | CS-55 | Utilizzato per il controllo dell'applicazione di stimolo |
| Controller di acquisizione USB a 4 canali | Syntech | IDAC-4 | Visualizzazione su schermo in tempo reale di tutti i segnali prima e durante la registrazione |
| Sorgente luminosa | SCHOTT | A20500 | Fornitura di sorgenti luminose per l'osservazione |
| Micromanupulatore | Leica | 115378 | Utilizzato per piccoli movimenti di elettrodo |
| Altoparlante | Juster | 95a | Collegato con il controller di acquisizione IDAC-4 e che fornisce il suono per il segnale |
| Supporto magnetico | Narishige | GJ-1 | Utilizzato per tenere l'elettrodo di riferimento, la cimice dei letti stabilizzata e il tubo di erogazione dello stimolo |
| TMC Tabella di isolamento dalle vibrazioni | TMC | 63-500 | Utilizzato per isolare le vibrazioni dalle apparecchiature |
| Vetrino coprioggetti | Tedpella | 2225-1 | Utilizzato per tenere la cimice dei letti |
| Nastro biadesivo | 3M | XT6110 | Utilizzato per stabilizzare la cimice dei letti sulla clip di copertura |
| Cera dentale | Dentakit | DK-R012 | Utilizzato per sostenere la clip di copertura dove è stabilizzata la cimice dei letti |
Riferimenti
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