Method Article

Optogenetic risonanza magnetica funzionale

DOI:

10.3791/53346

⸱

April 19th, 2016

 ,  ,  , 
1Neurology and Neurological Sciences, Stanford University, 2Electrical Engineering, Neurology and Neurological Sciences, Stanford University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive i passaggi e l'analisi dei dati necessari per eseguire con successo la risonanza magnetica funzionale optogenetica (ofMRI). ofMRI è una nuova tecnica che combina la lettura fMRI ad alto campo con la stimolazione optogenetica, consentendo la mappatura specifica del tipo di cellula dei circuiti neurali funzionali e delle loro dinamiche in tutto il cervello vivente.

Abstract

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L'indagine sulla connettività funzionale di precisi circuiti neurali attraverso l'intero cervello intatto può essere ottenuta attraverso la risonanza magnetica funzionale optogenetica (ofMRI), che è una nuova tecnica che combina la risoluzione spaziale relativamente alta della risonanza magnetica ad alto campo con la precisione della stimolazione optogenetica. Le fibre ottiche che consentono l'erogazione di specifiche lunghezze d'onda della luce in profondità nel cervello in vivo vengono impiantate nelle regioni di interesse al fine di stimolare in modo specifico tipi di cellule bersaglio che sono state geneticamente indotte a esprimere canali di conduttanza transmembrana sensibili alla luce, chiamati opsine. La fMRI viene utilizzata per fornire un metodo non invasivo per determinare la risposta dinamica globale del cervello alla stimolazione optogenetica di specifici circuiti neurali attraverso la misurazione del segnale BOLD-level-dependent (Blood-oxygen-Level-Dependence), che fornisce una misurazione indiretta dell'attività neuronale. Questo protocollo descrive la costruzione di impianti in fibra ottica, gli interventi chirurgici di impianto, l'imaging con fotostimolazione e l'analisi dei dati necessari per eseguire con successo la risonanza magnetica. In sintesi, la stimolazione precisa e la capacità di monitoraggio dell'intero cervello della risonanza magnetica sono fattori cruciali nel rendere la risonanza magnetica un potente strumento per lo studio della connettomica del cervello sia in stati sani che malati.

Introduction

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Optogenetic la risonanza magnetica funzionale (ofMRI) è una tecnica innovativa che combina la risoluzione spaziale di alto campo fMRI con la precisione di stimolazione optogenetic 1-11,38, consentendo cella specifica di tipo mappatura dei circuiti neurali funzionali e la loro dinamica su tutto il territorio cervello. Optogenetics permette di tipi cellulari specifici per essere mirati per la stimolazione con l'introduzione di canali conduttanza transmembrana, chiamati opsins fotosensibili. Elementi specifici di circuiti neurali sono modificati geneticamente per esprimere questi canali, consentendo millisecondo-tempistica modulazione di attività nel cervello intatto 1-15. fMRI fornisce un metodo non invasivo per determinare risposta dinamica globale del cervello alla stimolazione optogenetic di circuiti neurali specifici attraverso la misurazione del segnale di ossigeno nel sangue livello-dipendente (BOLD) 16-18, che fornisce una misura indiretta dell'attività neuronale.

La combinazione di queste due tecniche, definito optogenetic risonanza magnetica funzionale (ofMRI), è vantaggioso rispetto ad altri metodi di attività cerebrale registrazione durante la stimolazione quali elettrofisiologia perché può fornire una vista dell'intero cervello relativamente elevata risoluzione spaziale. Questo consente il rilevamento dell'attività neuronale in risposta alla stimolazione mirata a grandi distanze dal sito di stimolazione senza la necessità di impianto di elettrodi di registrazione invasive 1-11. ofMRI è vantaggioso rispetto al metodo più tradizionale di eseguire la stimolazione elettrica durante fMRI, che può assumere diversi tipi di cellule vicino all'elettrodo e quindi confondere l'influenza causale di ogni popolazione 19. Inoltre, gli elettrodi utilizzati per la stimolazione elettrica e la corrente generata possono produrre manufatti durante l'imaging MR 20. Infatti, ofMRI consente l'osservazione della influenza sull'attività cerebrale globale dal modulati specificosu un'ampia varietà di tipi cellulari mediante l'uso di tecniche avanzate di targeting genetica come il sistema Cre-Lox in animali transgenici o l'uso di promotori. controllo ottico combinatoria con controllo tutto il cervello è possibile con ofMRI attraverso l'uso di entrambi NpHR per inibire e ChR2 per eccitare tipi cellulari specifici. Il toolkit optogenetic disponibili per l'uso in ofMRI è anche rapidamente migliorando nel tempo con l'introduzione di opsine con una maggiore sensibilità alla luce o cinetiche migliorati, di stabilizzati opsine funzione passo (SSFOs) o di opsine rosso-spostato che può negare l'esigenza di fibra impiantato ottica, consentendo la stimolazione non invasiva durante l'imaging 21. Queste possibilità non sono disponibili con stimolazione elettrica.

Tuttavia, artefatti segnale risultante dal riscaldamento del tessuto a causa di consegna luce nel cervello sono stati riportati 22, dove è stato dimostrato modificazioni temperatura indotta tempi di rilassamento per produrre pseufare attivazione. I ricercatori che svolgono ofMRI devono quindi essere consapevoli di questo potenziale confondente. Con la buona impostazione e controlli, il problema può essere affrontato. Inoltre, relativamente bassa risoluzione temporale di misurare la risposta emodinamica in fMRI può essere un fattore limitante per certe applicazioni di questa tecnica.

Questo protocollo prima descrive la costruzione degli impianti in fibra ottica che consentono un'erogazione di specifiche lunghezze d'onda della luce in profondità nel cervello in vivo. Il protocollo descrive quindi la consegna del vettore virale opsina-codifica per una regione precisa del cervello utilizzando la chirurgia stereotassica. Avanti il ​​protocollo descrive il processo di tutto il cervello risonanza magnetica funzionale durante la stimolazione luce simultanea. Infine, il protocollo descrive l'analisi dei dati di base dei dati acquisiti.

Da segnalare la optogenetics qui descritto richiede un impianto cronico per la consegna della luce. Tuttavia, gli impianti in fibra ottica sono stabili e biocompatibile, consentendo una lettura longitudinale e ricerca di circuiti neurali in un periodo di mesi 23,24.

In sintesi, la stimolazione precisa e tutto il cervello capacità di monitoraggio ofMRI sono fattori determinanti nel fare ofMRI un potente strumento per lo studio delle connectomics del cervello. Inoltre, può favorire la comprensione romanzo sui meccanismi di malattie neurologiche 25 agganciati con differenti modelli animali. Infatti, ofMRI è stato utilizzato per chiarire l'attività di rete di sub-regioni dell'ippocampo distinti associati a crisi epilettiche 8. Pertanto, i laboratori interessati a rispondere a domande di neuroscienze sistemi di livello troveranno questa tecnica di importanza.

Protocol

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Etica Dichiarazione: procedure sperimentali qui sono stati approvati dal Comitato di Stanford University istituzionale cura degli animali e Usa (IACUC).

1. Preparazione Cavi Patch e una boccola impianti

Nota: Anche se cavi patch e gli impianti puntale sono disponibili in commercio, la produzione di questi in-casa consente disegni di specialità e costerà meno.

  1. Per preparare un cavo patch fibra per fornire luce dal laser per l'impianto nel cervello, prima fendere la fibra ottica alla lunghezza desiderata.
    1. Utilizzando una mannaia di fibra, terminare la fibra ottica per produrre un fine appartamento al punto di terminazione. Se la fibra è stato rivestito con un rivestimento, togliere la giacca con un attrezzo fibra-stripping anticipo.
    2. Fendere l'altra estremità della fibra ottica per produrre la lunghezza desiderata per il cavo, assicurando che il cavo sia sufficientemente lungo da estendersi dalla sorgente luminosa per l'animale all'interno del foro dilo scanner.
  2. Mescolare una piccola quantità di colla epossidica in un rapporto 1: 1 su un foglio di alluminio poco prima del passaggio successivo, come colla epossidica diventa troppo viscosa per uso 5 min dopo la miscelazione.
  3. Utilizzando un bastoncino di legno, applicare delicatamente colla epossidica alla parte della fibra che verrà inserito all'interno della parte concava della boccola ceramica e poi applicare una piccola goccia sulla superficie della parte piatta del puntale. Dopo inserendolo nella boccola, assicura che un piccolo spezzone di fibra (<0,5 mm) sporge dalla parte piatta del puntale ceramico. Lasciare che la colla epossidica per indurire O / N per ottenere risultati ottimali.
  4. Sul lato del cavo patch in fibra ottica che si collega alla sorgente di luce laser, applicare delicatamente colla epossidica alla parte della fibra che verrà inserito all'interno del lato concavo della ghiera del connettore FC / PC e quindi applicare una piccola goccia sulla superficie della parte piatta del puntale. Dopo aver inserito nella ghiera, garantireche un piccolo spezzone di fibra (<0,5 mm) sporge dalla parte piatta del puntale. Lasciare che la colla epossidica per indurire O / N per ottenere risultati ottimali.
  5. Lucidare l'estremità piatta delle ghiere per entrambi i lati del cavo utilizzando un disco di lucidatura utilizzando pinzette per applicare una leggera pressione verso il basso sulla ghiera rendendo rotazioni figura-8 su fogli di ossido di alluminio lappatura (da 3 micron a 1 micron a 0,3 micron graniglia ).
  6. Esaminate l'estremità piatta del puntale con un microscopio ad ingrandimento 100X. Assicurarsi che la superficie dell'estremità piatta, compresa la superficie della fibra ottica in sé, è priva di qualsiasi colla epossidica; continuare lucidatura se colla epossidica rimane sulla superficie. Assicurarsi che la superficie in fibra ottica non è rotto o tagliato.
    ATTENZIONE: Assicurarsi che il personale prendono corsi di formazione sulla sicurezza del laser appropriate e indossare occhiali di protezione laser prima di maneggiare apparecchiature laser.
  7. Collegare il cavo patch in fibra ottica per la sorgente di luce laser attraverso il connettore FC / PC e allineare il fpunta Iber al punto focale del giunto. Misurare la potenza di trasmissione della luce della fibra con un misuratore di potenza per garantire un'adeguata emissione luminosa.
    Nota: I seguenti passaggi sono per la preparazione di puntali di ceramica con fibre ottiche per l'impianto cronico nel cervello; puntali di ceramica sono vuoti al centro e portano fibre ottiche per fornire luce da un cavo patch ad una regione di interesse (ROI) nel cervello.
  8. Utilizzando una mannaia di fibra, terminare la fibra ottica per produrre un fine appartamento al punto di terminazione. Se la fibra è stato rivestito con un rivestimento, togliere la giacca con un attrezzo fibra-stripping anticipo.
  9. Fendere l'altra estremità della fibra ottica per produrre la lunghezza desiderata per l'impianto nel cervello. Determinare la lunghezza della fibra usando un atlante stereotassiche di indirizzare il ROI all'interno del cervello.
    1. Ad esempio: per indirizzare ippocampo dorsale di ratto che è di 3,5 mm sotto bregma, assicurarsi che la lunghezza della fibra sporge dal ferrule è 3,5 mm + 0,25 mm, che rappresentano per lo spessore del cranio e che consentono di margine di errore. Pertanto, controllare che la lunghezza finale della fibra è di 3,5 mm + 0,25 mm + 10.5 mm (lunghezza del puntale) = 14,25 millimetri.
  10. Mescolare una piccola quantità di colla epossidica in un rapporto 1: 1 su un foglio di alluminio poco prima del passaggio successivo (la colla epossidica diventa troppo viscosa per uso 5 min dopo la miscelazione).
  11. Utilizzando un bastoncino di legno, applicare delicatamente colla epossidica alla parte della fibra che verrà inserito all'interno della parte concava della boccola ceramica e poi applicare una piccola goccia sulla superficie della parte piatta del puntale. Dopo inserendolo nella boccola, assicura che un piccolo spezzone di fibra (<0,5 mm) sporge dalla parte piatta del puntale ceramico. Lasciare che la colla epossidica per indurire O / N per ottenere risultati ottimali.
  12. Lucidare l'estremità piatta del puntale utilizzando un disco di lucidatura utilizzando pinzette per applicare una leggera pressione verso il basso sulla ghiera rendendo figura-8 di rotaziones su alluminio fogli ossido di lappatura (da 3 micron a 1 micron a 0,3 micron grit).
  13. Esaminate l'estremità piatta del puntale con un microscopio ad ingrandimento 100X. Assicurarsi che la superficie dell'estremità piatta, compresa la superficie della fibra ottica in sé, è priva di qualsiasi colla epossidica; continuare lucidatura se colla epossidica rimane sulla superficie. Assicurarsi che la superficie in fibra ottica non è rotto o tagliato.
  14. Coppia la ferrula lucidato ad un cavo patch fibra ottica con un manicotto ghiera e collegare il cavo patch ad una sorgente di luce laser. Misurare la potenza di trasmissione della luce sulla punta della fibra con un misuratore di potenza per garantire un'adeguata efficienza.
  15. Tenere un registro della potenza richiesta dal puntale del cavo patch per ciascun impianto ghiera per emettere il livello di potenza desiderato sulla punta della fibra ottica (2,5 mW in questo protocollo). Eliminare ghiere con un tasso di attenuazione di oltre il 50% e con il modello di uscita non circolare.

2. Stereotassica ImpChirurgia lantation e Virus iniezione

  1. Assicurarsi che tutte le procedure sperimentali che prevedono l'uso di animali sono approvati dal IACUC locale. Mantenere condizioni asettiche durante interventi chirurgici di sopravvivenza seguendo procedure asettiche, compreso l'uso di guanti sterili, mascherine sterili, teli chirurgici sterili e strumenti chirurgici sterilizzati.
    ATTENZIONE: Assicurarsi che i chirurghi indossano un equipaggiamento di protezione individuale (DPI) tra cui gli occhiali di sicurezza prima di iniziare la procedura. Seguire le procedure di biosicurezza standard quando si lavora con vettore adeno-associato (AAV), avendo cura di evitare spruzzi. Smaltire i rifiuti AAV in un contenitore per rischio biologico.
  2. Caricare una siringa microlitro con abbastanza AAV per l'iniezione nell'animale più extra per tenere conto di eventuali perdite di volume (totale di 4 ml per animale), mantenendo la siringa in ghiaccio prima dell'uso. In questo protocollo, si usa AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP ad un titolo di 4x10 12 VG / ml. Posto l'animale sotto Isofluranoe anestesia con una camera di induzione, collegato ad un isoflurano set vaporizzatore precisione al 3 - 4% con una sorgente di gas di ossigeno.
  3. Radersi la testa con un rasoio elettrico ed eseguire un lavaggio chirurgico tripla sulla pelle con betadine e un etanolo risciacquo 70%.
  4. Una volta che l'animale è in anestesia profonda (controllare il riflesso punta e tasso di respirazione), immobilizzare il cranio dell'animale in un apparato stereotassico con borchie di posizionamento intra-auditive e la barra dei denti.
    Nota: L'intera procedura avrà 1 - 2 ore, da induzione dell'anestesia al recupero.
  5. Impostare l'anestesia ad un livello appropriato (1 - 3% isoflurano sul vaporizzatore) e monitorare continuamente i segni vitali dell'animale, regolando l'anestesia se necessario per mantenere un tasso di respirazione di ~ 40 respiri / min. Somministrare pomata oftalmica sugli occhi dell'animale per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
  6. Fare a 15 - 20 mm linea mediana del cuoio capelluto incisione con un bisturi e ritrarre il cuoio capelluto con emostatici chirurgici unttached al periostio. Riferimento lambda e bregma per posizionare la punta sopra le coordinate per il ROI.
  7. Praticare un piccolo craniotomia (2-3 mm) sopra il ROI con un trapano dentistico, facendo attenzione a non forare il cervello. Inserire lentamente ago attaccato alla siringa microlitri attraverso craniotomia al ROI nel cervello.
  8. Con un regolatore della pompa microsiringa, iniettare 2 ml di soluzione di vettore nel ROI. Utilizzare una portata di 150 Nl / min per evitare danni ai tessuti. Dopo l'iniezione è terminata, attendere 10 min prima di rimuovere la siringa lentamente, ad una velocità di 0,5 mm / min.
  9. Dopo l'iniezione, asciugare la superficie del cranio. Riferimento lambda e bregma confermare coordinate e quindi inserire l'impianto ferrula alla profondità obiettivo (per esempio 3,5 mm sotto bregma per ippocampo dorsale) ad una velocità di circa 0,5 mm / min. Montare l'impianto puntale al cranio con cemento dentale. Dopo il cemento dentale è solidificato, sigillare l'incisione con punti di sutura (size 5-0 per i ratti) attorno al tappo di cemento dentale.
  10. Dopo l'intervento chirurgico, collocare l'animale nella gabbia singolarmente alloggiato con la metà della gabbia in cima ad un riscaldatore per il recupero anestesia. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Non mettere l'animale in compagnia di altri animali fino a quando non ha pienamente recuperato.
  11. Per la gestione post-chirurgica del dolore, amministrare la buprenorfina per via sottocutanea ogni 12 ore ad un dosaggio di 0,05 mg / kg per 24 ore. Somministrare polvere antibiotica giornaliero nel sito di incisione per 3 giorni.
  12. Rimuovere le suture circa due settimane dopo l'intervento chirurgico per evitare formazione di croste.
  13. Attendere 4 - 6 settimane dopo l'iniezione di virus per sufficiente espressione di geni optogenetic prima di eseguire esperimenti.

3. optogenetic risonanza magnetica funzionale

ATTENZIONE: Fare attenzione intorno al campo magnetico permanente di uno scanner MRI. equipm sicuroent, tra cui il generatore di funzioni, fonte di luce, ventilazione, serbatoi capnografo e del gas, sufficientemente lontano (almeno oltre il limite del 5 Gauss).

  1. Posto l'animale in anestesia gas con una camera di induzione, collegato ad un isoflurano set vaporizzatore precisione al 5% con una sorgente di gas di ossigeno.
  2. Una volta che l'animale è in anestesia profonda (riflesso di controllo punta e la frequenza respiratoria), intubare l'animale secondo il protocollo dettagliato nel Rivard et al. (2006) per consentire il monitoraggio di anidride carbonica da capnografia 26. Nota: l'intubazione è fondamentale per il mantenimento di adeguati livelli di CO 2 espiratorio durante l'imaging.
  3. Fissare l'animale nella culla dello scanner.
    Nota: In questo protocollo, la culla era su misura prodotta ma tali culle sono anche disponibili in commercio. Le funzioni di ratto culla per fissare l'animale all'interno dello scanner per la consegna di anestesia, aria riscaldata e per la limitazione del movimento.
  4. Fornire un mix di isoflurano (Ranging da 1.2 specificato - 1,5%) in ossido di azoto di circa il 60% e il 40% di ossigeno tramite tubazione attraverso la culla. Assicurarsi che la testa dell'animale è fissato saldamente al fine di evitare artefatti da movimento.
  5. Fornire aria riscaldata attraverso il tubo nella culla e inserire un termometro rettale con il lubrificante per controllare la temperatura del corpo. Somministrare pomata oftalmica sugli occhi dell'animale per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
  6. Collegare il cavo patch fibra ottica ad una sorgente di luce laser e misurare l'uscita sulla punta del puntale del cavo patch con un misuratore di potenza.
  7. Regolare il livello di potenza adeguato (determinata in precedenza nella fase 1.15) per produrre il risultato desiderato (2,5 mW in questo protocollo) sulla punta della fibra ottica impiantato all'interno del cervello. Poiché eccessiva potenza dalla fibra ottica può potenzialmente causare danni ai tessuti all'interno del cervello o causare il riscaldamento dei tessuti che produrrà artefatti del segnale, non aumentare significativamente la potenza del laseral di là della produzione destinata.
  8. Evitare dispersione di luce dall'impianto con un cono di nastro isolante nero e coprire gli occhi dell'animale. Coppia il cavo di fibra all'impianto ghiera sull'animale con un manicotto ghiera.
  9. Posizionare la bobina sulla testa dell'animale. Inserire la culla con animali nel foro dello scanner.
    Nota: In questo protocollo, il singolo-ciclo di trasmissione-ricezione bobina è stato personalizzato prodotto e pre-sintonizzata per ricevere la frequenza radio ottimale dal tessuto cerebrale.
  10. Monitor della frequenza e la temperatura corporea di respirazione nel corso di questo processo, la regolazione del ventilatore artificiale e riscaldamento se necessario per mantenere i valori fisiologici entro i limiti (in modo che CO espiratorio 2 è 3 - 4% ruotando le manopole sul ventilatore per regolare la frequenza ictus e il volume e che la temperatura è di 37 ° C facendo clic sulle frecce per l'impostazione della temperatura).
  11. Selezionare una sequenza di posizionamento per l'immagine nella posizione testa di animale. Se la Bpioggia non è al iso-center, regolare la posizione testa di animale e ripetere la scansione posizionamento finché il cervello è al iso-center. Selezionare una sequenza spessoramento lineare e fare clic su Carica nella finestra di selezione sequenza. Avanti, fare clic su Start per ridurre disomogeneità del campo magnetico.
    Nota: Shimming è un passaggio fondamentale che influenzerà direttamente l'integrità dei dati fMRI.
  12. Selezionare una sequenza T2-weighted e cliccare carico nella finestra di selezione sequenza. Avanti, fare clic su Start per acquisire immagini ad alta risoluzione anatomiche coronali T2 prima di fMRI per controllare l'integrità complessiva del cervello e per confermare la posizione della protesi in fibra ottica.
    Nota: Queste immagini possono essere utilizzate come sovrapposizioni di anatomia per la serie di scansione ofMRI.
  13. Collegare cavi BNC dal porto attivazione dello scanner MRI al generatore di funzione in modo che la sorgente di luce laser viene azionato secondo un paradigma stimolazione sperimentale.
    Nota: In questo protocollo, la stimolazione pAradigm è di 30 sec di base seguita da 20 sec on / off 40 sec per sei minuti.
  14. Selezionare un multi-slice gradient eco ricordato sequenza (GRE) e fare clic su Carica nella finestra di selezione sequenza. Avanti, scegliere Avvia per acquisire il 35 mm x 35 mm (2D FOV) nel piano fette coronali con 0,5 mm x 0,5 millimetri x 0,5 mm Risoluzione spaziale.
    Nota: La sequenza GRE qui utilizzato ha un tempo di ripetizione (TR) e il tempo di eco (TE) del TR / TE = 750/12 msec e un flip angle 30 °.
  15. Al termine della scansione, rimuovere l'animale dallo scanner e monitor finchè ha risvegliato dall'anestesia e può mantenere decubito sternale.

4. Analisi dei dati ofMRI

Nota: Le seguenti operazioni vengono eseguite in MATLAB come descritto in una pubblicazione on high-throughput ofMRI 27.

  1. Dopo che i dati di scansione grezzo è stato trasferito al computer utilizzato per l'analisi, utilizzare scorrevole ricostruzione finestra per aggiornare l'immagine ogni TR, conuna lettura a spirale quattro Interleave, 750 msec TR e 12 msec tempo di eco per acquisire 23 fette al serie di scansione. Invece di ricostruzione convenzionale dove nuove immagini fMRI sono ricostruiti solo dopo che tutti gli intercalari sono acquisiti per ogni sezione, il metodo di ricostruzione finestra scorrevole ricostruisce le immagini dopo l'acquisizione di ogni Interleaf 27.
  2. Elaborare i dati grezzi per la ricostruzione bidimensionale gridding, la correzione del movimento, e il calcolo di serie storiche come descritto in precedenza 27.
  3. Utilizzare un metodo di soglia coerenza per determinare voxel attivati ​​calcolando la modulazione percentuale del segnale BOLD di ciascun voxel rispetto al periodo di riferimento raccolte prima della stimolazione come descritto in precedenza 27. Si calcolano i valori di coerenza come la grandezza della trasformata di Fourier alla frequenza dei cicli di stimolazione ripetuti divisi dai quadrati somma di tutti i componenti di frequenza di 8.
  4. Utilizzando i dati di serie temporali per ogni vOxel, immagini media al movimento corretto che appartengono alle scansioni consecutive dello stesso paradigma di stimolazione primi. Quindi allineare le immagini medi 4D ad un telaio di coordinate comune con una trasformazione corpo rigido a sei gradi di libertà più scalatura isotropo di confronto all'interno e tra animali come descritto in precedenza 27.

Results

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Figura 1 e la Figura 2 mostrano i dati rappresentativi derivanti da 20 Hz (15 larghezza di impulso msec, 473 nm, 30% duty cycle) stimolazione optogenetic della corteccia motoria. Un paradigma stimolazione di 30 secondi di base seguita da 20 sec on / off 40 sec per sei minuti è stato utilizzato. Studi precedenti hanno dimostrato che questo paradigma produce robusto segnale BOLD dall'1,8 stimolazione optogenetic. Figura 1 mostra voxel attivati ​​rilevati sia sul sito locale di stimolazione (corteccia motoria) e nel talamo, come risultato delle connessioni sinaptiche a lungo raggio tra queste regioni. la Figura 2 mostra che le informazioni temporali possono essere raccolte da HRFs, come risposta talamica è ritardata (pendenza iniziale inferiore) rispetto alla risposta corteccia motoria dopo stimolazione optogenetic.

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Figura 1. Attivazione Mappa di BOLD segnale indotto dalla stimolazione optogenetic di CaMKIIa-cellule che esprimono in Motor Cortex. I valori coerenza dei voxel attivi, identificati come quelli significativamente sincronizzato a stimolazioni ripetute, sono mostrati sovrapposto su una fetta anatomica coronale pesata in T2. I dati raccolti nel corso di un numero minimo di sei, 30 d'epoca sec (30 sec iniziale di base e sei cicli di stimolazione 20 sec on / off 40 sec con 473 nm di luce, 20 Hz, 15 di larghezza di impulso msec) sono condensati in una mappa di attivazione. Fette sequenziali sono di 0,5 mm l'uno dall'altro e la posizione della protesi in fibra ottica è segnato con il triangolo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

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Movimento del soggetto durante l'imaging è una fonte significativa di manufatto che può portare alla corruzione dei dati. Opportunamente garantire l'animale sul supporto di imaging in grado di ridurre al minimo tali artefatti come sarà il mantenimento di adeguati livelli di anestesia. Qui, abbiamo usato isoflurano ma anestetici alternativi, come medetomidina o ketamina e xilazina, dovrebbe essere considerato. Tuttavia, i livelli e la scelta di anestetico possono influenzare molti parametri nel cervello, tra cui la risposta BOLD 28. Isoflurano può causare cambiamenti nel neuronale eccitabilità 29. Altri anestetici possono anche influenzare GABA inibizione sinaptica 30. Così, la scelta di anestesia è importante quando performing ofMRI data la sua capacità di influenzare l'attività neuronale. ofMRI in assenza di anestesia è possibile ma può essere difficile con maggiore movimento dall'animale, che può essere ridotto se l'animale è abituato; sono stati precedentemente eseguiti tali studi svegli ofMRI unND eviterebbe l'effetto confondente di anestesia sul cervello 9,10. Post-elaborazione algoritmi di correzione di movimento possono essere utilizzati per attenuare notevolmente gli effetti del moto. Molti di questi metodi esistono, compreso l'inverso algoritmo di Gauss-Newton impiegato in questo protocollo, che minimizza la somma dei quadrati funzione costo dell'immagine di riferimento e l'immagine sotto la correzione. L'algoritmo è utile perché permette la correzione del movimento veloce e robusto, con una progettazione della piattaforma parallela della GPU per ridurre i tempi di lavorazione 27.

Per la ricostruzione dei dati in questo protocollo, software scritto su misura in un ambiente MATLAB è stato utilizzato per la ricostruzione gridding bidimensionale, in cui i campioni a spirale sono ricostruiti in k-spazio in immagini a griglia 31-33. dati di serie temporali sono stati generati calcolando la modulazione percentuale del segnale BOLD di ogni voxel rispetto al periodo di riferimento raccolti prima della stimolazione. Voxel la cui serie temporali sono stati synsincronizzato alle blocchi di stimolazione optogenetic con un valore di coerenza di 0,35 o maggiore sono stati definiti come voxel attivati; questo valore coerenza corrisponde a meno di 10 -9 valore P 8. Valori di coerenza sono stati calcolati come l'ampiezza della trasformata di Fourier alla frequenza dei cicli di stimolazione ripetuti divisi dai quadrati somma di tutti i componenti di frequenza di 8,27. Errore di Familywise può essere controllato tramite la correzione di Bonferroni per confronti multipli. Metodi alternativi di analisi possono essere utilizzati, compresi i test statistici parametrici, come i modelli lineari generali (GLMS). Il metodo coerenza richiede meno prima conoscenza del HRF rispetto al modello lineare generale convenzionale. Pertanto, è vantaggioso quando esplorare dati utilizzando ofMRI. Tuttavia, il metodo di coerenza può essere utilizzato solo per i dati con disegni a blocchi o selezionato i disegni evento-correlati con un fisso interstimulus intervallo e non possono essere utilizzati nei dati ofMRI con altro evento-relaTed progetta o disegni misti. Successivamente, dinamica modelli causali (DCM) può essere utilizzato per analizzare interazioni tra regioni cerebrali identificate attraverso ofMRI. DCM è una tecnica statistica bayesiana sviluppata per l'analisi della connettività funzionale da risposte del sistema agli ingressi sperimentali durante fMRI 34.

Ulteriori problemi tecnici per ofMRI sono discussi qui. Gli impianti possono essere danneggiate o cadere, porta alla rimozione dell'animale colpito dallo studio. ambulatori re-impianto non sono raccomandati a causa dell'incertezza addizionale di colpire lo stesso ROI come nella chirurgia di impianto originale e causa di problemi di benessere degli animali. A causa della notevole quantità di tempo e risorse investire in ogni soggetto animale, considerazione della resistenza del materiale è un problema significativo quando si sceglie un cemento dentale adatto per l'uso in studi ofMRI. L'intervento chirurgico di impianto è un fattore critico nel massimizzare la longevità del implant e soggetti animali. Ad esempio, assicurando che il teschio sia asciutta prima di applicare il cemento dentale e ponendo una quantità adeguata di cemento intorno alla protesi puntale ceramico in grado di garantire la stabilità dei potenziali temporale mesi-lungo dell'animale nel corso dello studio. Inoltre, i disegni della gabbia alternative possono essere esplorati e discussi con la funzione di cura degli animali locale per evitare gabbie con cime di filo che tiene il cibo e l'acqua che spesso sporgono nella gabbia e fornire opportunità per l'animale di danneggiare l'impianto. È importante sottolineare che il cemento dentale deve essere scelto con cura per ridurre gli artefatti che influenzano l'imaging e cementi alternative possono essere testati con l'applicazione su un fantasma e di imaging in uno scanner prima dell'uso in esperimenti su animali. Tentativi ed errori con i vari cementi dentali ha dimostrato che il cemento utilizzato in questo protocollo dà relativamente pochi artefatti. Un'altra sfida tecnica nell'esecuzione ofMRI è l'accuratezza di posizionamento fibra ottica al ROI previsto, data la estremely piccole distanze che possono esistere tra i nuclei nel cervello 35. Dopo aver completato gli interventi chirurgici di impianto, le scansioni anatomiche T2 possono essere utilizzati per determinare il corretto posizionamento sovrapponendo su un atlante del cervello. L'abilità del chirurgo e pratica l'esecuzione di questi interventi può migliorare i tassi di collocamento corretti. La specificità e l'espressione del opsina al ROI previsto possono essere verificati a conclusione dello studio di perfusione l'animale e che fissa il cervello, tramite immunoistochimica o la fluorescenza endogena di un reporter di proteine ​​tag al opsin per la visualizzazione. Queste proteine ​​reporter possono anche essere colocalized con altre proteine ​​per garantire che il opsin è espresso in tipi cellulari neuronali desiderati 1,8,15,25. Come accennato in precedenza, i manufatti possono sorgere quando si esegue ofMRI a causa del riscaldamento del tessuto dalla consegna di luce 22. Il riscaldamento dei tessuti provoca la modifica dei tempi di rilassamento, con conseguente falsa segnale BOLD. Per garantire che accoltiva- derivante dalla stimolazione luminosa durante ofMRI non è a causa di questo manufatto, controlli opsin-negativi devono essere eseguite in cui soluzione salina iniettata animali o animali iniettati con vettori di controllo fluoroforo (come AAV-CaMKIIa-EYFP) subiscono ofMRI. Inoltre, la fibra solo ben costruito impianti ottica con una buona efficienza della trasmissione della luce dovrebbe essere utilizzato per eliminare la necessità di utilizzare i poteri alti laser. studi ofMRI sono stati condotti in cui falsa attivazione a causa di riscaldamento dei tessuti, non è stato un problema 1,6-8,10,11.

Per quanto riguarda la scelta del vettore per introdurre i geni optogenetic richieste in neuroni per l'espressione, AAV non sono noti per causare malattie negli esseri umani e sono quindi una scelta conveniente, dato il livello di biosicurezza più basso necessario per utilizzare questi agenti (BSL-1). Inoltre, un gran numero di nuclei vettore trasportare AAV confezionati con vari geni optogenetic in magazzino e con più sierotipi. Il sierotipo di AAV deve essere scelto based sul target popolazione di cellule destinate a garantire livelli ottimali di espressione 36,37. Lentivirus possono anche essere usati ma richiedono un livello di biosicurezza superiore. Il periodo di tempo richiesto per sufficientemente espressione dei geni optogenetic è variabile a seconda del modello animale specifico utilizzato, dalla particolare AAV utilizzato e dalla specifica paradigma sperimentale. In questo protocollo, ratti Sprague Dawley a 11 settimane di età sono utilizzati e gli studi optogenetic cominciano da quattro a sei settimane dopo l'iniezione di virus. Topi transgenici possono essere utilizzati anche in studi optogenetic. È necessario eseguire esperimenti pilota per determinare la quantità di tempo richiesto per sufficientemente espressione dei opsins. paradigmi stimolazione può variare a seconda del opsin specifico utilizzato. In questo protocollo, AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP viene utilizzato e il paradigma di stimolazione è di 20 sec on / off 40 sec. Se si utilizza un SSFO, il paradigma di stimolazione varia perché l'SSFO richiede solo un breve impulso di luce per essere acsere attivato e poi un breve impulso di luce ad un'altra lunghezza d'onda da terminare.

Un ulteriore preoccupazione critica durante l'esecuzione ofMRI impedisce dispersione di luce dall'interfaccia dell'impianto puntale con il cavo patch in fibra ottica durante la stimolazione optogenetic per evitare che un segnale di confusione cerebrale proveniente da stimolazione visiva, anche quando l'animale è anestetizzato. Coni di nastro isolante nero possono essere usati per bloccare la luce dei puntali e per coprire gli occhi dell'animale. Importante, valori fisiologici inclusi espiratorio CO 2 e la temperatura corporea del soggetto deve essere mantenuto correttamente per tutta la durata del imaging. CO espiratorio 2 deve essere compresa tra 3 - 4% e la temperatura corporea a 37 ° C. Inoltre, le sequenze di spessoramento a ridurre il più disomogeneità possibile nel campo magnetico prima di iniziare ofMRI scansiona notevolmente determina la qualità dei dati BOLD risultanti. Il controllo di questi fattoriè fondamentale nella produzione di dati affidabili ofMRI. In questo protocollo, i laser DPSS sono utilizzati come fonte di luce per la stimolazione optogenetic. Poiché la luce laser è coerente potenza più che sufficiente può essere facilmente fornita attraverso la fibra ottica. sorgenti LED accoppiati a fibre ottiche sono disponibili da fornitori commerciali, ma hanno lo svantaggio di una ridotta potenza di trasmissione della luce. La sorgente di luce laser richiede l'allineamento di ogni particolare cavo patch in fibra ottica, ma con la pratica, l'allineamento può essere realizzato in pochi secondi a minuti.

Le future applicazioni di ofMRI includono l'uso di opsine di prossima generazione, come opsine rosso-spostato per consentire la stimolazione non invasiva durante l'imaging. Inoltre, l'impianto di MRI compatibile EEG o elettrodi di registrazione simili lungo con l'impianto in fibra ottica potrebbe consentire l'acquisizione di dati ad alta risoluzione temporale oltre ai dati ad alta risoluzione spaziale di MRI. ofMRI con electrophysiolregistrazione ogical potrebbe fornire informazioni dettagliate sulla connettività funzionale del cervello. In sintesi, il potere di ofMRI per monitorare l'intero cervello in risposta alla stimolazione di popolazioni di cellule specifiche definite per identità genetica o anatomica rende ofMRI uno strumento fondamentale utilizzare nello studio delle malattie neurologiche e dei connectomics del cervello sano.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto attraverso il finanziamento del NIH/NIBIB R00 Award (4R00EB008738), dell'Okawa Foundation Research Grant Award, del NIH Director's New Innovator Award (1DP2OD007265), del NSF CAREER Award (1056008) e dell'Alfred P. Sloan Foundation Research Fellowship. J.H.L. desidera ringraziare Karl Deisseroth per aver fornito i plasmidi di DNA utilizzati per gli esperimenti optogenetici. Gli autori desiderano inoltre ringraziare Andrew Weitz e Mankin Choy per l'editing del manoscritto e tutti i membri del Lee Lab per la loro assistenza con gli esperimenti di risonanza magnetica.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
7 Tesla scannerAgilent TechnologiesDiscovery MR901 Sistema
Sprague Dawley rattiCharles RiverCrl:SDdi 11 settimane
FujikuraCT-05
fibra ottica multimodaleThor LabsAFS105 / 125Y
spogliarellista per fibre   Thor LabsT08S13
manicotto diviso in ceramicaPrecision Fiber ProductsSM-CS1140S
colla epossidicaThor LabsG14250
applicatori con punta in cotoneStoelting Co.50975
ghiere in zirconia ceramica multimodaleProdotti in fibra di precisioneMM-FER2002
FC / PCThor Labs30128C3
Prodotti in fibra di precisioneM1-80754
foglio di lappatura in ossido di alluminio, 0,3 e micro; mThor LabsLFG03P
foglio di lappatura in ossido di alluminio, 1 µ min ossido di alluminio Thor LabsLFG1P
, 3 & micro; mThor LabsLFG3P
microscopio biologico binoculare 40X-1.000XAmscopeB100
di sicurezza laserKentekKXL-62W01
473 nm DPSS laserLaserglowLRS-0473
594 nm DPSS laserLaserglowLRS-0594
Allen hex wrench set2,0 mm (5/64") per l'allineamento della punta della fibra al punto focale dell'accoppiatore nel
misuratore di potenza laser, sensore Si, 400-1.100 nmThor LabsPM121D
Isoflurano (isotesia)Henry Schein 50033
vaporizzatore isoflurano con camera di induzioneVetEquip901806
NanoFil 100 &; l siringaWorld Precision InstrumentsNANOFIL-100
UltraMicroPump con controller SYS-Micro4World Precision InstrumentsUMP3-1
generatoredi funzioni A.M.P.I.Master-8
stereotubo per piccoli animaliDavid Kopf InstrumentsModello 940 
Modello 683 ventilatore per piccoli animaliApparecchio Harvard550000
Capnografo Tipo 340Harvard Apparecchio733809
trapano dentale (kit micromotore rotante)Foredom Electric Co.K.1070
(lacrime artificiali)Rugby00536-6550-91
sterilizzatore per strumentiCellPoint ScientificGerminator 500sterilizzatore a perle di vetro
antibiotico in polverePfizerNEO-PREDEFneomicina solfato, isoflupredone acetato e tetracaina cloridrato
buprenorfina antidolorificoHospiraNDC:0409-2012Tabella III sostanza controllata, 0,3 mg/ml stock
Mannaia per fibre Connettore multimodale Disco di lucidatura in fibra ottica Foglio di lappatura occhiali Unguento oftalmico

References

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