Presentiamo un protocollo che descrive un metodo semi-quantitativo per misurare sia l'attaccamento del virus dell'influenza A alle cellule A549, sia l'internalizzazione delle particelle virali nelle cellule bersaglio mediante citometria a flusso.
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Articolo metodologico
Misurazione Attaccamento e internalizzazione del virus A in cellule A549 mediante citometria di flusso
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'attaccamento alle cellule bersaglio seguito dall'internalizzazione sono i primissimi passi del ciclo di vita del virus dell'influenza A (IAV). Forniamo qui un protocollo dettagliato per misurare i cambiamenti relativi nella quantità di particelle virali che si attaccano alle cellule A549, una linea cellulare epiteliale polmonare umana, nonché nella quantità di particelle che vengono internalizzate nella cellula. Utilizziamo virus biotinilati che possono essere facilmente rilevati dopo la colorazione con streptavidina marcata con Cy3 (STV-Cy3). Descriviamo la crescita, la purificazione e la biotinilazione di A/WSN/33, un ceppo di laboratorio IAV ampiamente utilizzato. Le particelle di IAV biotinilate legate a freddo su cellule A549 vengono colorate con STV-Cy3 e misurate mediante citometria a flusso. Per studiare l'assorbimento delle particelle virali, il virus legato al freddo viene lasciato internalizzare a 37 °C. Al fine di distinguere tra particelle virali esterne e internalizzate, viene applicata una fase di blocco: i punti di legame liberi sulla biotina del virus attaccato sulla superficie cellulare sono legati da streptavidina non marcata (STV). La successiva permeabilizzazione cellulare e la colorazione con STV-Cy3 consentono quindi il rilevamento delle particelle virali internalizzate. Presentiamo un calcolo per determinare la quantità relativa di virus internalizzato. Questo test è adatto per misurare gli effetti di trattamenti farmacologici o altre manipolazioni sull'attaccamento o l'internalizzazione di IAV.
Introduzione
L'ingresso del virus influenzale A (IAV) è un processo in più fasi che inizia con il legame del virus ai recettori presenti sulla membrana plasmatica delle cellule bersaglio 1. Il recettore per IAV è l'acido sialico che è presente su una grande varietà di glicoproteine e glicolipidi. La emoagglutinina (HA) proteina di IAV che è presente nella busta virale si lega all'acido sialico e media così fissaggio delle particelle virali alla membrana plasmatica di cellule bersaglio 2. Il virus entra nelle cellule tramite endocitosi clatrina-mediata, ma anche percorsi di inserimento alternativi, come macropinocitosi, sono stati descritti
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Protocollo
Nota prima dell'inizio: cappa a flusso laminare e Uso appropriato biocontenimento quando si lavora con virus vivo. Qui, descriviamo le condizioni di crescita idonee a ceppo di virus influenzale cultura A / WSN / 33. Molteplicità di infezione (MOI) e di incubazione possono variare a seconda ceppo virale usato.
1. Preparazione di A biotinilato / WSN / 33 Virus
- Seed Madin-Darby kindey canino (MDCK), le cellule in un pallone T175 cm 2 utilizzando Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% FBS e 1% di penicillina-streptomicina (Pen / Strep). Cellule di coltura a 37 ° C fino a circa il 70% di confluenz....
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Risultati
Un cartone descrive le quattro diverse condizioni sperimentali è mostrato in Figura 1 I risultati di un esperimento rappresentativo sono presentati nelle Figure 2 -. 5. Nel campione "0 min", virus biotinilato è freddo legato alle cellule, che possono essere visualizzati da STV-Cy3 colorazione bersaglio (figure 1 e 2). Quando viene applicato un passo di blocco (in "0 min + STV" campione), virus sulla .......
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Discussione
Il nostro protocollo descrive un modo semplice per misurare l'attaccamento virus e internalizzazione mediante citometria a flusso. Esso consente l'utilizzo di virus di tipo selvatico marcato che imita più da vicino le infezioni da virus rispetto all'uso di particelle simili a virus (VLP). Mentre il nostro protocollo è stato ottimizzato per misurare attaccamento e internalizzazione di IAV può essere facilmente adattato per altri virus. Inoltre, come la citometria a flusso è utilizzato per la lettura, co-color.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del Fondo nazionale svizzero (31003A_135278) per SST. MOP è il beneficiario di una borsa di dottorato di ricerca del Fondo AXA. Ringraziamo Patricia Nigg aiuto per la progettazione di figura 1.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life Technologies | 41966-052 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Penicillina-streptomicina | Life Technologies | 15140-163 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-169 | |
| BSA | VWR Calbiochem | 126579 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-100 | |
| D-saccarosio | Fluka | 84100 | |
| TRIS | Biosolve BV | 20092391 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3680 | |
| EZ-LINK NHS-SS-BIOTINA kit | Fisher Scientific | W9971E | |
| Bio Rad Protein Bio Assay | Bio Rad | 500-0006 | |
| provette a pozzetto profondo (microprovette da 1,2 ml) | Milian | 82 00 001 | |
| PFA | Lucerna chimica Scienze della microscopia elettronica | 15710 | |
| provette per ultracentrifuga | Hemotec HmbH | 253070 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93420 | |
| STV-Cy3 | Life Technologies | 43-4315 | |
| STV | Life Technologies | 43-4302 | |
| azoturo di sodio | Fluka | 71290 | |
| neuraminidasi batterica / sialidase | Sigma-Aldrich | N6514-1UN |
Riferimenti
- Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets. J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).
- Palese, P., Shaw, M. L. Fields Virolog. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
- Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K.
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Ristampe e permessi
