Articolo metodologico

Misurazione Attaccamento e internalizzazione del virus A in cellule A549 mediante citometria di flusso

DOI:

10.3791/53372

⸱

4 novembre 2015

 , 
1Institute of Medical Virology, University of Zurich

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentiamo un protocollo che descrive un metodo semi-quantitativo per misurare sia l'attaccamento del virus dell'influenza A alle cellule A549, sia l'internalizzazione delle particelle virali nelle cellule bersaglio mediante citometria a flusso.

Abstract

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L'attaccamento alle cellule bersaglio seguito dall'internalizzazione sono i primissimi passi del ciclo di vita del virus dell'influenza A (IAV). Forniamo qui un protocollo dettagliato per misurare i cambiamenti relativi nella quantità di particelle virali che si attaccano alle cellule A549, una linea cellulare epiteliale polmonare umana, nonché nella quantità di particelle che vengono internalizzate nella cellula. Utilizziamo virus biotinilati che possono essere facilmente rilevati dopo la colorazione con streptavidina marcata con Cy3 (STV-Cy3). Descriviamo la crescita, la purificazione e la biotinilazione di A/WSN/33, un ceppo di laboratorio IAV ampiamente utilizzato. Le particelle di IAV biotinilate legate a freddo su cellule A549 vengono colorate con STV-Cy3 e misurate mediante citometria a flusso. Per studiare l'assorbimento delle particelle virali, il virus legato al freddo viene lasciato internalizzare a 37 °C. Al fine di distinguere tra particelle virali esterne e internalizzate, viene applicata una fase di blocco: i punti di legame liberi sulla biotina del virus attaccato sulla superficie cellulare sono legati da streptavidina non marcata (STV). La successiva permeabilizzazione cellulare e la colorazione con STV-Cy3 consentono quindi il rilevamento delle particelle virali internalizzate. Presentiamo un calcolo per determinare la quantità relativa di virus internalizzato. Questo test è adatto per misurare gli effetti di trattamenti farmacologici o altre manipolazioni sull'attaccamento o l'internalizzazione di IAV.

Introduzione

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L'ingresso del virus influenzale A (IAV) è un processo in più fasi che inizia con il legame del virus ai recettori presenti sulla membrana plasmatica delle cellule bersaglio 1. Il recettore per IAV è l'acido sialico che è presente su una grande varietà di glicoproteine ​​e glicolipidi. La emoagglutinina (HA) proteina di IAV che è presente nella busta virale si lega all'acido sialico e media così fissaggio delle particelle virali alla membrana plasmatica di cellule bersaglio 2. Il virus entra nelle cellule tramite endocitosi clatrina-mediata, ma anche percorsi di inserimento alternativi, come macropinocitosi, sono stati descritti 3-6. L'interazione tra HA e acido sialico sembra essere sufficiente per mediare sia, attaccamento e innescando internalizzazione delle particelle virali 7. Tuttavia, i recettori di ingresso alternativi sono stati proposti e il loro ruolo nella voce IAV sono attualmente in fase di studio 1,8,9.

Curtualmente, gli sforzi sono fatti per identificare i fattori dell'ospite che sono coinvolti nel ciclo di vita virale con l'obiettivo di sviluppare nuove terapie urgenti antivirali 10-12. Virus ingresso sarebbe un passo favorevole per il targeting crescita IAV al fine di bloccare l'infezione virale nel suo punto più presto. Misurare diverse fasi di ingresso IAV sperimentalmente è impegnativo come di solito grandi quantità di virus sono necessari per individuare il virus in arrivo. Inoltre, il campo di rilevamento delle variazioni entrata del virus è lineare solo a causa della mancanza di replicazione virale. Ciò sottolinea la necessità di test ad alta sensibilità.

Il saggio qui presentiamo permette il rilevamento di virus attaccato alla superficie cellulare e rilevamento del virus internalizzato in relazione alla quantità totale di virus associato alle cellule. L'utilizzo di virus di tipo selvatico biotinilato permette conveniente misurazione attraverso colorazione con STV-Cy3 e la lettura mediante citometria a flusso. Virus Biotinilato è freddo legato alla cellas per consentire l'attaccamento, ma impediscono l'internalizzazione delle particelle virali. Le cellule possono essere fissate, permeabilizzate e colorate con STV-Cy3 per misurare il virus allegato. Il segnale da virioni extracellulari, allegati può essere abrogata se un passo bloccante viene applicata prima fissazione in cui le cellule vengono incubate con streptavidina-etichettato (STV). In una fase successiva, a seguito dell'adesione di biotinilato IAV, la temperatura è spostato a 37 ° C e l'interiorizzazione di particelle virali è permesso di prendere posto. Particelle interiorizzato sono protetti da legame di STV consentendo in tal modo la discriminazione tra i virus extra- ed intracellulari.

Per condizione sperimentale, sono necessari quattro campioni: '0 min': Il primo esempio, l'etichetta '0 min', è quello di misurare il virus legato a freddo sulla superficie cellulare. '0 min + STV': Il secondo campione, etichettato '0 min + STV', dà l'intensità del segnale di base di questo esperimento. Il virus si è bloccato with STV e il seguente segnale di colorazione con STV-Cy3 dovrebbero essere molto inferiore rispetto al campione '0 min'. '30 Min ': Il terzo campione, '30 minuti' contiene attaccato e internalizzata virus a causa del passaggio di temperatura a 37 ° C per 30 min. '30 Min + STV ': Il quarto campione, la data del 30 min + STV' misura la frazione intracellulare di virus. Il passo di blocco STV viene applicato dopo il periodo di incubazione 30 min. Come risultato, le particelle virali sulla superficie cellulare sono vincolati da STV lasciando solo virus internalizzati disponibile per colorazione con STV-Cy3. La quantità relativa di virus internalizzati può essere calcolato come rapporto del virus internalizzati (misurata nel '30 min + ATS 'esempio) divisa per la quantità totale di virus (descritta dal '30 min' esempio).

Come controllo si consiglia di includere cellule mock-infettate. Il segnale seguente STV-Cy3 colorazione delle cellule mock-infettate dà lo sfondorisultante dal protocollo di colorazione. Un controllo per il fissaggio IAV è il pre-trattamento delle cellule con neuraminidasi batterica (NA). Unirà NA off acido sialico da glicoproteine ​​cellulari, eliminando in tal modo i recettori di attacco dalla superficie cellulare. Sodio azide (SA) è un inibitore del metabolismo potenti e quindi blocchi endocitosi 13. Cellule trattate con sodio azide dovrebbero essere positivi per il legame virus, ma negativo per l'internalizzazione.

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Protocollo

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Nota prima dell'inizio: cappa a flusso laminare e Uso appropriato biocontenimento quando si lavora con virus vivo. Qui, descriviamo le condizioni di crescita idonee a ceppo di virus influenzale cultura A / WSN / 33. Molteplicità di infezione (MOI) e di incubazione possono variare a seconda ceppo virale usato.

1. Preparazione di A biotinilato / WSN / 33 Virus

  1. Seed Madin-Darby kindey canino (MDCK), le cellule in un pallone T175 cm 2 utilizzando Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% FBS e 1% di penicillina-streptomicina (Pen / Strep). Cellule di coltura a 37 ° C fino a circa il 70% di confluenza viene raggiunto.
  2. Prima infezione, rimuovere medie e lavare le cellule con tampone fosfato salino (PBS, pH7.0-7.3) aggiungendo un volume sufficiente a coprire il monostrato cellulare.
  3. Rimuovere PBS e infettare le cellule con A / WSN / 33 con un MOI di 10 -4. Diluire virus in PBS completati con 0,02 mg Mg 2 +, 0,01 mg di Ca 2+ </ sup>, lo 0,3% di albumina sierica bovina (BSA), e 1% Pen / Strep (infezione-PBS). Utilizzare un inoculo di 4 ml per una fiasca T175 cm 2.
  4. Incubare le cellule 1 ora a 37 ° C. Rimuovere inoculo per aspirazione e pipette 10 ml di DMEM integrato con 0,3% di BSA, 20 HEPES mM, e 1% Pen / Strep nel pallone.
  5. Incubare le cellule a 37 ° C per circa 3 giorni fino effetto citopatico (CPE) è visibile, e quindi raccolto surnatante. CPE può essere riconosciuto come arrotondamento delle cellule seguono distacco e morte delle cellule 14.
  6. Spin surnatante a 450 xg per 5 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo falco e ripetere questo passaggio ancora una volta. Eliminare il pellet.
  7. Trasferire supernatanti in provette ultracentrifuga e supernatanti sottopavimenti con 5 ml di saccarosio 30% diluiti in tampone NTE (Tris 10 mM [pH 7,4], NaCl 100 mM, EDTA 1 mM). Equilibrio tubi prima ultracentrifugazione e riempire con PBS per raggiungere un volume fine di 30 ml. Spin Supernaabi- a 112.398 xg (corrispondente a 25.000 rpm per rotore SW28) per 90 min in un'ultracentrifuga.
  8. Rimuovere con attenzione il surnatante pipettando e immergere pellet virus notte a 4 ° C in 250 l di PBS. Pellet Risospendere pipettando su e giù. Misurare il contenuto di proteine ​​del virus purificato dalla Bradford test 15.
  9. Utilizzare un kit biotinilazione per generare biotinilato A / WSN / 33. Seguire le istruzioni del produttore.
  10. In breve, aggiungere la giusta quantità di biotina al virus purificato e incubare per 2 ore su ghiaccio. Trasferimento virus di un tubo ultracentrifuga e riempire il tubo con PBS per raggiungere un volume fine di 30 ml. Spin virus a 112.389 xg per 90 min in un'ultracentrifuga. Rimuovere il surnatante pipettando e aggiungere 250 microlitri di PBS. Immergere pellet per tutta la notte a 4 ° C. Aliquotare e conservare il virus biotinilato conservato a -80 ° C in cui sarà stabile per almeno 24 mesi.
    NOTA: Potrebbe essere utile per determinare il titolo del p biotinilatoriparazione di IAV mediante test placca standard. Tuttavia, va notato che il protocollo successiva solo misurare particelle virali biotinilati. Rimanendo particelle unbiotinylated causa biotinylation incompleta contribuirà al titolo infettivo mediante saggio di placca ma non al segnale misurato nel test allegato / internalizzazione.

2. Determinare la quantità necessaria di Biotinylated Virus

NOTA: Prima di eseguire il test di attacco / internalizzazione, è importante determinare la quantità di virus biotinilato necessaria per infettare tutte le cellule di un campione.

  1. Cultura e cellule A549 trypsinize secondo le istruzioni del produttore. Contare le cellule utilizzando una camera di cella. Pipette cellule 200.000 A549 in FACS Deepwell tubi. Spin 3 min a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet con 200 microlitri di PBS. Cellule raffreddare in ghiaccio per 10 minuti.
  2. Preparare 5-fold diluizioni seriali del biotinylated magazzino virus infezione-PBS.
  3. Tubi Spin contenenti le cellule a 4 ° C per 3 min a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet con 100 microlitri virus contenenti infezioni PBS. Come utilizzare il controllo finto infezione PBS senza virus biotinilato. Incubare le provette in ghiaccio per 1 ora.
  4. Tubi Spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 200 l di PBS. Ripetere questo passaggio ancora una volta.
  5. Per il fissaggio, tubi di spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 100 ml di 3,7% paraformaldeide (PFA). Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, ripetere il lavaggio passo descritto in 2.4).
  6. Per permeabilizzazione, tubi di spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 100 l di PBS contenente 0,5% Triton X-100. Incubare per 6 minuti a temperatura ambiente. Quindi, ripetere il lavaggio passo descritto in 2.4).
  7. Tubi Spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 50 microlitri 2% BSA in PBS diluito contenente STV-Cy3. (Si prega di notare, la concentrazione appropriata di STV-Cy3 deve essere determinato prima di iniziare l'esperimento Inizia con una concentrazione di 1:. 200 e il test diluizioni 2-fold fino a 1:. 2400 Nelle nostre mani, una diluizione di 1: 1.000 dimostrato essere ottimale.)
  8. Incubare 1 ora al buio a temperatura ambiente. Quindi, ripetere il passaggio di lavaggio descritta in 2.4, ma risospendere il pellet in 200 ml 2% BSA diluito in PBS.
  9. Analizzare i campioni mediante citometria di flusso 16. Porta sulla popolazione Cy3-positivo. Scegliere la più bassa concentrazione di virus biotinilato da ottenere il numero massimo di celle Cy3-positivi nella popolazione A549.

3. Determinare la quantità necessaria di Streptavidina


NOTA: L'efficienza di bloccare il segnale derivato dal virus extracellulare determina il campo di rilevamento del test. Pertanto, è importante abrogare segnale STV-Cy3 il più possibile. The quantità richiesta di STV necessario dipende dalla quantità di biotinilato magazzino virus usato (determinata al punto 2).

  1. Seguire i passaggi 2.1-2.4, ma utilizzare concentrazione di virus determinate al punto 2.
  2. Preparare diluizioni seriali di cinque-fold di STV diluiti in PBS contenente 2% di BSA e lo 0,1% di sodio azide.
  3. Tubi Spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 50 microlitri di diluizione STV. Come utilizzare il controllo finto PBS contenente 2% di BSA e lo 0,1% di sodio azide senza STV. Incubare le provette per 30 min in ghiaccio. Quindi, ripetere il passaggio di lavaggio descritta in 2.4.
  4. Seguire i passaggi 2,5-2,9. Per il saggio internalizzazione, scegliere la più bassa concentrazione di STV conseguente forte blocco del Cy3 segnale (rispetto al campione in cui non era presente ATS). Per questo, può essere utilizzata la percentuale di cellule positive Cy3 o l'intensità di fluorescenza media del segnale Cy3. Idealmente, il segnale Cy3 di campioni STV trattati deve essere il più vicino possibile al segnale da mock-infettatecelle come possibile.

4. Allegato / Internalizzazione Assay


NOTA: Assicurarsi di preparare tutti i reagenti prima di iniziare il test. Per i tre gruppi di controllo presentati nella sezione risultati (cellule infettate finto, le cellule pre-trattate neuraminidasi e cellule sodioazide trattati) piccole modifiche al protocollo sono obbligatori.

  1. Preparare 16 provette contenenti deepwell ogni 200.000 cellule A549. Accanto al gruppo sperimentale composto da 4 tubi, ci sono 3 condizioni di controllo, ciascuno dei quali occorrono 4 tubi: cellule mock-infettate, neuraminidasi (NA), le cellule -pretreated e le cellule trattate azide di sodio. Ogni gruppo è composto da 4 tubi etichettati come '0 min', '0 min + STV', '30 minuti ', '30 minuti + STV'.
  2. Tubi Spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 200 l di PBS.
  3. Tubi Spin a 4 ° C a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 200 microlitri DMEM contenente 0,3% di BSA, 20 mM HEPES e 1% di penicillina-streptomicina (mezzo di incubazione). Incubare per 30 minuti a 37 ° C.
    NOTA: Per il controllo neuraminidasi: Utilizzo neuraminidasi batterica (es sialidasi da Vibrio colera) ad una concentrazione di 200 mU / ml diluito in mezzo di incubazione per risospendere le cellule.
  4. Tubi Spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 200 l di PBS. Ripetere questo passaggio ancora una volta, poi i tubi raffreddare in ghiaccio per 10 minuti.
  5. Tubi Spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 100 ml biotinilati virus (utilizzare la concentrazione di virus determinata al punto 2 diluito in infezioni-PBS). Incubare 1 ora su ghiaccio. Quindi, ripetere il passaggio di lavaggio descritta in 2.4.
    NOTA: Per il controllo mock-infettate: Usa infezione-PBS, senza virus. Per il controllo sodio azide: Usa virus diluito in infezioni PBS integrato con 0,1% di sodio azide.
  6. Professionistaelaborazione dei campioni dopo l'infezione su ghiaccio:
    1. Per i campioni "0 min", seguire passo 2.5 e conservare i campioni a 4 ° C fino a quando sono stati fissati gli altri campioni.
    2. Per il '0 min + STV' campioni, tubi di spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 50 microlitri STV (utilizzare la concentrazione determinata al punto 3) diluito in PBS contenente 2% di BSA e lo 0,1% di sodio azide (per evitare interiorizzazione durante la manipolazione del campione). Incubare 30 min in ghiaccio. Seguire passo 2.4-2.5 e conservare i campioni a 4 ° C.
    3. Per i campioni '30 min ', tubi di spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 200 l di PBS contenente 2% di BSA. Incubare 30 minuti a 37 ° C. Seguire passo 2.4-2.5 e conservare i campioni a 4 ° C.
      NOTA: Per il controllo sodio azide: Utilizzo PBS integrato con il 2% di BSA e 0,1% di sodio azide per 30 min di incubazione a 37 ° C.
    4. Per il '30 min + campioni STV 'girano provette a 4 ° C per 3 min a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 200 l di PBS contenente 2% di BSA. Incubare 30 minuti a 37 ° C. Poi, tubi di spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 50 microlitri STV (utilizzare la concentrazione determinata al punto 3) diluito in PBS contenente 2% di BSA e lo 0,1% di sodio azide (per evitare interiorizzazione durante la manipolazione del campione). Incubare 30 min in ghiaccio. Seguire passo 2.4-2.5 e conservare i campioni a 4 ° C.
      NOTA: Per il controllo sodio azide: Utilizzo PBS integrato con il 2% di BSA e 0,1% di sodio azide per 30 min di incubazione a 37 ° C.
  7. Seguire i passaggi 2,6-2,8 e analizzare campioni mediante citometria a flusso. Determinare la percentuale di cellule positive Cy3-in ciascun campione.
  8. Calcolare la percentuale allegato virus e la quantità relativa di virus interiorizzato.
    1. Per calcolare la quantità di virus in allegato, utilizzare la percentuale di Cy3-positive cellule gated o l'intensità di fluorescenza media del segnale Cy3. Per confronto, impostare cellule non trattate al 100% (Figura 4B).
      NOTA: La percentuale di virus si è descritto dal campione "0 min".
    2. Per calcolare la quantità di virus internalizzato, prendere il rapporto tra il "30 min + STV" campione al "30 min" campione (Figura 5B).
      NOTA: Come menzionato sopra, la percentuale di cellule positive Cy3 gated o l'intensità di fluorescenza media del segnale Cy3 può essere utilizzato.

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Risultati

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Un cartone descrive le quattro diverse condizioni sperimentali è mostrato in Figura 1 I risultati di un esperimento rappresentativo sono presentati nelle Figure 2 -. 5. Nel campione "0 min", virus biotinilato è freddo legato alle cellule, che possono essere visualizzati da STV-Cy3 colorazione bersaglio (figure 1 e 2). Quando viene applicato un passo di blocco (in "0 min + STV" campione), virus sulla superficie cellulare...

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Discussione

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Il nostro protocollo descrive un modo semplice per misurare l'attaccamento virus e internalizzazione mediante citometria a flusso. Esso consente l'utilizzo di virus di tipo selvatico marcato che imita più da vicino le infezioni da virus rispetto all'uso di particelle simili a virus (VLP). Mentre il nostro protocollo è stato ottimizzato per misurare attaccamento e internalizzazione di IAV può essere facilmente adattato per altri virus. Inoltre, come la citometria a flusso è utilizzato per la lettura, co-color...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del Fondo nazionale svizzero (31003A_135278) per SST. MOP è il beneficiario di una borsa di dottorato di ricerca del Fondo AXA. Ringraziamo Patricia Nigg aiuto per la progettazione di figura 1.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEMLife Technologies41966-052
FBSLife Technologies10270-106
Penicillina-streptomicinaLife Technologies15140-163
PBSLife Technologies14190-169   
BSAVWR Calbiochem126579
HEPESLife Technologies15630-100
D-saccarosioFluka84100
TRISBiosolve BV20092391
EDTASigma-Aldrich3680
EZ-LINK NHS-SS-BIOTINA kitFisher ScientificW9971E 
Bio Rad Protein Bio AssayBio Rad500-0006
provette a pozzetto profondo (microprovette da 1,2 ml)Milian82 00 001
PFA  Lucerna chimica Scienze della microscopia elettronica15710
provette per ultracentrifugaHemotec HmbH253070
Triton X-100Fluka93420
STV-Cy3Life Technologies43-4315
STVLife Technologies43-4302
azoturo di sodioFluka71290
neuraminidasi batterica / sialidaseSigma-AldrichN6514-1UN

Riferimenti

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