Trasporto di membrana processi analizzati da un altamente parallelo sistema Nanopore Chip a risoluzione della proteina singolo

Summary

Il protocollo presentato descrive l'analisi del trasporto mediato da proteine di membrana a livello di singolo trasportatore utilizzando doppi strati lipidici privi di solventi che attraversano i pori. Ciò si ottiene grazie alla creazione di chip array di nanopori prodotti in serie, combinati con l'acquisizione e l'analisi dei dati altamente parallele, consentendo la futura creazione di screening degli effettori delle proteine di membrana.

Abstract

trasporto proteina di membrana a livello della proteina singolo elude ancora un'analisi dettagliata, se il substrato traslocato non è elettrogenico. Notevoli sforzi sono stati fatti in questo campo, ma le tecniche che permettono automatizzato di analisi trasporto ad alta produttività in combinazione con lipidi tecniche di doppio strato privi di solventi necessari per l'analisi dei trasportatori di membrana sono rari. Questa classe di trasportatori, tuttavia, è cruciale nella omeostasi cellulare e quindi un obiettivo chiave nello sviluppo di farmaci e metodologie per acquisire nuove conoscenze disperatamente bisogno.

Il manoscritto qui presentato descrive la creazione e la gestione di un romanzo biochip per l'analisi di proteine ​​mediata processi di trasporto di membrana con risoluzione singolo trasportatore. Il biochip è composto da microcavità racchiuse da nanopori che è altamente parallelo nel suo design e possono essere prodotti in grado industriale e quantità. liposomi Protein-nutrirebbero possono essere direttamente applicati aila superficie del chip che formano doppi strati lipidici poro-spanning auto-assemblate utilizzando SSM-tecniche (solido supportato membrane lipidiche). Pore-attraversa parti della membrana sono indipendenti, fornendo l'interfaccia per substrato traslocazione dentro o fuori lo spazio della cavità, che può essere seguita da lettura fluorescente multispettrale in tempo reale. La definizione di procedure operative standard (SOP) permette la creazione diretta di doppi strati lipidici proteine ​​ospitare sulla superficie del chip di proteine ​​virtualmente ogni membrana che può essere ricostituito in modo funzionale. L'unico requisito è la creazione di un sistema di read-out fluorescente per substrati di trasporto non elettrogeniche.

applicazioni ad alto contenuto di screening sono attuabile mediante l'uso di microscopi a fluorescenza automatizzati invertiti registrazione chip multipli in parallelo. Grandi insiemi di dati possono essere analizzati utilizzando il software di analisi custom-designed liberamente disponibile. Tre colori multi spettrale fluorescenteread-out, inoltre, consente una discriminazione dati imparziale in diverse classi di eventi, eliminando falsi risultati positivi.

La tecnologia dei chip si basa attualmente su SiO ₂ superfici, ma un'ulteriore funzionalizzazione con superfici di chip d'oro rivestite è inoltre possibile.

Introduction

L'analisi delle proteine ​​di membrana è diventato di crescente interesse per la ricerca di base e farmaceutica negli ultimi 20 anni. Lo sviluppo di nuovi farmaci dipende identificazione e caratterizzazione dettagliata di nuovi bersagli, attualmente essendo uno dei fattori limitanti. Il fatto che circa il 60% di tutti i bersagli farmacologici sono proteine ​​di membrana ^1, rende lo sviluppo di tecniche per chiarire la loro funzione più importante.

In passato, le tecniche per lo studio dei canali elettrogeniche e trasportatori sono stati sviluppati in moltitudine ^{di 2 - 4.}

Protocol

1. preparazione di grandi unilamellari vescicole (luvs)

1. Pulire un pallone a fondo tondo (volume 10 ml) con azoto per rimuovere eventuali particelle di polvere. Risciacquare il pallone a fondo tondo con etanolo.
   Nota: etanolo residuo può essere tollerata e non disturba fasi successive.
2. Lavare a 1 ml 4x siringa di vetro con cloroformio, per eliminare ogni contaminazione. Aggiungere 4 ml SoyPC20 (25 mg / ml in cloroformio) per il pallone a fondo tondo e drogare la soluzione lipidica con un ulteriore ^ATTO DOPE ³⁹⁰ ad una concentrazione finale di 0,1 moli%.
   Nota: Invece di DOPE ^{ATTO 390} altri l....

Results

membrane Pore-spanning possono essere facilmente creati sulla superficie del chip nanostrutturata in maniera auto-assemblati. Tuttavia il processo di fondo è ancora delicata e influenzato da molti parametri come la dimensione dei liposomi, monodispersity della popolazione liposomi, lamellarity, lipid- e le proprietà del sale di concentramento e di superficie chimica. La maggior parte di questi parametri sono stati accuratamente caratterizzato e standardizzato nel protocollo di cui sopra........

Discussion

La tecnica qui presentata permette un'analisi altamente parallela di trasporto delle proteine ​​di membrana. sistemi proteici di membrana ricostituiti possono essere direttamente applicati al biochip, rendendo l'adattamento teoricamente ogni trasportatore di membrana o canale possibile. Analisi dei trasporti è limitata solo dalla creazione di un sistema di read-out a fluorescenza, sia attraverso il passaggio diretto di fluorescenza (traslocazione di fluorofori o substrati fluorescente) o il cambiamento di fluore.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente
[2-(Trimetilammonio)etil] metanethiosolfonato	Toronto Research Chemicals Inc.	T792900	MTSET; idrolizzato dall'acqua. Conservare come aliquota di pouder secca a -80 °C. Utilizzare immediatamente (30 minuti) dopo la solubilizzazione in tampone.
Siringa a tenuta di gas da 1 ml	Hamilton	#1001
Fiaschetta rotonda da 10 ml	Schott Duran
Perline di vetro da 2,7 mm	Roth	N032.1
2-Propanole	Roth	9866.5
Tubo di prolunga Luer-Lock da 30 cm	Sarstedt	744304
Acetone	Roth	5025.5
Bio-Beads SM-2 L'adsorbente	Bio-Rad	152-3920	deve essere attivato prima del primo utilizzo
CaCl2 Dihydrat	Roth	HN04.3
Calcein	Sigma	C0875	conservare scuro a -20 ° C
Cloroformio grado reagente	VWR Chemicals	22711324
DOPEATTO390	ATTO-TEC	AD 390-165	conservare al buio a -20 ° C
Etanolo assoluto	Sigma-Aldrich	32205
Injekt Siringa monouso	Braun	460 60 51V
Injekt-F siringa monouso	Braun	91 66 017V
Keck clips	Schott	KC29
L-&alfa;-Fosfatidilcolina, 20% (Soia)Avanti	Polar Lipids	5416016	conservare sotto gas inerte a -20 ° C
NaCl 99,5% annuo	Roth	3957.2
Nanopore E100 wafer/chips	Micromotive (Magonza/Germania)		disponibile su richiesta
Membrana Nucleopore Track-Etch 0,4 &; m	Whatman	800282
Oregon Green Dextran 488 (70 kDa)	life Technologies	D-7173	negozio scuro a -20 ° C
Oy647	Luminartis (Mü nster/Germania)	OY-647-T-1mg	conservare scuro a -20 ° C
Rotilabo-siringa filtrante, non sterile, poro 0,22 & micro; m	Roth	P 818.1
Sephadex G-50	Sigma-Aldrich	G5080	materiale per colonna per cromatografia ad esclusione dimensionale
Silastic MDX4-4210	Dow Corning		agente indurente per il fissaggio dei chip sul supporto in vetro del coperchio
sticky-Slide	ibidi	80828	per il montaggio su vetrini (portachip)
Rubinetto a tre vie blu	Sarstedt	744410001
Tris Pufferan 99,9% Ultra Qualità	Roth	5429.2
Triton-X 100	Roth	6683.1
Whatman 0,2 & micro; m filtro a membrana in nitrato di cellulosa	Roth	NH69.1
Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Equipment
Bü chi 461 bagnomaria	Bü chi
Bü chi Rotavapor RE 111	Bü Spettrometro a
Cary Eclipse	Varian
LiposoFast Mini estrusore	Pompa
	Vaccubrand	15430
Nanosight Microscopio per tracciamento di nanoparticelle	Malvern / Nanosight	LM 14C
Microscopio NyONE	Synentec		disponibile su richiesta
Controllo pompa	Vaccubrand	CVC 2II
Bagno sonicatore Sonorex RK100H	Brandelin 31200001107477
Pompa per vuoto RC5	Vaccubrand	1805400204
Bagnomaria W13	Haake	002-9910
Pulitore al plasma PDC-37G	Harrick Plasma	PDC-37G
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Software
ImageJ	open source	l'elaborazione di immagini	scientifiche
http://imagej.nih.gov/ij/ NanoCalcFX	Freeware	http://sourceforge.net/projects/nanocalc/ di	analisi/valutazione dei dati per set di dati cinetici di trasporto di grandi dimensioni Software
analitico NTA 2.3 Software analitico	Nanosight		per il tracciamento delle nanoparticelle microscopio
NTA 2.3 Temperature Comms Software di controllo della	Nanosight		per microscopio a tracciamento di nanoparticelle