Efficiente protocollo Isolamento da B e T linfociti umani da Palatine Tonsille

Sommario

Le tonsille palatine sono una ricca fonte di linfociti B e T. Qui forniamo un protocollo facile, efficiente e rapido per isolare i linfociti B e T dalle tonsille palatine umane. Il metodo descritto è stato specificamente adattato per gli studi sull'eziologia virale dell'infiammazione delle tonsille nota come tonsillite.

Abstract

Le tonsille formano una parte del sistema immunitario che fornisce la prima linea di difesa contro gli agenti patogeni inalati. Solitamente il termine "tonsille" si riferisce alle tonsille palatine situate alle pareti laterali della parte orale della faringe. Le tonsille palatine rimosse chirurgicamente forniscono una comoda fonte accessibile di linfociti B e T per studiare l'interazione tra agenti patogeni estranei e il sistema immunitario dell'ospite. Questo protocollo video descrive la dissezione e l'elaborazione delle tonsille palatine umane rimosse chirurgicamente, seguite dall'isolamento delle singole popolazioni di cellule B e T dallo stesso campione di tessuto. Presentiamo un metodo che separa in modo efficiente i linfociti tonsillari B e T utilizzando un protocollo di affinità anticorpo-dipendente. Inoltre, utilizziamo il metodo per dimostrare che l'adenovirus umano infetta specificamente la frazione di cellule T tonsillari. Il protocollo stabilito è generalmente applicabile per isolare in modo efficiente e rapido le popolazioni di cellule B e T tonsillari per studiare il ruolo di diversi tipi di patogeni nelle risposte immunitarie tonsillari.

Introduzione

Le tonsille sono raccolte di tessuti linfoidi incapsulati in modo incompleto che si trovano sotto e a contatto con l'epitelio nel tratto aero-digestivo superiore. Solitamente il termine "tonsille" si riferisce alle tonsille palatine situate alle pareti laterali della parte orale della faringe. Le tonsille palatine accoppiate insieme alla tonsilla nasofaringea (adenoide), alle tonsille tubariche appaiate e alle tonsille linguali costituiscono il cosiddetto "anello di Waldeyer". Quest'ultimo è responsabile del contatto iniziale tra gli agenti patogeni inalati o ingeriti e i tessuti linfoidi del tratto aerodigestivo^1,2. Infatti, numerosi studi hanno dimostrato che sia gli antigeni batterici che quelli virali possono essere rilevati nei campioni di tessuto delle tonsille palatino^2-6.

Le tonsille palatine sono composte da un denso tessuto linfoide ricoperto da un epitelio stratificato squamoso non cheratinizzante. Le tonsille presentano numerose cripte, invaginazioni epiteliali, che penetrano nel parenchima aumentandone la superficie. Istologicamente, le tonsille palatine contengono numerosi follicoli linfoidi con centri germinali, che sono i siti di maturazione e differenziazione delle cellule B (aree delle cellule B). Allo stesso modo, le tonsille palatine inglobano le cellule T, che si trovano principalmente nelle regioni extrafollicolari (aree delle cellule T). Oltre alle cellule B e T, anche varie cellule dendritiche follicolari possono essere rilevate nelle tonsille palatine^1,2.

Grazie alla loro posizione anatomica, le tonsille palatine sono facilmente accessibili con interventi chirurgici. Ad esempio, la rimozione chirurgica delle tonsille, nota come tonsillectomia, viene eseguita di routine in tutto il mondo⁷. Nei bambini con iperplasia tonsillare, a volte viene utilizzata una rimozione chirurgica parziale delle tonsille (tonsillotomia), causando meno dolore postoperatorio ai pazienti. Considerando l'accumulo di vari agenti patogeni nelle tonsille, le tonsille rimosse chirurgicamente offrono un'opportunità unica per studiare l'influenza di agenti virali e batterici sulle funzioni dei linfociti tonsillari^2,8. Inoltre, è possibile studiare se alcuni patogeni preferiscono risiedere in specifiche sottopopolazioni cellulari⁹. Inoltre, poiché le tonsille sono una ricca fonte di linfociti B, i linfociti B tonsillari isolati possono essere utilizzati in modo efficiente per studiare l'attività di diverse sottopopolazioni di cellule B¹⁰. Tuttavia, poiché le tonsille palatine contengono una miscela di tipi di cellule, è necessario un metodo efficiente per separare le diverse sottopopolazioni cellulari.

Qui, descriviamo un metodo semplice per isolare in modo efficiente e rapido le popolazioni di cellule B e T tonsillari dalle tonsille palatine umane utilizzando una tecnica di separazione cellulare attivata magneticamente (Figura 1). Il metodo qui descritto è utile per gli scienziati che vogliono valutare il ruolo di diversi agenti infettivi negli organi linfoidi umani come le tonsille palatine.

Protocollo

Il protocollo descrive l'isolamento di cellule linfoidi dal materiale umano paziente e richiede quindi l'approvazione etica. Il lavoro svolto in questo studio è stata concessa dalla Uppsala Ethical Review Board (DNR. 2013/387).

1. Isolamento di cellule mononucleate (MNC) da umani Palatine Tonsille

ATTENZIONE: Tutto il materiale non schermati di origine umana come sangue, tessuti o fluidi corporei dovrebbe essere considerato come materiale potenzialmente infetto. Pertanto, pratiche di biosicurezza consigliate per la manipolazione dei tessuti umani devono essere seguite.

Nota: Per evitare contaminazioni, tutte le soluzioni e le attrezzature colture cellulari devono essere sterili. Tutti i tamponi e le soluzioni devono essere pre-raffreddati e tenuti in ghiaccio. Tessuti di tonsille e cellule isolate dovrebbero essere tenuti e gestiti su ghiaccio.

1. Ottenere tonsille fresche da pazienti sottoposti a tonsillectomia o tonsillotomia (Figura 2). Tuffatevi la Clum tessutips in un tubo da centrifuga da 50 ml contenente una soluzione sterile Hanks equilibrata sale ghiacciata (HBSS) supplementato con siero fetale bovino al 5% (FBS), glutammina 10 mM, 0,05 mg / ml di gentamicina e 1% mix antibiotici contro funghi (Penicillina, streptomicina e amfotericina B).
2. Tenere le provette con i campioni di tessuto tonsille sommersi in ogni momento sul ghiaccio. Provare per elaborare le tonsille nel più breve tempo possibile, e comunque entro 3 ore dopo la rimozione chirurgica.
3. Posizionare la tonsilla su una cella di plastica piastra di coltura 60 millimetri su ghiaccio e mantenere il tessuto inumidito con HBSS. Rimuovere coaguli di sangue visibili, adiposo e tessuto connettivo con una pinza pulita dalla superficie tonsille.
4. Utilizzare una nuova piastra di coltura cellulare 60 millimetri contenente 5 ml di HBSS. Tagliare il ciuffo tessuto tonsillare in 3-10 frammenti mm utilizzando un paio di forbici sterili e / o un bisturi.
5. Preparare una nuova piastra di coltura cellulare 60 mm contenente 10 ml di HBSS e posizionare un colino plastica cella 100 micron nella soluzione HBSS.
6. Trasferire i dissframmenti tonsillari rifletteva nel colino cella con una pinza sterile. Usando l'estremità stantuffo di una siringa di plastica, uniformemente spremere i frammenti di tessuto attraverso il filtro cella. Assicurarsi che i frammenti tonsillari sono totalmente immersi nel HBSS.
7. Eliminare il filtro cella con i resti di tessuto e trasferire la sospensione cellulare risultante dalla piastra di coltura cellulare 60 mm in un tubo di plastica da 50 ml centrifuga. Lasciare la provetta in ghiaccio mentre si procede con passo 1.8 e 1.9.
8. Nel caso di grandi tonsille, più grande di 2 cm (Figura 2), spremere i frammenti tonsille in due filtri cellulari per evitare l'intasamento della rete nel filtro.
9. Ottenere il volume finale di 35 ml di sospensione cellulare.
   Nota: A questo punto è possibile preparare la sospensione di cellule per la crioconservazione (vedere la sezione 2).
10. Aggiungere 10 ml di soluzione di gradiente di densità Ficoll come in una nuova provetta da centrifuga da 50 ml. Sovrapporre delicatamente i suspens cellulariion (passo 1.9) sulla parte superiore della soluzione gradiente di densità. Evitare la miscelazione della sospensione cellulare e la soluzione gradiente di densità.
    Nota: La soluzione di gradiente di densità deve essere riscaldato a temperatura ambiente.
11. Centrifugare la sospensione cellulare in un rotore incernierato a 700 xg per 20 minuti a RT. Non attivare la funzione di freno alla centrifuga come frenata veloce può interrompere il gradiente. Inoltre, utilizzare la funzione di accelerazione più basso sul centrifuga.
    Nota: Dopo questo passo centrifugazione, osservare multinazionali come uno strato bianco soffice all'interfaccia, e globuli rossi (RBC), fibroblasti e detriti cellulari come il sedimento sul fondo della provetta.
12. Raccogliere accuratamente lo strato multinazionali utilizzando una pipetta da 10 ml. Posizionare la sospensione cellulare in una nuova provetta da centrifuga da 50 ml.
13. Aggiungere 25 ml di PBS ghiacciato alla sospensione cellulare e girare il tubo a 300 xg per 5 minuti in un rotore incernierato a 4 ° C.
14. Rimuovere il surnatante con una pipetta 25 mle ripetere pellet cellulare lavaggio passo altre due volte. Infine risospendere il pellet cellulare in 15 ml di PBS.
    Nota: Dopo la fase di lavaggio finale, è possibile crioconservare la sospensione cellulare (vedi capitolo 2).
15. Applicare 10 ml di sospensione cellulare in camera di conteggio delle cellule emocitometro e contare il numero di cellule al microscopio. Distribuire la quantità appropriata di cellule (ad esempio, 2-3 x 10 ⁷⁾ in una provetta da 15 ml per centrifuga successiva separazione magnetica tallone. Tenere questo aliquota in ghiaccio fino al punto 3.2.

2. La crioconservazione delle cellule tonsillare

1. Preparare medio di congelamento (90% FBS e il 10% DMSO) e tenerlo in ghiaccio. Per la conservazione a lungo termine mantenere i mezzi di comunicazione di congelamento a -20 ° C.
2. Determinare il numero totale di cellule utilizzando una camera di conteggio cellulare emocitometro (passo 1.15). Calcolare la quantità di terreno necessaria congelamento secondo la densità cellulare congelato desiderata (ad esempio, 10 ⁷ cellules / ml di media di congelamento).
3. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 xg per 5 min. Decantare il surnatante senza disturbare il pellet e risospendere il pellet cellulare in mezzo congelamento ghiacciato (dal punto 2.1).
4. Dispensare 1 ml aliquote della sospensione cellulare in fiale sterili progettati per lo stoccaggio a lungo termine in azoto liquido. Congelare le fiale in una camera isopropanolo e conservarli a -80 ° CO / N. Per la conservazione a lungo termine trasferire le fiale in azoto liquido contenente serbatoio o di una cella freezer -140 ° C.
5. Per scongelare fiale con cellule congelate, li riscaldare rapidamente in un bagno d'acqua a 37 ° C. Immediatamente quando scongelato, disperdere la sospensione cellulare in 10 ml di pre-riscaldato HBSS (con supplementi, punto 1.1) in una provetta da centrifuga da 15 ml. Spin il tubo a 300 xg per 5 min, rimuovere HBSS e risospendere il pellet cellulare alla densità cellulare desiderato in HBSS (con supplementi, punto 1.1).
   Nota: La vitalità della multinazionali after scongelamento è di importanza, in quanto la presenza di cellule morte diminuisce la resa finale purificata B e T linfociti.
   Nota: Secondo la nostra esperienza la vitalità cellulare meno 80% ridurrà l'efficienza isolamento delle cellule.

3. selezione positiva di T linfociti Popolazione da tonsillare multinazionali

Nota 1: Questo protocollo si basa sulla selezione positiva di umani linfociti ^T CD3 + da multinazionali tonsillari utilizzando sfere magnetiche accoppiate per l'anticorpo CD3. E 'possibile iniziare questa sezione dal fresco (sezione 1) o congelati (sezione 2) multinazionali.

Nota 2: Iniziare con 3 x 10 ⁷ multinazionali. Non superare questo numero di cellulare, dal momento che le colonne di separazione possono intasare e questo ridurrà l'efficienza di isolamento. Utilizzare le colonne più grandi se verranno trattati più celle. I volumi utilizzati in questo protocollo sono state sperimentalmente ottimizzati per il numero di cellule uscato nel nostro setup sperimentale.

1. Preparare il tampone di separazione [PBS (pH 7,2), lo 0,5% di albumina sierica bovina (BSA) e 2 mM EDTA]. Filtrare il tampone di separazione attraverso un filtro da 0,45 micron e conservare a 4 ° C.
2. Spin sospensione PTM (passo 1.14) a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Risospendere il pellet risultante cellule in 240 microlitri (80 microlitri per 10 ⁷ cellule) di tampone di separazione ghiacciato. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da 2 ml.
3. Aggiungere 20 ml di anticorpo CD3 magnetica alla soluzione cellulare. Incubare le provette per 1 ora a 4 ° C con continua miscelazione delicata per mantenere le cellule in sospensione.
4. Trasferire tutto di sospensione cellulare in una provetta da 15 ml contenente 5 ml di tampone di separazione ghiacciata per lavare le cellule.
5. Centrifugare la provetta a 300 xg per 10 min a 4 ° C in un rotore incernierato.
6. Nel frattempo, impostare il separatore magnetico e di colonna. Fissare il separatore magnetico per il supporto e posizionare la colonna nel SEPARator. Lavare la colonna applicando 500 ml di buffer di separazione ghiacciato. Gettare il flusso attraverso.
7. Inserire un nuovo tubo di raccolta 15 ml sotto la colonna. Tenere il tubo di raccolta sul ghiaccio.
8. Eliminare il surnatante (passo 3,5) di pipetta e risospendere delicatamente il pellet cellulare in 500 microlitri tampone di separazione. Applicare la sospensione cellulare sulla sommità della colonna pre-lavata e farlo funzionare attraverso.
   Nota: grumi di cellule possono ostruire la colonna e ridurre la portata così. Per evitare questo problema, inserire un filtro cella 40 micron plastica sulla parte superiore della colonna. Passando le cellule attraverso la maglia sarà altamente migliorare l'efficienza di questo metodo.
9. Lavare la colonna 4 volte con 1,5 ml di tampone di separazione (500 microlitri per 10 ⁷ cellule). Attendere il serbatoio colonna vuota (nessun liquido dovrebbe essere osservato nella colonna) prima di applicare il lavaggio successivo passo.
   Nota: Ottenere le cellule CD3 non marcati, considerati come frazione di linfociti B, in quanto sonoeluito nel tubo di raccolta.
10. Rimuovere la colonna dal separatore e posto in un nuovo tubo di raccolta da 15 ml. Pipettare 2 ml di tampone di separazione nella colonna. Utilizzando il pistone in dotazione con la colonna eluire i linfociti T selezionati positivamente, che sono considerati come la frazione di linfociti T.
11. Determinare il numero di cellule purificate (passo 1.15) se necessario. Sospensioni cellulari sono ora pronti per esperimenti a valle.

4. Citometria a flusso Analisi dei isolata tonsillare linfociti B e T

ATTENZIONE: soluzione Paraformaldeide è irritante e sospetto cancerogeno. Indossare indumenti protettivi, guanti e proteggersi gli occhi / la faccia.

Nota 1: Questo protocollo descrive il metodo per la colorazione diretta del B isolata e le cellule T per fluorescenza cellulare Attivato Ordinamento (FACS) analisi. Lo scopo principale di questa fase è quello di valutare la purezza della cella isolata popolazioni after CD3 anticorpo separazione magnetica. A tal fine stabilito B e marcatori di cellule T, si utilizzano anticorpi monoclonali fluoroforo coniugato CD20-FITC e CD2-APC. Anche l'inserimento di anticorpi di controllo isotipo è altamente raccomandato per distinguere la non specifico "sfondo" legame di anticorpi CD2 e CD20 (vedi punto 4.8).

Nota 2: E 'possibile mantenere le frazioni cellulari purificate in paraformaldeide 1% di soluzione (PFA) al buio a 4 ° C fino al momento della colorazione (ad esempio, il giorno dopo.). Anche la stessa procedura è applicabile se esiste un intervallo di tempo tra la colorazione e l'analisi FACS. Ricorda che in entrambi i casi le cellule devono essere lavati correttamente con PBSA (PBS contenente 0,2% di BSA) tampone, prima della colorazione o l'analisi FACS.

1. Estrarre 6 x 10 ^{6 cellule} delle multinazionali dal punto 1.15 (prima di applicare alla colonna), frazione di linfociti B dal punto 3.9 e la frazione di linfociti T a partire dal punto 3.10.
2. Spin la cellasospensioni a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C con un rotore swing-out.
3. Rimuovere il surnatante con pipetta e lavare il pellet cellulare una volta con 1 ml di ghiacciata PBSA. Spin le sospensioni cellulari a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante con pipetta e risospendere il cellule in 600 ml di tampone PBSA ghiacciato.
4. Aggiungere 100 ml di sospensione cellulare al fondo di un tubo FACS.
5. Aggiungere 100 ml di PBS contenente il 10% di calore siero umano inattivato a ciascuna provetta, mescolare bene e incubare per ~ 1 minuti a temperatura ambiente oppure 20 minuti in ghiaccio.
   Nota: i linfociti B trasportano recettori Fc. Per bloccare il recettori Fc frazioni cellulari purificate sono incubati con 10% di siero umano inattivato al calore. Il siero umano inattivato al calore è da incubazione a 56 ° C per 1 ora. Dividete il calore siero inattivato in piccole aliquote e conservare congelati a -20 ° C.
6. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C in un swing-out rotore.
7. Rimuovere il surnatante con pipetta e lavare il pellet cellulare con 1 ml PBSA. Ripetere la centrifugazione (300 xg per 5 minuti a 4 ° C).
8. Aggiungere 100 microlitri PBSA in ciascun tubo in ghiaccio. Aggiungere la quantità appropriata di anticorpo monoclonale coniugato fluoroforo, secondo la raccomandazione del costruttore (ad esempio, 20 ml di anti-CD20 e / o 5 ml di anticorpi anti-CD2 in 100 ml di PBSA). Nota: Non dimenticare di assegnare provette di controllo sufficienti per l'analisi FACS. In questo protocollo dovrebbero essere inclusi i seguenti controlli: 1) cellule colorate con gli anticorpi anti-CD2 e anti-CD20 individualmente, 2) cellule colorate con gli anticorpi anti-CD2 e anti-CD20 controllo isotipico singolarmente e, 3) celle senza aggiunta di anticorpi.
9. Brevemente vortice la provetta e incubare per 30 min a 4 ° C al buio.
10. Lavare 2 volte con PBSA. Aggiungere 2 ml di soluzione all'1% PFA ai campioni. Lasciare le cellule rimangono nella soluzione PFA al 476; C al buio fino al momento dell'analisi FACS.
11. Immediatamente prima di eseguire i campioni nella macchina FACS, lavare le cellule 2 volte con PBSA (300 xg per 5 minuti a 4 ° C). Campioni risospendere in 1 ml di PBS e mantenere a 4 ° C (o su ghiaccio), protetto dalla luce, prima della separazione sul citometro a flusso.
12. Fare l'ordinamento FACS secondo il protocollo del citofluorimetro produttore.

5. PCR individuazione del DNA Adenovirus in isolati tonsillare linfociti B e T

Nota 1: Le adenovirus hexon primer gene sono AdRJC1 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 ') e AdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3') ^11. Questi primer generano un amplicone di 139 bp. Il padrone di casa gene 18S rRNA può essere rilevato con primer tp206 (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 ') e TP207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3'). La dimensione prevista amplicone è di 300 bp.

Nota 2: Ogni PCRcorsa comprende un controllo negativo (distillata H _{2 O)} e un controllo DNA positivo ottenuto da linea di cellule B umane (BJAB) infettate con il tipo di adenovirus umano 5 ^12.

1. Estrarre il DNA (da almeno 1 x ¹⁰ 6 cellule, passo 3.11) con membrana silicea metodo di purificazione basato su colonne. Estrarre RNA utilizzando fenolo e guanidina isotiocianato soluzione ^13.
2. Aggiungere 100 ng di DNA da linfociti B e T di una miscela di reazione contenente tampone 1x HF, 0,2 mM di mix trifosfato di deossinucleotide (dNTP), 0,25 mM di ciascun primer e 1 U di alta fedeltà polimerasi DNA in un volume totale di 20 microlitri.
3. Eseguire amplificazione PCR con le seguenti condizioni di ciclo: 30 sec di denaturazione a 98 ° C, seguita da 30 cicli di 98 ° C per 10 sec, 67 ° C (hexon) o 58 ° C (18S rRNA) per 30 sec e 72 ° C per 30 sec. La reazione di PCR è stata conclusa con un passo estensione finale di 7 min a 72 ° C.
4. Separare il conseguente amplif PCRprodotti icazione su un gel di agarosio 1,5% in TBE 1x tampone e visualizzare le bande previsti dalla colorazione con colorante acido nucleico.

Risultati

Una separazione efficace dei tonsillari MNC risultati in sottopopolazioni altamente purificate di linfociti B e T. Ciò è stato confermato mediante analisi FACS utilizzando anti-CD20 e anti-CD2 per rilevare B T linfociti popolazioni, rispettivamente (Figura 3A). Al contrario, una separazione efficiente di MNC risultati in frazioni cellulari che sono una miscela di cellule di entrambe le sottopopolazioni di linfociti B e T (Figura 3B).

Il linfociti T (...

Discussione

Uno dei fattori più importanti che influenzano il risultato di questo protocollo è l'uso di materiale fresco tonsillare come materiale di partenza. Pertanto, i campioni di tonsille devono essere trattati entro 3 ore dopo l'intervento chirurgico. Tonsille possono essere ottenuti da adulti e bambini. Il materiale tonsillare dai bambini è di solito più piccoli a causa della rimozione chirurgica parziale delle tonsille (tonsillotomy). Pertanto, il numero di multinazionali ottenuti da campioni tonsillotomia (1 x 10 <...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS)	Gibco	14175-053	Contiene il 5% di siero fetale bovino (FBS), 10 mM di glutammina, 0,05 mg/ml di gentamicina e 1% di miscela antibiotico-antimicotica
		di congelamento	90% FBS e 10% DMSO tampone
MACS			PBS (pH 7,2), 0,5% BSA e 2mM EDTA
PBSA			PBS contenente lo 0,2% di BSA
, PFA			PBS contenente l'1% di paraformaldeide (PFA). Prepara fresco. Il PFA è sospettato di essere cancerogeno. Indossare guanti e occhiali.
Miscela antibiotico-antimicotica	Gibco	15240-062
60 mm Petridish	Nunc	150326
Forbici da dissezione Fisher		Scientific 1381241
Forbici per iride diritte	Fisher Scientific	12912055
bisturi monouso	Swann-Morton	REF 0501
100 μ m filtro cellulare in plastica	Corning Life Sciences	352360
40 μ m filtri per celle in plastica	Corning Life Sciences	352340
Siringa in plastica da 2 ml	BD Biosciences
provette da centrifuga coniche da 15 ml	SARSTEDT	62554502
provette da centrifuga coniche da 50 ml	SARSTEDT	62547254
Centrifuga a bassa velocità con rotore ad angolo fisso o a secchiello oscillante	Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R
Ficoll– Hypaque	Sigma-Aldrich	F5415-50ML	Ficoll soluzione
Fetale di vitello Biological	industries	040071A
Dimetil solfossido (DMSO)	SIGMA	D2650-5X5ML MACS
MS colonne	Miltenyi Biotec	130-042-201
Microsfere CD3 umane MACS	Miltenyi Biotec	130-092-881
Separatore MACS (Octo MACS)	Miltenyi Biotec	130-042-109
Albumina sierica bovina (BSA)	Merck Millipore	1120180100
EDTA	AnalaR NORMAPUR	20302.293
CD2 coniugato alloficocianina ( CD2-APC)	BD Bioscienze
CD20 coniugato all'isotiocianato di fluoresceina (CD20-FITC)	BD Bioscienze
Siero umano	Rockland Immunochemicals	D119-0100
Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà	Thermo Scientific	F-530L
tubi FACS	BD Falcon	352003
Cryotube	SARSTEDT	72379
BD LSRII citometro	a flusso BD Biosciences
BD FACSDiva 4.1 software	BD Biosciences
Sangue Nucleospin	Macherey-Nagel	740951.50	Kit di isolamento del DNA
Reagente TRIzol	Tecnologie di vita	15596	Reagente di isolamento dell'RNA
Emocitometro	The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	0610030	dispositivo contacellule
GelRed	Biotium	41003	Colorazione su gel di acido nucleico