I materiali biomimetici per caratterizzare le interazioni batteri-ospite

Sommario

L'attaccamento batterico alle cellule ospiti è un passaggio fondamentale durante la colonizzazione e l'infezione dell'ospite. Questo protocollo descrive la generazione di adesine ricombinanti accoppiate a polimeri come materiali biomimetici che consentono l'analisi del contributo delle singole adesine a questi processi, indipendentemente da altri fattori batterici.

Abstract

L'attaccamento batterico alle cellule ospiti è uno dei primi eventi durante la colonizzazione batterica dei tessuti ospiti e quindi un passaggio chiave durante l'infezione. La caratterizzazione biochimica e funzionale delle adesine che mediano queste interazioni iniziali batterio-ospite è spesso compromessa dalla presenza di altri fattori batterici, come componenti della parete cellulare o molecole secrete, che interferiscono con l'analisi. Questo protocollo descrive la produzione e l'uso di materiali biomimetici, costituiti da adesine ricombinanti pure accoppiate chimicamente a perle di polistirene funzionalizzate disponibili in commercio, che sono state utilizzate con successo per sezionare le interazioni biochimiche e funzionali tra le singole adesine batteriche e i recettori delle cellule ospiti. Vengono inoltre discussi i protocolli per diverse chimiche di accoppiamento, che consentono l'immobilizzazione direzionale di adesine ricombinanti su scaffold polimerici e per la valutazione dell'efficienza di accoppiamento dei materiali "batteriomimetici" risultanti. Descriviamo ulteriormente come questi materiali possano essere utilizzati come strumento per inibire la citotossicità mediata da patogeni e discutiamo la portata, i limiti e le ulteriori applicazioni di questo approccio nello studio delle interazioni batterio-ospite.

Introduzione

Analizzare le interazioni tra le adesine batteriche e i recettori della superficie dell'ospite all'interfaccia ospite-patogeno è un passo essenziale verso la nostra comprensione dei meccanismi sottostanti che guidano l'adesione batterica. In definitiva, questo ci aiuterà a identificare le strategie per interferire con questi processi durante le infezioni. Nel condurre tali studi, ci troviamo spesso di fronte a un dilemma: l'analisi biochimica e biofisica dei meccanismi molecolari del legame dell'adesina richiede la loro separazione da altri componenti della parete cellulare, che possono interferire con gli eventi di adesione. D'altra parte, l'uso di proteine solubili ricombinanti semplifica eccessivamente l'evento di adesione, trascurando l'ancoraggio delle proteine nella parete cellulare batterica e la multivalenza del legame ottenuta attraverso la visualizzazione della superficie batterica. Allo stesso modo, dal punto di vista della cellula ospite, l'incontro e il legame con singole molecole di adesina non ha sempre lo stesso impatto in termini di organizzazione della membrana plasmatica, fluidità della membrana e clustering dei recettori¹ e questo, in ultima analisi, rende difficile valutare l'impatto dell'adesione sulla segnalazione cellulare dell'ospite e l'esito delle interazioni batteri-ospite.

Recentemente è stato ideato un metodo, in base al quale adesine purificate ricombinanti o frammenti di adesina sono accoppiati direzionalmente e covalentemente a particelle polimeriche di dimensioni simili ai batteri, imitando così l'esposizione superficiale batterica. Questo approccio è stato utilizzato su una gamma di adesine diverse, dalle molecole di adesione multivalente Gram-negative (^{MAMs)2, 3}, alle adesine Gram-positive, tra cui la proteina legante la fibronectina (FnBPA)^{4, 5} e Streptococcus pyogenes F1 ^{6, 7}. Questo metodo ha permesso la dissezione di frammenti di adesina importanti per il legame della cellula ospite, l'identificazione dei recettori della superficie ospite e la determinazione del loro comportamento sulla superficie della cellula ospite, prendendo in considerazione sia l'affinità di legame che l'avidità 1^{, 8}. Inoltre, questo approccio è stato utilizzato per studiare l'efficacia di adesine immobilizzate e derivati come inibitori delle interazioni ospite-patogeno ^{8, 9}. È stato dimostrato che i derivati accoppiati in superficie della molecola di adesione multivalente (MAM) 7 di Vibrio parahaemolyticus possono essere utilizzati per attenuare una serie di infezioni batteriche in vitro, comprese quelle causate da patogeni multiresistenti come l'Acinetobacter baumannii e lo S. aureus resistente alla meticillina (MRSA) ^{7, 9}.

Qui, descriviamo diverse sostanze chimiche che possono essere utilizzate per immobilizzare le adesine su particelle di polistirene funzionalizzato disponibili in commercio. A causa dell'ampia gamma di funzionalità superficiali disponibili, etichette e dimensioni delle particelle, questi sono un'utile impalcatura per la produzione di materiali batteriomimetici per studiare le interazioni adesina-ospite. Descriviamo ulteriormente i metodi per la caratterizzazione iniziale della reazione di accoppiamento e per il calcolo di importanti proprietà dei materiali risultanti. Infine, l'uso di adesine accoppiate a perline come inibitori competitivi delle infezioni batteriche in vitro è discusso come esempio della loro applicazione, così come la portata futura e i limiti di questo approccio.

Protocollo

1. chimica Accoppiamento di proteine ​​per Beads Polymer

1. Accoppiatore direzionale tiolo-ammina
   Nota: Questo protocollo è adatto per l'accoppiamento di cisteina contenenti proteine ​​ammina-funzionalizzati perle di polimero, utilizzando Sulfosuccinimidyl 4- (p -maleimidophenyl) butirrato (solfo-SMPB) come agente reticolante (Figura 1).
   
   Figura 1. reticolazione strategia utilizzata per l'accoppiamento direzionale tiolo-ammina di proteine ​​di perle di polimero. Perle di polistirene Amine modificati vengono attivati ​​con Sulfo-SMPB. Il maleimmide reagisce con cisteine ​​libere per direzionalmente paio di proteine ​​per perline. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
   1. Preparazione dei reagenti:
      1. Preparare PBS (100 mM sodio fosfato, NaCl 150 mM, pH 7,0) e autoclave.
      Preparare uno stock 100x (0,5 M o 287 mg / ml in PBS) di TCEP (tris (2-carbossietil) fosfina) immediatamente prima dell'uso.
   2. Preparare uno stock 5x (10 mM o 4.58 mg / ml in dH _{2 O)} di solfo-SMPB immediatamente prima dell'uso.
   3. Preparare uno stock 10x (500 mm o 88 mg / ml in PBS, pH 7,0) di cisteina immediatamente prima dell'uso.
2. Attivazione Bead:
   1. Mescolare sferette capovolgendo delicatamente e trasferire la quantità necessaria di sferette (ad esempio, 12 ml) in una provetta sterile da 1.5 ml contenente 1 ml di PBS sterile, pH 7,0.
   2. Pipettare delicatamente su e giù per lavare le perline e pellet per centrifugazione in una microcentrifuga (2 min a 16.000 xg).
   3. Rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare. Risospendere il pellet tallone in 1 ml di PBS sterile fresca e ripetere la fase di lavaggio. Risospendere il pellet tallone in 0,8 ml di PBS.
   4. Aggiungere 200 ml di preparati al momento 10 mM Sulfo-SMPB, per dare un concent finalerazione di 2 mm.
   5. Incubare la sospensione di sferette per 1 ora a 25 ° C su una ruota girevole.
3. Riduzione Proteine:
   1. Durante il periodo di incubazione della fase di attivazione, preparare la proteina per la successiva fase di accoppiamento in modo che possa essere immediatamente aggiunto ai talloni attivati.
      Nota: Sebbene questo passaggio riduzione non è sempre necessaria per GST (glutatione S-transferasi) proteine ​​di fusione, si raccomanda di garantire una elevata efficienza di accoppiamento.
      1. Controllare la concentrazione di proteine, e regolarlo alla concentrazione finale richiesta per la reazione di accoppiamento. Nota: proteine ​​6 mM in PBS, e un volume di 1 ml di solito vengono utilizzati.
      2. Aggiungi TCEP magazzino per dare una concentrazione finale di 5 mm. Incubare la soluzione per 30 minuti a RT.
         Nota: La miscela di reazione può essere utilizzato direttamente per la reazione di accoppiamento.
      3. Mantenere una piccola quantità (pochi ml) della soluzione di proteine ​​per la determinazione del pro la concentrazione TEIN e calcolo di efficienza di accoppiamento (vedi capitolo 2).
4. Proteine ​​fase di accoppiamento:
   1. Pellet le perline attivate mediante centrifugazione (2 min, 16.000 xg in una microcentrifuga), e lavare il pellet volta in 1 ml di PBS sterile fresca.
   2. Risospendere il pellet in soluzione proteica preparato (per esempio, 1 ml), per ottenere la concentrazione proteina desiderata.
      Nota: La concentrazione proteica durante la fase di accoppiamento dipende dalla efficienza di accoppiamento medio (vedere sezione 2 per determinare l'efficienza di accoppiamento) e la densità di accoppiamento desiderato (calcolato a 1.1.4.3). L'efficienza è di circa 85% e la desiderata concentrazione finale 5 mM nella sospensione 10x tallone, in modo concentrazione proteica durante la fase di accoppiamento deve essere di circa 6 mm.
   3. Calcolare la densità di accoppiamento utilizzando la seguente formula:
      jpg "/> dove
      ρ _c densità accoppiamento [numero di molecole proteiche / nm ^2],
      proteina concentrazione proteica conc [mg / ml],
      proteina M _w peso molecolare delle proteine ​​[Da],
      concentrazione tallone conc tallone [numero di perline / L],
      diametro d tallone [nm ^2]
      Numero di Avogadro
   4. Utilizzare la densità di accoppiamento per calcolare la distanza media legante:
      
   5. Incubare la sospensione della proteina-tallone per 2 ore a 25 ° C su una ruota girevole.
      Nota: alcuniproteine ​​possono non essere stabile a temperatura ambiente. In questi casi, la reazione può essere condotta a 4 ° CO / N.
   6. Disattivazione rimanenti gruppi attivati ​​ai talloni aggiungendo cisteina magazzino ad una concentrazione finale di 50 mM e incubare la sospensione per 30 min a 25 ° C su una ruota girevole. Pellet le perline per centrifugazione (2 min, 16.000 xg in una microcentrifuga).
   7. Conservare il surnatante per determinare la concentrazione di proteine ​​e calcolare il rendimento di accoppiamento (vedi capitolo 2).
   8. Lavare il pellet tallone due volte con 1 ml di PBS e risospendere in 1 ml di PBS fresco a dare il prodotto finale.
      Nota: Il protocollo sopra tipicamente darà 1 ml di proteine ​​accoppiato, ad una concentrazione finale di proteine ​​5 mM, che può essere utilizzato come uno stock 10x per esperimenti successivi (vedere paragrafo 3).
   9. Per passare alla sezione 3 del protocollo, il lavoro con 100 ml / ml di tallone stock, o ad una concentrazione finale di proteine ​​500 nm. Nota: Un buon punto di partenza per questo immissioe sarà 2 × 10 ¹² perline / ml, determinando un accoppiamento densità media di 3 × 10 ^-4 proteine ​​/ Nm ² o una distanza media di 57 nm su un cordone di diametro di 2 mm.

Accoppiatore direzionale tiolo-carbossi
Nota: Questo protocollo è adatto per l'accoppiamento cisteina contenente proteine ​​di sferette di polistirene carbossi-funzionalizzato. La porzione carbossile viene prima attivato utilizzando 1-etil-3- (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC) / N-idrossisuccinimmide (NHS), Amine modificato e poi interconnessi Sulfo-SMPB (Figura 2).

Figura 2. reticolazione strategia utilizzata per l'accoppiamento direzionale tiolo-carbossilico di proteine ​​di perle di polimero. Perle di polistirene carbossilati vengono prima attivati ​​con EDC e modificati con NHS per formare un semi-stabile NHS-estere. Successivamente ammina-accoppiamento ethylenedirisultati ammina in un gruppo amminico libero, che reagisce con Sulfo-SMPB. Maleimmide attivato perline possono poi reagire con cisteine ​​libere per direzionalmente paio di proteine ​​per perline. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

1. Preparazione dei reagenti:
   1. Preparare PBS (100 mM sodio fosfato, NaCl 150 mM, pH 7,0) e autoclave.
   2. Preparare uno stock 100x (0,5 M o 287 mg / ml in PBS,) di TCEP immediatamente prima dell'uso.
   3. Preparare uno stock 10x (20 mM, o 4 mg / ml in PBS) di EDC (1-etil-3- (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide) immediatamente prima dell'uso.
   4. Preparare uno stock 10x (50 mM, o 6 mg / ml in PBS) di NHS (N-idrossisuccinimmide) immediatamente prima dell'uso.
   5. Preparare uno stock 5x (10 mM o 4.58 mg / ml in dH _{2 O)} di solfo-SMPB immediatamente prima dell'uso.
   6. Preparare uno stock 10x (500 mm o 88 mg / ml in PBS, pH 7,0) di cisteina immediatamente buso rima.
2. Attivazione Bead:
   1. Mescolare sospensione di sferette capovolgendo delicatamente e trasferire la quantità necessaria di sferette (ad esempio, 12 ml) in una provetta sterile da 1.5 ml contenente 1 ml di PBS sterile, pH 7,0.
   2. Pipettare delicatamente su e giù per lavare le perline e pellet per centrifugazione in una microcentrifuga (2 min a 16.000 xg).
   3. Rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare.
   4. Risospendere il pellet tallone in 1 ml di PBS sterile fresca e ripetere la fase di lavaggio.
   5. Risospendere il pellet tallone in 0,8 ml di PBS.
   6. Aggiungere 100 ml di 10x EDC magazzino (2 mm di concentrazione finale) e immediatamente 100 ml di soluzione madre 10x NHS (5 mm concentrazione finale) per la sospensione di sferette.
   7. Incubare la sospensione di sferette per 30 minuti a 25 ° C su una ruota girevole.
   8. Lavare perline una volta in 1 ml di PBS e risospendere in 0,8 ml fresca sterile PBS.
   9. Aggiungere 200 ml di etilendiammina, e incUbate sferette per 1 ora a 25 ° C su una ruota girevole.
   10. Lavare perline una volta con 1 ml di PBS e risospendere le sfere in 0,8 ml di PBS fresco.
   11. Passare dalla sezione 1.1.2.4 (attivazione tallone con Sulfo-SMPB), come descritto nella sezione 1.1.2 e seguire il resto del protocollo descritto nella sezione 1.1 (accoppiatore direzionale Thiol-ammina). Eseguire preparazione proteine ​​e gradini accoppiamento proteina in modo identico a quelli descritti nella sezione 1.1.
       Nota: L'efficienza di accoppiamento tipico usando questo protocollo è leggermente inferiore rispetto al punto 1.1, quindi regolare la concentrazione iniziale di proteine ​​di conseguenza per ottenere la stessa densità di accoppiamento (circa 75%.).

2. Determinazione del Coupling efficienza

Nota: per determinare la concentrazione di proteine, utilizzare Bradford reagente ¹⁰ e test colorimetrici come segue:

1. Capovolgere delicatamente Bradford reagente all'e Nsure omogeneità del reagente.
2. Utilizzando un / ml soluzione madre BSA 10 mg, preparare standard che coprono proteine ​​concentrazioni da 0,1 a 1,5 mg / ml BSA in tampone.
3. Aggiungere 250 ml di Bradford reagente pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Preparare abbastanza pozzi per tutti i campioni, gli standard di proteine ​​e controlli negativi (tampone solo).
4. Aggiungere 5 ml di campione di proteine ​​(standard di proteine ​​o di tampone, per il controllo negativo) al reagente nella piastra a 96 pozzetti.
5. Incubare la piastra su un agitatore orbitale a temperatura ambiente per 10 min.
6. Misurare l'assorbanza a 595 nm usando un lettore di piastre.
7. Generare una curva standard di concentrazione BSA contro A595 nm e utilizzare questo per determinare le concentrazioni di proteine ​​nei campioni iniziali e surnatante.
8. Calcolare la concentrazione di proteine ​​accoppiati come segue:
   
9. Calcolare l'efficienza di accoppiamento come:
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3. Uso di Bead-accoppiato adesine in Assays Concorso

1. Preparazione:
   1. Seed 1 ml per pozzetto di cellule HeLa alla concentrazione di 150.000 cellule / ml in una piastra da 24 pozzetti il ​​giorno prima del dosaggio concorso, per permettere alle cellule di raggiungere circa il 80% di confluenza prima di iniziare l'esperimento.
   2. Impostare ogni condizione sperimentale in triplice copia. Includere pozzi per i controlli negativi (nessun batteri aggiunti durante i test della concorrenza), controlli positivi (sfere di controllo accoppiati alla fusione-tag aggiunti solo durante i test della concorrenza) ei controlli di lisi (per esperimenti di citotossicità).
   3. Seminare un LB (MLB) cultura 5 ml marino con una nuova colonia di V. parahaemolyticus e crescere O / N a 30 ° C, agitando.
   4. Preparare sufficiente MAM tallone accoppiati, come descritto nella sezione 1. (Coupling). Lasciare per 100 ml di 10x tallone stock per pozzetto.
2. Analisi della concorrenza:
   1. Il giorno della competitiesperimento ione, misurare il _diametro esterno 600 della coltura batterica.
   2. Preparare supporti infezione diluendo colture batteriche in DMEM incolore senza additivi, pre-riscaldato a 37 ° C, contenente il 10% di sospensione v / v tallone (sia adesina-coupled perle o sfere di controllo), per dare una MOI di 10. Preparare 1 ml / bene e 10-20% di volume in eccesso per campione. Nota: Per le condizioni di cui sopra (24-pozzetti, V. parahaemolyticus, MOI 10), il volume necessario di O / N cultura da aggiungere ad ogni bene (ml / ml) viene calcolato come 3 / OD ₆₀₀ della cultura. Ad esempio, 1 ml di mezzo infezione in genere contengono 100 ml di sospensione tallone, a pochi ml di coltura batterica e essere effettuate fino a 1 ml con incolori, DMEM senza supplementi.
   3. Rimuovere vecchio medio dai pozzetti e lavare cellule HeLa in coltura con l'aggiunta di 1 ml di PBS sterile pre-riscaldato a 37 ° C in ciascun pozzetto.
   4. Rimuovere PBS e aggiungere 1 ml di terreno infezione per bene. Anche impostare i controlli, con l'aggiunta di soluzioni di containing perline di controllo e batteri (controllo positivo) o perline adesina e nessun batteri (controlli negativi) o DMEM contenente 0,1% Triton X-100 (controllo, necessaria solo per misure di citotossicità lisi).
   5. Incubare la piastra in un incubatore di coltura tissutale a 37 ° C per il tempo desiderato (ad esempio 4 ore per misure di citotossicità o 1 ora per misurazioni di adesione).
      Nota: sia l'adesione batterica e la citotossicità sulle cellule ospiti possono essere utilizzati come-out di lettura per l'efficacia di inibizione. Se i punti di tempo di citotossicità e di adesione misure coincidono, entrambi i test possono essere eseguite su campioni dallo stesso pozzo, dal momento che la citotossicità è determinato utilizzando le cultura surnatante e attaccamento saggi utilizzano campioni derivati ​​dallo strato di cellule rimanenti.
3. Misure di citotossicità:
   1. A intervalli di tempo indicati (ad esempio, 4 ore dopo l'infezione), rimuovere tre volte da 200 ml ogni 24 pozzetti e trasferimentouna piastra a 96 pozzetti.
   2. Spin piastre a 96 pozzetti a 1.500 xg, 5 min e trasferire 100 ml di ciascun pozzetto in una piastra da 96 pozzetti fresco. Aggiungere 100 ml di supporti utilizzati durante esperimenti di infezione nei pozzetti freschi della piastra a 96 pozzetti in triplice copia (questi saranno utilizzati come spazi).
   3. Eseguire il saggio deidrogenasi (LDH) rilascio di lattato utilizzando un kit di rilevamento LDH citotossicità e seguendo le istruzioni del produttore.
      1. Brevemente, calcolare la quantità di reagente necessario in incrementi di 25 (ad esempio, se 62 campioni da misurare, costituiscono miscela reagente sufficiente per 75 etc.).
      2. Ad esempio, per 100 campioni, miscelare 11,25 ml di reagente A con 250 microlitri di reagente B. Invertito, non fare vortex per evitare la formazione di schiuma.
      3. Mettere il composto in un serbatoio per poter pipettare con una pipetta multicanale. Aggiungere 100 pl di miscela reagente ogni campione.
      4. Incubare la piastra a temperatura ambiente e leggere l'assorbanza a 490 nm su un lettore di piastre a 10, 20, 30 min.
      Analizzare il set di dati per il quale l'assorbanza del campione di controllo lisi è alto, ma ancora all'interno della gamma lineare del lettore di piastre (tipicamente, 2-3 unità di assorbanza).
   4. Esprimere i risultati come% citotossicità, con la seguente formula di conversione:
      

Misura di adesione batterica:

1. A intervalli di tempo indicati (ad esempio, 1 ora dopo l'infezione), rimuovere i supporti dallo strato di cellule.
2. Lavare accuratamente lo strato di cellule con sterili, pre-riscaldato PBS (almeno 3-4 lavaggi di 1 ml di PBS ciascuno) per rimuovere tutte le cellule non-attaccato.
3. Cellule ospiti Lyse aggiungendo 1 ml di una sterile 1% v / v Triton X-100 in PBS soluzione per pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C per 5 min.
4. Pipettare ciascun campione su e giù parecchie volte prima di trasferire il contenuto di ogni pozzetto per separare provette da 1,5 ml. Preparare 10 diluizioni seriali dei campioniin PBS sterile (ad esempio, utilizzare 100 ml di campione e 900 ml di PBS).
5. Piatto 100 ml di ciascun campione sulla MLB agar e diffondere con spatola cellulare. Ottimizzare cui diluizioni per placcare seconda delle ceppi batterici e punti di tempo. Nota: Per la configurazione sperimentale descritto, 10 ⁵ o 10 ⁶ diluizioni danno un congruo numero di CFU.
6. Incubare le piastre a 37 ° CO / N ed enumerare i batteri dal conteggio delle colonie.

Risultati

Il V. parahaemolyticus adesina MAM7 contiene sette tandem ingresso di cellule di mammifero (MCE) domini coinvolti nel riconoscimento dei recettori di superficie ospite. Abbiamo usato perle di polistirene accoppiati a ricombinante, frammenti purificati che comprende sia tutti i domini di sette tandem MCE (MAM7) o solo il dominio prima MCE (MAM1) per testare la capacità di questi materiali di competere con V. parahaemolyticus per cellula ospite vincolante e l'efficacia risultante di questi materiali, come gli inibitori di adesione. Cellule HeLa sono state infettate con V. parahaemolyticus ceppo POR1 e citotossicità dovuta a infezione in vitro è stata valutata dopo 4 ore (Figura 3). Il trattamento delle cellule Hela con 0,1% Triton X-100 (controllo lisi positivo) provocato lisi cellulare completa, cellule non infette visualizzati molto bassi livelli di citotossicità. In vitro infezione di cellule non trattate con POR1 determinato livelli molto elevati di lisi cellulare, e questo è stata inibita da MAM7-coperline upled ma non MAM1 accoppiata o sfere di controllo GST-coupled (Figura 3).

Figura 3. Caratterizzazione del Vibrio parahaemolyticus indotta citotossicità in cellule epiteliali durante saggi di competizione. Le cellule sono state trattate con V. parahaemolyticus (Vp), indicati con (+), o nessun batteri (-) in presenza di diversi soggetti concorrenti (Comp.), come indicato. Tra queste, o nessuno comp. (-), Perline MAM7 (MAM7), MAM1 perline (MAM1) o sfere di controllo GST (GST). Come controllo, le cellule sono state trattate sia con Triton X-100 (triton, controllo lisi), o lasciato non infetto (uninf). Rilascio di LDH dopo 4 ore è stata misurata come descritto nel paragrafo 3, e risultati normalizzato ai controlli Triton (100%) e spazi vuoti (0%) come descritto sopra. I risultati sono mezzi ± sem da esperimenti in triplo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Conteggio di V. parahaemolyticus fissato sia cellule HeLa non trattate, o cellule incubate con MAM7-, MAM1-, o sfere di controllo GST, ha rivelato che MAM7-perle, ma non MAM1- o sfere di controllo GST- outcompete V. parahaemolyticus per il fissaggio a ospitare recettori della superficie cellulare (Figura 4).

Figura 4. Caratterizzazione di attacco batterico durante esperimenti di competizione. Cellule HeLa sono state infettate con V. parahaemolyticus POR2 (Vp +), in assenza (-) o la presenza di competere entità come segue: perline MAM7 (MAM7), perline MAM1 (MAM1) o perline di controllo GST (GST) (comp.). Adesione batterica è stata misurata dopo 1 ora, come descritto nella sezione 3. I risultati sono mezzi ± sem da esperimenti in triplo. Mezzi (FLTR in UFC / ml) sono 2,3010 ^{6, 5} 1,5310, 2,0510 ^6, 2,1210 ^6. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Adesine accoppiati a fluoroforo etichettato perline risultato la generazione di materiali che imitano adesione batterica alle cellule ospiti e sono strumenti potenti per l'imaging cellulare (Figura 5). Utilizzando fluorescenti perline blu MAM7 accoppiati, abbiamo caratterizzato il processo di attaccamento MAM7 mediata da cellule epiteliali. Fissaggio della MAM7 alle cellule ospiti provocato actina riarrangiamenti e la formazione di fibre di stress, che sono stati co-visualizzate con rodamina-falloidina colorare per F-actina (Figura 5B).

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Figura 5. Preparazione e utilizzo di fluoroforo etichettati perline biomimetici per scopi di imaging. (A) Sospensione di fluorescenti biomimetici perline blu (tubo a destra, 10x azione) e il tampone di controllo (tubo a sinistra). (B) Allegato di perline MAM7 accoppiati a Hela cellule risultati in riarrangiamenti di actina e la formazione di fibre di stress. Fibre di attacco di fluorescenti perline blu e conseguente allo stress actina (rosso, colorati con rodamina-falloidina) sono stati ripresi al microscopio. Bar, 10 micron. Immagini nel pannello B sono stati adattati da Lim et al. ¹ e riprodotti sotto la licenza Creative Commons Attribution. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Qui, descriviamo due protocolli, che possono essere utilizzati per le proteine ​​contenente il tiolo paio di quali ammine o polistirolo perline carbossilato modificato, rispettivamente. Grazie alla facilità di procedura, accoppiamento tiolo-ammina è preferibile, ma a seconda della specifica tallone desiderata (diametro, proprietà di fluorescenza), uso di perline ammina-funzionalizzato potrebbe non essere possibile e pertanto abbiamo incluso un protocollo che converte il carbossilato - in un residuo amminico a dare al ricercatore la massima flessibilità nella scelta del ponteggio. Sebbene sia tiolo-ammina e lavoro accoppiamento tiolo-carbossile per ogni cisteina contenente proteine, accoppiatore direzionale (cioè, l'immobilizzazione della proteina per il suo N-terminale, mimando visualizzazione superficie) richiede una proteina senza residui di cisteina, che è prodotto come fusione GST proteine, o che contiene un singolo residuo di cisteina terminale introdotto dalla mutagenesi sito-specifica. Se più cisteine ​​reattive sono contenutiall'interno della proteina, questo porterà a immobilizzazione casuale che può impedire la funzione delle proteine. Molti adesine batteriche non contengono cisteine ​​naturalmente. Per altri, questi possono essere rimossi mediante mutagenesi sito-specifica, anche se questo implicherà saggi per garantire struttura e funzione nativa vengono mantenute nel mutante. Per proteine ​​di fusione GST, purificato GST-tag accoppiato a microsfere può essere utilizzato come controllo negativo idoneo. Utilizzando perline disaccoppiati come controllo dovrebbe essere evitato, in quanto questi spesso hanno una maggiore tendenza a raggrupparsi o aderire alle cellule non-specifico. Una versione semplificata del protocollo 1.2., Utilizzando solo EDC, può essere utilizzato per accoppiare proteine ​​di perle di polimero funzionalizzato carbossilici, tuttavia in questo caso l'accoppiamento avviene tramite ammine primarie nella proteina e quindi non garantisce accoppiatore direzionale.

TCEP come agente riducente non deve essere sostituito con altri agenti riducenti disponibili in commercio e di uso comune, come dithiothreitol (DTT) o 2-mercaptoetanolo (BME), come i tioli in essi contenute saranno in concorrenza con accoppiamento proteina nella fase di accoppiamento tiolo-maleimmide. PBS può essere sostituito con altri buffer, ma con le seguenti considerazioni: buffer non può contenere ammine primarie (quindi buffer Tris-contenenti non sono adatti). L'uso di tamponi contenenti (<10 mm) concentrazioni molto basse di sale porta a tallone aggregazione e dovrebbe anche essere evitata. La proteina purezza è anche un fattore importante da prendere in considerazione durante questa procedura, e per ottenere dati di alta qualità, devono essere utilizzati proteine ​​pure. Noi abitualmente purificare le proteine ​​in più fasi, di cui almeno una fase di purificazione di affinità e gel filtrazione, ma in alcuni casi agli ioni di cromatografia a scambio è fatto come un terzo passo. Come risultato la purezza delle proteine ​​utilizzate per l'accoppiamento di solito è del 90% o superiore, come giudicato da SDS-PAGE.

Si raccomanda di determinare concentrazioni di proteine ​​sia nella miscela di reazione iniziale e di the surnatante dopo il completamento reazione. Ciò contribuirà a determinare la concentrazione di proteine ​​apparente tallone accoppiati, e quindi la densità di accoppiamento. Determinazione dei valori sia permetterà anche calcolo dell'efficienza di accoppiamento. Questo può essere preso in considerazione quando si prepara la soluzione proteica iniziale successive reazioni, per raggiungere la concentrazione e l'accoppiamento densità finale desiderato. Bradford reagente è particolarmente adatto per la determinazione della concentrazione proteica prima e dopo la reazione di accoppiamento, in quanto nessuna delle sostanze nella reazione interferisce con la formazione complesso colorante alle concentrazioni utilizzate. Se le concentrazioni proteiche inferiori sono da utilizzare, questo metodo può dover essere sostituito da un metodo di rilevazione più sensibile, tuttavia attenzione deve essere rivolta al fatto che deve essere compatibile con le sostanze contenute all'interno della reazione di accoppiamento. Si raccomanda inoltre di utilizzare reagenti preparati al momento e maneggiare i reagenti in polvere con cura (ad esempio, negozioin un contenitore sigillato e utilizzare granuli di silice, per evitare i reagenti disegno umidità) Poiché la qualità di reagenti influenzano l'efficienza di accoppiamento. Se l'efficienza di accoppiamento è inferiore al previsto, i possibili rimedi includono l'aumento della concentrazione di perle e di proteine ​​iniziali. Se si utilizzano concentrazioni più elevate, la concentrazione dei reagenti di accoppiamento deve essere aumentata proporzionalmente per garantire un sufficiente eccesso molare. Modifica concentrazioni tallone / proteina di solito è un passo più verso l'ottimizzazione piuttosto che aumentando i tempi di reazione. Dal momento che i protocolli per l'accoppiamento tallone sono lunghi, che comunemente prepariamo un grande lotto di materiale. Aliquote di sospensione possono essere snap-congelati in azoto liquido e conservati a -20 ° C per diversi mesi. Aliquote scongelati non devono essere ricongelati e devono essere mantenuti a 4 ° C ed utilizzati entro 1-2 giorni. Tuttavia, questo varierà con la natura e la stabilità della proteina utilizzata come dovrebbe essere testato su un piccolo lotto inizialmente.

adesine branello-accoppiati può essere usato per molte applicazioni, come discusso di seguito. Questo protocollo descritto un metodo che viene comunemente utilizzato per misurare l'inibizione della citotossicità batterica vincolante e patogeno-mediata su cellule ospiti. Il test viene comunemente eseguita per misurare la capacità di DAM tallone-accoppiato ad inibire competitivamente infezione di cellule epiteliali Hela con il mare-cibo patogeno carico Vibrio, utilizzando una diminuzione attaccamento batterico alle cellule ospiti o ridotta citotossicità come una lettura-out . In entrambi i casi, la preparazione e la concorrenza saggi seguono lo stesso protocollo. A seconda della lettura, diversi ceppi di V. parahaemolyticus vengono utilizzati: il ceppo citotossico POR1 viene utilizzato per le misure di citotossicità, mentre il ceppo non citotossica POR2 viene utilizzato per misurare l'adesione dei batteri, dal momento che la morte cellulare e il distacco delle cellule compromette la procedura per quantificare i batteri attaccati.

Inizialmente, compecorrenza esperimenti sono stati istituiti come protocollo graduale, in cui le cellule ospiti erano prima pre-incubate con perline prima dell'aggiunta dei batteri. Per V. parahaemolyticus e le specifiche tallone utilizzati (2 micron perline accoppiate a MAM7), entrambi i talloni e batteri possono essere aggiunti allo stesso tempo, senza cambiamenti nella citotossicità risultante. Vale a dire, in questa configurazione sperimentale, perline outcompete batteri per il legame della cellula ospite. A seconda della specie batteriche e tallone geometria utilizzata, ci possono essere buoni motivi per mantenere l'aderenza tallone e infezione batterica due passi separati. Ad esempio, per infettare cellule con batteri non mobili, piastre sono comunemente centrifugati dopo l'aggiunta del supporto infezione. Tuttavia, la centrifugazione delle piastre contenenti sospensioni tallone dovrebbe essere evitato, poiché questo porta ad una distribuzione non omogenea perline sullo strato di cellule. Se si utilizzano dimensioni delle particelle più piccole, perline ci vorrà più tempo per risolvere sulla superficie cellulare, in questo caso sutempo sere sufficienti dovrebbe essere consentito per il fissaggio tallone prima l'infezione. Quando adesione batterica viene utilizzato come lettura, i campioni dovrebbero essere prese in momenti in cui cellule ospiti non sono significativamente danneggiati dal ceppo infettante, come il distacco delle cellule e lisi possono compromettere la quantificazione dei batteri attaccati.

Invece di enumerare adesione batterica da diluizione in piastra, i campioni possono in alternativa essere trattati per l'imaging (Figura 5). In questo caso, le cellule di coltura di tessuto devono essere seminate su vetrini di vetro, piuttosto che direttamente nei pozzi. Inoltre, perline fluorescenti e batteri che esprimono una proteina fluorescente possono essere utilizzati, con marcatori cellula ospite-specifiche infezione. Ad esempio, esperimenti di competizione sono comunemente ripreso con rosso fluorescente rodamina-falloidina macchiare actina citoscheletro delle cellule ospitanti e valutare i cambiamenti morfologici derivanti da infezione, insieme con perline fluorescenti blu e fluorescenteverde (GFP che esprimono o SYTO18 macchiata) batteri.

Una gamma di adesine perline accoppiati, tra cui lo Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes F1 FUD e Vibrio MAM, sono stati utilizzati come materiali biomimetici per studiare l'adesione, l'inibizione di adesione e il contributo di adesione al patogeno mediata citotossicità ^{1, 7, 8.} Uno dei vantaggi di utilizzare questo approccio è la facilità di visualizzazione di eventi di fissaggio, poiché le perle di polimero utilizzati come supporti sono disponibili in una vasta gamma di colori (ad esempio, blu, rosso fluorescente, blu, verde, arancione). Così, etichettatura proteina diretta, che può interferire con la funzione, può essere evitato. Inoltre, superficie imita la visualizzazione di accoppiamento polivalente di adesine sulla superficie batterica, riflettendo così una conformazione più fisiologicamente rilevanti rispetto alle proteine ​​solubili.

Rispetto a studi utilizzando batteri intatti o bacteriAl mutanti, l'approccio tallone elude problemi associati con la crescita batterica. Ad esempio, a più lungo termine (ad esempio, O / N) studi di adesione batterica alle cellule ospiti che utilizzano batteri intatti sono spesso compromesse da fenomeni che accompagnano la crescita batterica - acidificazione del mezzo di crescita e nutrienti esaurimento influenzare negativamente cellule ospiti, e la replica batterica alla fine compromette qualità delle immagini.

Più di recente, l'uso di adesine perline accoppiamento è stato ampliato per includere il loro uso come strumenti per purificazioni affinità di accoglienza cellulare fattori coinvolti nei processi a valle di attaccamento batterico segnalazione. V. parahaemolyticus MAM7, tramite legame con acidi fosfatidici nella membrana della cellula ospite, provoca l'attivazione RhoA e actina riarrangiamenti ^{1, 3.} perline MAM accoppiati vengono utilizzati per purificare e identificare le proteine ​​coinvolte nelle piattaforme di segnalazione assemblati come conseguenza della cella MAM-host obbligatorio. Dal momento che può perlineessere facilmente separato dal surnatante mediante una breve fase di centrifugazione, e la proteina di interesse è covalentemente accoppiato, questo è un buon metodo per ottenere la separazione di proteine ​​contaminanti e arricchire pertinenti complessi proteici, che può essere utilizzato per applicazioni a valle, come proteomica o Western assorbente.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagenti
Tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP)	Sigma	646547	Pericolo; corrosivo può essere acquistato come soluzione o appena preparato
Sulfosuccinimidil 4-(p-maleimidofenil)butirrato (Sulfo-SMPB)	Fisher	PN22317	Pericolo; tossico
L-cisteina	Sigma	30089	Pericolo; tossico
Perle di lattice, polistirene modificato con ammine, blu fluorescente - sospensione acquosa, 2.0  μ m dimensione media delle particelle	Sigma	L0280	nocivo; è disponibile una gamma di dimensioni e colori alternativi delle particelle
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimmide (EDC)	Thermo scientific	22980
N-idrossisuccinimide (NHS)	Thermo scientific	24500
Perle di polistirene modificato con carbossilato	Sigma	CLB9	dannoso; è disponibile una gamma di particelle di dimensioni e colori alternativi
Etilendiammina	Sigma	E26266	Pericolo; infiammabile, corrosivo, tossico, sensibilizzante
Siero bovino Albumina (BSA)	Promega	W3841
Reagente Bradford	Sigma	B6916	Pericolo; corrosivo e tossico
Dulbecco' s Aquila modificata' s Glucosio medio - alto - Con 4.500 mg/L di glucosio e bicarbonato di sodio, senza  L-glutammina, piruvato di sodio e rosso fenolo, liquido, filtrato sterile, adatto per colture cellulari	Sigma	D1145	per esperimenti di infezione
DMEM	Sigma	D6429	per il mantenimento di cellule ospiti in coltura
Siero fetale bovino, inattivato termicamente	Integratore Sigma	F9665	per terreno
di coltura tissutaleSoluzione di penicillina-streptomicina - stabilizzata, con 10.000 unità di penicillina e 10  mg di streptomicina/mL, filtrato sterile, BioReagent, adatto per colture cellulari	Integratore Sigma	F9665	per terreno di coltura tissutale
PBS	Sigma	D8537
LDH Kit per il rilevamento della citotossicità	Takara	MK401
Serbatoi di reagenti
	Greiner	662160
piastre a 96 pozzetti	Greiner	655182
Equipment
emocitometro
microcentrifuga
lettore
di piastre strutture			per la coltura tissutale
pipetta