A Corsa Versatile Modello murino di Subcortical bianco Materia per lo Studio della assonale degenerazione e bianco Materia Neurobiologia

Sommario

Qui presentiamo la metodologia per la produzione di un ictus focale nella sostanza bianca murina mediante iniezione locale di un inibitore irreversibile dell'ossido nitrico sintasi endoteliale (eNOS) (L-Nio). Vengono presentate due varianti stereotassiche, il tracciamento neuronale retrogrado e la marcatura e dissezione di tessuti freschi che ampliano le potenziali applicazioni di questa tecnica.

Abstract

Ictus colpisce conti sostanza bianca fino al 25% delle presentazioni ictus cliniche, avviene automaticamente a velocità che possono essere 5-10 volte maggiore, e contribuiscono alla sviluppo di demenza vascolare. Pochi modelli di focale ictus sostanza bianca esistono e questa mancanza di modelli appropriati ha ostacolato la comprensione dei meccanismi coinvolti nella risposta neurobiologiche danno e la riparazione dopo questo tipo di ictus. La principale limitazione di altri modelli di ictus subcorticali è che essi non focally limitano l'infarto alla materia bianca o sono stati in primo luogo convalidato in specie non murini. Questo limita la capacità di applicare l'ampia varietà di strumenti di ricerca murini per studiare la neurobiologia di bianco ictus materia. Qui presentiamo una metodologia per la produzione affidabile di un ictus focale nella materia bianca murino utilizzando una iniezione locale di un inibitore irreversibile eNOS. Presentiamo anche diverse variazioni sul protocollo generale di cui due stereotassica unicovariazioni, retrograda tracing neuronale, nonché di etichettatura tessuto fresco e sezionamento che ampliare notevolmente le potenziali applicazioni di questa tecnica. Queste variazioni permettono di molteplici approcci per analizzare gli effetti neurobiologiche di questa forma comune e poco studiato di ictus.

Introduzione

L'ictus che colpisce la sostanza bianca sottocorticale è un'entità clinica comune, che rappresenta fino al 25% degli ictus clinici ogni anno negli Stati Uniti ¹. Anche il danno ischemico alla sostanza bianca si verifica silenziosamente a un tasso significativamente più elevato e contribuisce allo sviluppo della demenza vascolare ^2,3. Attualmente, i pazienti con questa forma di ischemia cerebrale hanno poche, se non nessuna, scelta terapeutica. Nonostante l'importanza clinica di questa malattia, esistono pochi modelli animali clinicamente rilevanti ^4,5.

L'obiettivo di questo protocollo è produrre una lesione ischemica focale all'interno della sostanza bianca murina. Questo modello murino di malattia umana consente lo studio specifico della risposta al danno assonale all'ictus e di come gli elementi cellulari della sostanza bianca, vale a dire oligodendrociti e astrociti insieme agli assoni, rispondono e si riparano dopo l'ictus.

Rapporti precedenti hanno descritto un modello di ictus della sostanza bianca sottocorticale utilizzando l'endotelina-1 (ET-1) ⁶ che è simile a quello descritto qui. Sono state apportate diverse modifiche chiave al protocollo sperimentale, pertanto i potenziali usi di questo modello sono aumentati ^7,8. Questo protocollo fornisce una strategia affidabile e modificabile per produrre un ictus focale all'interno della sostanza bianca del cervello del topo.

I principali vantaggi di questo modello sono l'uso di un inibitore chimico endoteliale dell'ossido nitrico sintasi (eNOS) N(5)-(1)-imminoetil-L-ornitina HCl (L-Nio) ⁹ senza effetti paracrini noti sugli elementi cellulari della sostanza bianca, che era stata una complicazione dei modelli che utilizzavano l'endotelina-1 ¹⁰. Inoltre, il targeting stereotassico della sostanza bianca nel topo consente l'uso di qualsiasi varietà di ceppi transgenici o knockout, ampliando notevolmente gli strumenti disponibili per determinare l'effetto dell'ictus sulla sostanza bianca cerebrale. Qui, vengono descritte due varianti di questa tecnica e dimostrano alcune delle variazioni aggiuntive che possono essere utilizzate per migliorare la comprensione dei danni assonali e della sostanza bianca e la riparazione dopo l'ictus.

Protocollo

L'uso di animali in questo protocollo è stata eseguita in conformità con le procedure approvate dalla University of California Los Angeles cura degli animali e del Comitato Usa.

Nota: Iniziare identificando la popolazione murina bersaglio. In studi precedenti, wild-type topi C57 / BL6 solo di sesso maschile sono stati utilizzati, tuttavia diversi topi transgenici o knockout possono anche essere utilizzati. Si noti che le coordinate stereotassica sono basati su C57 / BL6 anatomia. Si raccomanda che ogni utente inizialmente verificare la localizzazione del tratto di materia bianca.

1. Bianco Materia fase di aspirazione - mediale Avvicinamento angolare

1. Iniziare preparando una pipetta di vetro tirato utilizzando 0,5 millimetri capillare tale che il diametro distale è compreso tra 15-25 micron ^11.
2. Preparare una sterile 10 microlitri aliquota della L-Nio (N (5) - (1) -iminoethyl-L-ornitina HCl) a 27.4 mg / ml (130 micron) a 0,9% sterile fisiologica.
3. Pre-riempire la pipetta di vetro tiratocon un piccolo volume di L-Nio (2-5 ml) apponendo la pipetta di vetro per tubo collegato ad una linea di vuoto. Posare il piatto pipetta sul banco e inserire l'estremità tirato nella soluzione L-Nio.
   1. Applicare il vuoto fino ad almeno 2 mm della porzione 0,5 millimetri della pipetta si riempie. Spegnere il vuoto e ritirare la pipetta. Mettere da parte fino al punto 1.12.
4. Posizionare il mouse in una camera di induzione e indurre l'anestesia del mouse utilizzando standard di 32% isoflurano scorreva attraverso un vaporizzatore (5 L / min inalato con 5 L / min di ossigeno e 0,5 L / min N ₂₎ per 1 min o fino a quando profondamente anesthesized. Trasferire il mouse per un apparato stereotassico dotato di un microscopio stereotassico. Fornire anestesia manutenzione utilizzando 32% isoflurano scorreva un vaporizzatore (2 L / min inalato con 5 L / min di ossigeno e 0,5 L / min N ₂₎ ed un cono. Controllare la profondità dell'anestesia con un pizzico punta.
5. Regolare il braccio di iniezione a 36 °.
6. Affixa tirato titolare pipetta di vetro all'estremità distale di un sistema di iniezione a pressione basso volume e collegarlo al braccio iniezione della configurazione stereotassica.
7. Coat baffi degli animali anestetizzati con vaselina e il luogo artificiale pomata di rottura sopra entrambi gli occhi. Preparare un campo chirurgico sterile, mettendo un telino sterile sopra la testa dell'animale con un 5-10 cm di apertura sopra la testa. Preparare una superficie chirurgica asettico dalla rasatura sovrastante il cranio. Pulire il cuoio capelluto con alternanza di betadine e il 70% tamponi con alcol.
8. Fare un 1,5 centimetri incisione mediana del cuoio capelluto con le forbici sottili sterili per esporre la superficie del cranio. Asciugare il cranio con un tampone di cotone sterile e utilizzando un microscopio a stereotassica 1-3X ingrandimento, rimuovere qualsiasi tessuto periostale sovrastante utilizzando uno strumento sterile punto micro.
9. Segnare il Bregma come punto di riferimento con un pennarello a punta fine.
10. Praticare un 2 millimetri craniotomia ellipitical utilizzando una sterile multa stip punta da trapano chirurgico0; a partire posteriormente al Bregma e che estende anteriormente appena lasciato della linea mediana. Rimuovere frammenti ossei e sovrastante tessuto molle in modo che la corteccia cerebrale può essere visualizzato.
11. Mantenere il campo chirurgico e la superficie corticale umida applicando intermittente gocce di soluzione salina sterile.
12. Applicare una pipetta di vetro tirato al braccio dell'iniettore dell'apparato stereotassico. Allineare l'estremità distale della pipetta con il Bregma e zero le coordinate stereotassica.
13. Avanzare la pipetta per la prima anteriore / posteriore (A / P) e mediale / laterale (M / L) coordinate fornite in Tabella 1.
14. Avanzare la pipetta alla superficie corticale e zero dorsale / ventrale (/ V D) di misura.
15. Lentamente passare la pipetta nel cervello fino a raggiungere la prima D / V di coordinate nella tabella 1.
16. Utilizzando un sistema di iniezione a bassa pressione volume impostato a 20 psi per 20 impulsi msec, iniettare 100 nl di L-Nio nel cervello e attendere 5 minuti per evitare il reflussola pista pipetta.
    1. Utilizzare un reticolo calibrato in dell'oculare del microscopio stereotassica ed un ingrandimento di 3X.
    2. Pertanto, spostare un totale di 0.100 mm ³ (lunghezza 0,5 mM una pipetta 0,5 mm di diametro, corrispondente a 100 nl) dalla pipetta di vetro tirato per ogni insieme di coordinate. Utilizzando un reticolo, misurare e standardizzare poiché ogni set up varia a seconda dell'ingrandimento e scale utilizzato.
    3. Per la misurazione del volume precisa durante ogni iniezione, avvicinare la pipetta angolato con il microscopio dal lato in modo che il menisco aria fluido ha una vista sagittale. Il menisco dovrebbe apparire sullo stesso piano focale sia della parete interna ed esterna della pipetta.
17. Lentamente ritirare la pipetta e ripetere i passaggi 1.13-1.16.3 al secondo e terzo set di coordinate forniti in Tabella 1.
18. Dopo l'ultima iniezione, rimuovere la pipetta e posizionare cera ossea sufficiente per riempire il sito craniotomia. UNpproximate i bordi della ferita cuoio capelluto e legarsi con adesivo dermico.
19. Iniettare 0,1 ml di 0,5% Marcaine nei margini della ferita utilizzando una sterile 30 ago G per evitare per evitare dolore locale associato con l'incisione del cuoio capelluto.
20. Rispedire l'animale verso abitazioni e fornitura di antibiotici post-operatorio (0,48 mg / ml trimetoprim-sulfametossazolo, o 0,5 mg / ml levofloxacina) nell'acqua da bere per 5 giorni.

2. Bianco Materia fase di aspirazione - posteriore Avvicinamento angolare

1. Eseguire i passaggi 1,1-1,12 come nel mediale protocollo approccio angolato, tranne regolare il braccio di iniezione del setup stereotassica a 45 gradi orientati anteriore a posteriore.
2. Avanzare la pipetta per la prima A / P e M / L coordinate fornite nella tabella 2.
3. Completa passaggi rimanenti 1.14-1.20 come nel laterale protocollo approccio angolato.

3. retrograda neuronale etichettatura

1. Preparare una sterile 10Un'aliquota ml di L-Nio a 54,8 mg / ml in 0,9% soluzione salina normale.
2. Preparare una un'aliquota sterile del 20% Fluororuby (o il 20% biotinilato ammina destrano o 2% Fluorogold) nel 0,9% soluzione fisiologica.
3. Diluire insieme 1: 1 per concentrazioni finali di 27,4 mg / ml di L-Nio e il 10% Fluororuby.
4. Eseguire il protocollo di ictus come sopra nei passaggi 1.3-1.23.
5. Visualizza il tracciante fluorescente nativamente nella sezione di tessuto per la fissazione perfusione, criosezionamento e microscopia come descritto in precedenza ^8.

4. Il trattamento dei tessuti per immunofluorescenza

1. In un intervallo post-ictus appropriato che vanno da 3 ore a 14 giorni dopo l'ictus, euthanize topi tramite overdose isoflurano o IACUC locali approvati procedura.
2. Aprire la cavità toracica con le forbici angolate e inserire un ago G 23 farfalla nel ventricolo sinistro.
3. Inserire un piccolo taglio nell'atrio destro usando forbici sottili per permettere una traccia di deflusso per il liquido di perfusione.
4. Transcardially profumato con 30-40 ml di soluzione salina tamponata con fosfato freddo seguita da 30-40 ml di freddo 4% paraformaldeide ad una velocità di 10 ml / min a RT.
5. Decapitare il mouse e rimuovere il cervello con le forbici sterili per aprire il cranio posteriormente e quindi rimuovere delicatamente il cranio sovrastante con una spatola, mettere il cervello a freddo 4% PFA per 24 ore, e poi il trasferimento al 30% di saccarosio in PBS per 48 ore .
6. Preparare quaranta sezioni micron mobile usando un criostato e eseguire l'elaborazione di anticorpi come descritto in precedenza ^6-8. In questo studio, utilizzare i seguenti anticorpi: coniglio anti-neurofilamenti 200 (diluizione 1: 500); coniglio anti-vimentina (1: 500); capra anti-GFAP (1: 500); coniglio anti-Iba-1 (1: 1.000).

5. Trattamento del tessuto per proteine ​​o RNA analisi

1. In un intervallo post-ictus appropriato che vanno da 3 ore a 14 giorni dopo l'ictus, eutanasia tramite overdose isoflurano o IACUC locale procedura approvata.
2. decapitare ilmouse e rimuovere il cervello con le forbici sterili per aprire il cranio posteriormente e quindi rimuovere delicatamente il cranio sovrastante con una spatola.
3. Inserire una sterile 4 millimetri spatola nella parte anteriore del cervello per tagliare il bulbo olfattivo e nervi ottici. Sollevare delicatamente il cervello fuori della calotta cranica e posto in buffer di dissezione ghiacciata (soluzione salina bilanciata di 1x Hank, 25 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 35 mm di glucosio, 4 mM di bicarbonato di sodio, e 0,01 mg / ml Cicloesimide).
4. Utilizzando un blocco cervello e nuove lame di rasoio sterile, preparare lastre di 2-3 mm contenenti la corsa e il luogo nel buffer dissezione a freddo.
5. Sotto un microscopio da dissezione, identificare la sostanza bianca sottostante corteccia motoria dell'emisfero iniettato. A intervalli post-corsa più lunga, la regione può essere visivamente identificato da necrosi focale e mielina pallore.
   Nota: A intervalli post-ictus precedenti, l'iniezione di L-Nio mescolato con 1 ml di 10% Veloce verde può permettere l'identificazione visiva della corsa ( Figura 4A).
6. Sotto la guida di un microscopio da dissezione e utilizzando un bisturi fresco, sezionare con cura la regione di sostanza bianca contenente la corsa, identificata da una veloce etichettatura Verde o perdita di tessuto. Rimuovere la corteccia sovrastante e sottostante striato, se lo desideri.

Risultati

Utilizzando il modello presentato, la sostanza bianca zampa anteriore sottostante sensomotorio corteccia può essere mirata in modo affidabile. Questo modello di ictus indotto chimicamente produce assonale focale e la perdita di mielina, astrocitosi, e microgliosis (figura 1), come è tipicamente visto in infarti lacunari umani. Utilizzando tre iniezioni, un modello clinicamente utile è stabilito con insufficienza presto compiti motori zampa anteriore ⁷ e una pi...

Discussione

Un certo numero di modelli precedenti di ictus sottocorticale sono stati descritti tra cui iniezioni focali di endotelina-1 nella capsula interna, sostanza bianca sottocorticale e striato nel ratto ^{6,15 12-14} e mouse. Modelli più recenti di piccoli colpi focali hanno utilizzato il colesterolo microemboli iniezione nella carotide ¹⁶ e l'occlusione photothrombotic di un singolo arteriole penetrante ^17. Ognuno di questi modelli presenta vantaggi e svantaggi ^5. Il m...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
L-N5-(1-Iminoetil)ornitina, dicloridrato	Calbiochem	400600-20MG
Isoflurano	Phoenix Pharmaceutical, Inc.	NDC 57319-559-06
Tubi capillari	World Precision Instruments	50-821-807
Picospritzer	Parker Strumentazione	Picospritzer II
Configurazione stereotassica	Kent Scientific	KSC51725
Estrattore di pipette	KOPF	Modello 720
Stereomicroscopio SZ51	Olympus	88-124
Forbici fini	Strumenti scientifici fini	14084-08
Pinze	Harvard Apparatus	PY2 72-8547
Pinze curve	Harvard Apparatus	PY2 72-8598
Strumento di dissezione smussato	Fine Scientific Tools	10066-15
Drill	Dremel	8220-1/28
Punte da trapano	Fine Strumenti scientifici	19007-05
Vetbond	3M	1469SB
Marcaina	HOSPIRA	NDC 0409-1610-50
Trimetoprim-Sulfamethaxole	STI Farmacia	NDC 54879-007-16
Fluororubino	Fluorocromo Inc	30 mg
Paraformaldeide	Fisher	O4042-500
Saccarosio	Fisher	BP220-10
Cryostat	Leica CM3050 S
Vetrini	Fisher	12-544-7
Fast Green	Microscopio da dissezione Sigma	F7252-5G
	Nikon	SMZ1500
23 G ago a farfalla	Fisher	14-840-35
10x Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14065056
1 M HEPES-KOH, pH 7,4	Affymetrix	16924
D-Glucose	Sigma	G8270
Bicarbonato di sodio	Sigma	S5761
Cicloexamide	Sigma	01810