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Articolo metodologico

Porphyromonas gingivalis come organismo modello per la Valutazione Interazione di batteri anaerobici con cellule ospiti

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⸱

DOI:

10.3791/53408

⸱

17 dicembre 2015

 , 
1Philips Institute for Oral Health Research, Virginia Commonwealth University, 2Department of Microbiology and Immunology, Virginia Commonwealth University, 3Department of Biochemistry, Virginia Commonwealth University

In questo articolo

Sommario

Questo articolo presenta due protocolli: uno per misurare i batteri anaerobi che possono invadere e sopravvivere con successo all'interno dell'ospite, e l'altro per visualizzare i batteri anaerobici che interagiscono con le cellule ospiti. Questo studio può essere applicato a qualsiasi anaerobo coltivabile e a qualsiasi tipo di cellula eucariotica.

Abstract

I batteri anaerobici lontano superano aerobi in molte nicchie umani, come l'intestino, bocca e vagina. Inoltre, infezioni anaerobiche sono comuni e spesso di origine indigena. La capacità di alcuni agenti patogeni anaerobici di invadere le cellule umane dà loro misure di adattamento per sfuggire immunità innata nonché per modulare il comportamento della cellula ospite. Tuttavia, garantire che i batteri anaerobici sono vivo durante un'indagine sperimentale degli eventi che può porre problemi. Porphyromonas gingivalis, un anaerobio Gram-negativi, è in grado di invadere una varietà di cellule non fagocitiche eucariotiche. In questo articolo viene descritto come con successo la cultura e valutare la capacità di P. gingivalis di invadere le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC). Sono stati sviluppati due protocolli: uno per misurare batteri che possono con successo invadere e sopravvivere all'interno dell'ospite, e l'altro per visualizzare i batteri interagiscono con le cellule ospiti. Queste tecniche richiedono l'uso di un anaeRobic camera per la fornitura di P. gingivalis con un ambiente anaerobico per la crescita ottimale.

Il primo protocollo si basa sulla misurazione di protezione antibiotico, che è ampiamente utilizzato per studiare l'invasione delle cellule ospiti da batteri. Tuttavia, il saggio di protezione antibiotico è limitata; solo i batteri intracellulari che sono coltivabili a seguito di trattamento antibiotico e lisi della cellula ospite sono misurati. Per valutare tutti i batteri interagiscono con le cellule ospiti, sia vivi e morti, abbiamo sviluppato un protocollo che utilizza il microscopio a fluorescenza per esaminare l'interazione ospite-patogeno. I batteri sono fluorescente con 2 ', 7'-Bis- (2-carbossietil) -5- (e-6) -carboxyfluorescein acetossimetil estere (BCECF-AM) e utilizzato per infettare cellule eucariotiche in condizioni anaerobiche. Dopo fissazione con paraformaldeide e permeabilizzazione con 0,2% Triton X-100, cellule ospiti sono etichettati con TRITC falloidina e DAPI etichettare citoscheletro cellulare e nucleo, rispettivamente. Molteplici images prelevati in differenti punti focali (Z-stack) sono ottenuti per la visualizzazione spazio-temporale dei batteri. I metodi utilizzati in questo studio possono essere applicati a qualsiasi anaerobio coltivabili e qualsiasi tipo di cellula eucariotica.

Introduzione

Batteri anaerobici colonizzano quasi tutte le superfici del corpo umano. Sebbene predominante nella flora dei tratti intestinali e genito-urinario in cui le concentrazioni di ossigeno sono bassi, esistono anche ad alti livelli sulla pelle, bocca, naso e gola 1. I batteri anaerobici sono una causa comune di infezioni endogene e sono spesso isolati da siti malati. Tuttavia, a causa della loro natura esigente, anaerobi possono essere difficili da isolare e cultura. Gli studi che coinvolgono batteri anaerobi devono essere effettuate in condizioni ristrette. Tecniche anaerobico-cultura moderna permettono ai ricercatori di imitare le impostazioni anaerobici necessarie per studiare molti ceppi di laboratorio anaerobica o addirittura isolati clinici 2,3.

Batteri anaerobi patogeni hanno sviluppato un rapporto dinamico e co-evoluzione con le cellule ospiti in cui risiedono. La maggior parte degli anaerobi sono suscettibili di aver ucciso dalla risposta immunitaria dell'ospite prima di raggiungere infectii livelli di unità organizzative. Tuttavia, alcuni batteri patogeni hanno sviluppato meccanismi per sfuggire o sovvertire la risposta immunitaria dell'ospite. Compiono questo obiettivo attraverso meccanismi quali l'evasione del riconoscimento immunitario, la neutralizzazione dei mediatori immunitari, alterazione di immunità cellulo-mediata, l'invasione delle cellule ospiti e l'alterazione delle immunitario segnalazione 4. Porphyromonas gingivalis, un anaerobio gram-negativi implicati sia orale e malattie extraorali, è un esempio di un batterio patogeno altamente adattato in grado di provocare cambiamenti patogeni nell'ospite 5-7.

Sacche di biofilm placca accantonati in profonde fessure formatesi tra i denti e tessuto mucoso gengivale può ospitare batteri anaerobici che sono protetti dall'ossigeno atmosferico 8. Queste tasche parodontali servono come una nicchia per vari patogeni anaerobici, come P. gingivalis 9. P. gingivalis è un patogeno chiave di volta che è in grado di rimodellareing comunità microbica orale in modo da promuovere lo sviluppo e la progressione delle malattie parodontali 10. Produce un gran numero di fattori di virulenza che sono attivi contro un ampio spettro di proteine ​​dell'ospite e fornisce meccanismi per evasione di difese dell'ospite 11. È anche in grado di invadere epiteliali, endoteliali, fibroblasti e cellule del legamento parodontale in vitro e in vivo 12-14 15. Con efficacemente invadere cellule ospiti, P. gingivalis può sfuggire immunità dell'ospite. Invasione efficace delle cellule ospiti non solo permette al batterio di sfuggire difese dell'ospite ma serve anche da serbatoio per il futuro reinfezione e altera la cellula ospite. Sono necessari studi sui meccanismi molecolari coinvolti nella adesione e internalizzazione del batterio da cellule ospiti. La ricerca in diversi laboratori è focalizzata sulla comprensione degli eventi molecolari associati con l'internalizzazione di P. gingivalis da parte delle cellule ospitinonché i meccanismi utilizzati per sopprimere e dirottare la risposta immunitaria e sopravvivere i meccanismi di difesa dell'ospite ostili.

Ci sono molti saggi in grado di identificare e caratterizzare agenti patogeni che sono in grado di invadere cellule ospiti. Tuttavia, studi in vitro con patogeni anaerobici presentano molti problemi sperimentali per il ricercatore principalmente perché è difficile da eseguire studi che si basano su strumenti ingombranti in assenza di ossigeno. La situazione è aggravata dal fatto che le cellule eucariotiche hanno bisogno di ossigeno per crescere e quindi devono essere preparati separatamente in incubatori di coltura dei tessuti. Un modo per evitare tali ostacoli sarebbe quella di effettuare gli studi sotto ossigeno atmosferico, ma che avrebbe fatto la crescita di batteri anaerobi impossibile. Un altro metodo sarebbe quello di utilizzare i batteri ucciso al calore di infettare e studiare le interazioni ospite-cellulari. Tuttavia, esistono delle differenze tra batteri ucciso al calore e vitali che diminuiscono la pertinenza della dello s ospite-patogenosu 16. E 'centrale per studiare batteri vitali con l'espressione inalterata l'interazione con le cellule ospiti; quindi, i metodi per la coltura di P. gingivalis in un ambiente anaerobico sono dati. Inoltre, sono dimostrati due protocolli convenienti semplici per valutare la capacità di P. gingivalis da interiorizzato da vena cellule umane endoteliali (ombelicali HUVECs). Il primo protocollo si basa sul popolare protection assay antibiotico. Anche se il test è semplice, le considerazioni quando si utilizza microrganismi anaerobi sono dati. Il secondo protocollo richiede l'uso di un microscopio a scansione a fluorescenza per visualizzare interagire e internalizzata P. gingivalis. Ogni test ha i suoi limiti e vantaggi che verranno discusse a rilasciare al ricercatore uno schema per studiare l'invasività dei batteri anaerobici. Anche se il manoscritto corrente studia P. gingivalis e HUVEC, questi protocolli possono essere usati per molti altri batteri anaerobici ecome per altri tipi di cellule ospiti.

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Protocollo

I seguenti protocolli descrivono i metodi per la coltura e lo studio l'invasione da parte della specie anaerobiche, P. gingivalis; Tuttavia, possono essere utilizzati tali protocolli per un certo numero di agenti patogeni anaerobici. Anche se vengono utilizzati HUVECs, questo protocollo può essere utilizzato per altre cellule eucariotiche sia immunitarie e non immuni.

1. anaerobica Camera uso e manutenzione

Nota: P. gingivalis è un anaerobio sensibile ai normali livelli di ossigeno riscontrati nell'aria ambiente. Un ambiente anaerobico controllato è di vitale importanza per la coltivazione del P. gingivalis.

  1. Qui, mantenere un'atmosfera artificiale designato come gas anaerobico misto (80% N 2, 10% H 2, 10% CO 2) in una camera di vinile anaerobica (Figura 1A). Utilizzare una camera di compensazione (Figura 1B) per trasferire oggetti dall'ambiente di laboratorio alla camera anaerobica. La camera di compensazione opera manualmente, twspurgo ghiaccio con N 2 gas prima di introdurre il gas misto anaerobico.
  2. Utilizzare una colonna di rimozione dell'idrogeno solforato (Figura 1C) per la rimozione del solfuro di idrogeno indesiderabile senza manutenzione. Collocare un deumidificatore entro la camera per rimuovere H 2 O creato dal catalizzatore e per evitare aerosol che facilitano la diffusione della contaminazione.
    Nota: L'idrogeno solforato è un sottoprodotto metabolico naturale di molti batteri anaerobici e l'accumulo è tossica per i batteri e può provocare danni all'elettronica e diminuire la durata di un catalizzatore.
  3. Utilizzare una scatola ventilatore per far circolare l'atmosfera della camera attraverso un catalizzatore di palladio, che rimuove l'ossigeno in presenza di idrogeno (Figura 1D).
    Nota: Un atmosferico (HEPA) ricircolo rimuove i contaminanti presenti nell'aria con una dimensione di 0,22 micron o più grandi.
  4. Batteri anaerobici cultura a 37 ° C incubatore che si trova all'interno del anaerobicacamera. Utilizzare tecniche asettiche standard, quando si lavora all'interno della camera anaerobica.

figure-protocol-1
Figura 1. camera anaerobica vinile e dei suoi componenti. (A) Una camera anaerobica vinile sigillato completamente dall'ossigeno atmosferico fornisce spazio di lavoro per due persone alla volta (32 in x 78 in). Contiene un incubatore a 37 ° C (posteriore centrale). (B) una camera di compensazione è utilizzato per il trasferimento di articoli dalla ambiente di laboratorio alla camera anaerobica. Nell'immagine è una camera di compensazione automatica gestito tramite un controller che può essere programmato per eseguire automaticamente le procedure di vuoto e spurgo necessarie per creare un ambiente anaerobico. (C) Un acido solfidrico Colonna rimozione fornisce rimozione elevata capacità esente da manutenzione di indesiderabile idrogeno solforato. (D) Due contenitori di fan catalizzatore sonoposto in tutta la camera anaerobica per favorire la circolazione dell'atmosfera della camera attraverso il palladio catalizzatore, che, in presenza di idrogeno, rimuove l'ossigeno. La camera di anaerobico è impostato secondo le istruzioni del produttore. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

2. Preparazione di batteri anaerobici

Nota: P. gingivalis è aerotolleranti e può essere conservato in condizioni aerobiche, ma non crescerà in presenza di ossigeno a livelli superiori a 6% 17,18. Una camera anaerobica è necessario per il corretto coltivazione di P. gingivalis e altre specie anaerobiche (Figura 1). È necessaria una formazione adeguata e di educazione sull'uso camera anaerobica prima di lavorare con microanaerobes 19.

  1. Equilibrare tutti i liquidi e le piastre a condiz anaerobicaioni per almeno 12 ore prima della sperimentazione per rimuovere l'ossigeno residuo.
  2. Trasferimento P. gingivalis da -80 ° C freezer alla camera anaerobica, lasciate disgelo.
  3. Streak P. gingivalis su piastre di agar sangue soia Trypticase (TSA II con il 5% di sangue di montone). Wrap piastre in parafilm e conservare a 37 ° C in un incubatore anaerobico per 4-7 giorni.
  4. Seminare P. gingivalis in 3 ml di Brain Heart Infusion (BHI) brodo integrate con emina e menadione, un arricchiti terreni liquidi non selettivi per l'isolamento e la coltura di anaerobi e microrganismi esigenti, usando i loop sterili.
    Nota: Per la conservazione a lungo termine, mescolare colture batteriche preparate in BHI con glicerolo o DMSO (concentrazione finale 10-20%) e posto in una -80 ° C freezer.
  5. Preparare una coltura starter di P. gingivalis facendo una diluizione 1:10 e permettendo ai batteri di crescere fino a metà fase di log.

Nota: La densità ottica del bacsospensione riale è determinato e la concentrazione di batteri per ogni ceppo da esaminare viene regolata. Per P. gingivalis una sospensione a OD 660 di 0,7 corrisponde alla fase di mid-log e ~ 7 x 10 8 cellule / ml. Condizioni di crescita descritte nel protocollo di cui sopra sono specifici per P. gingivalis e potrebbero dover essere adattato per altri ceppi batterici.

3. Endothelial Cell Culture

Nota: Acquisto pool HUVECs primarie e cultura a medio basale contenenti fattori di crescita endoteliale vascolare (VEGF) a 37 ° C in 5% di CO 2 in base alle istruzioni del produttore.

  1. HUVECs Seed in T-75 palloni a 2.5 x 10 5 cellule / fiasco in 15 ml mezzi VEGF.
    Nota: Controllare la redditività attraverso una diluizione 1: 1 con il 4,0% trypan blu. Le cellule con una membrana compromessa manterrà trypan blu, le cellule sane con membrana è ancora intatta appariranno bianco se visti al microscopio ottico binoculare. Count 100 cellule, in modo che oltre l'80% delle cellule sono vitali 20.
  2. Sostituire i media ogni 2 giorni con pre-riscaldato supporti VEGF fresco fino a cellule raggiungono ~ 80% di confluenza.
  3. Lavare le cellule una volta con PBS preriscaldata. Liberate cellule dal matraccio T75 incubando con 2 ml di tripsina-EDTA (0,25%) per 5 min seguita da soluzione neutralizzante 2 ml di tripsina.
  4. Raccogliere HUVECs sospesi in un tubo da 50 ml. Lavare le cellule in più dal T-75 palloni con PBS e trasferire 50 ml provette coniche.
  5. Cellule centrifugare a 200 xg per 10 min.
  6. Rimuovere il surnatante, sospendere pellet cellulare in 10 ml di media VEGF pre-riscaldato.
  7. Determinare la concentrazione cellulare mediante un emocitometro o un dispositivo simile conteggio delle cellule.
  8. Calcola quantità di sospensione cellulare per aggiungere a uno 6-pozzetti (400.000 / pozzetto) o 12-pozzetti con coprioggetto (50.000 / pozzetto). HUVECs sarà pronto per la sperimentazione del giorno successivo.

4. La sopravvivenza Assay Invasion / Interazione(Placcatura)

Nota: Quando si esegue questo test, preparare due 6 pozzetti delle cellule endoteliali seminate a 400.000 cellule / pozzetto. Una piastra sarà utilizzato per valutare batteri attaccati da e interiorizzati da cellule ospiti. L'altra piastra rappresenterà per i batteri intracellulari. La piastra da 6 pozzetti consente triplicato di due campioni da eseguire in un esperimento. Per una descrizione di questo protocollo fare riferimento al diagramma di flusso del test di sopravvivenza (Figura 2).

  1. Preparare batteri anaerobici come sopra descritto (vedi capitolo 1) fino a raggiungere una crescita mid-log (OD 660 0,5-0,7).
  2. Batteri centrifugare a 5.000 g per 10 min.
    Nota: se centrifuga è al di fuori della camera anaerobica, trasportare i campioni batterici in un tubo ben chiuso da 15 ml, avvolgere il tappo con parafilm per evitare perdite di ossigeno.
  3. Posizionare pellettato P. gingivalis indietro nella camera, scartare il surnatante. Lavare con PBS, batteri pellet di nuovo prima di risospendere in VEGF media. Preparare sospensioni per tutti i ceppi batterici da testare a OD 660 di 0,7 che corrisponde alla fase di mid-log (~ 7 x 10 8 cellule / ml). I batteri sono ora pronti per l'infezione.
  4. Trasferimento 6-pozzetti contenenti HUVECs dal tessuto cultura incubatore nella camera anaerobico. Rimuovere i supporti e lavare tre volte con PBS anaerobica. Aggiungere 2 ml di media VEGF anaerobica in ciascun pozzetto e posizionare le piastre a 37 ° C in incubatore anaerobico per 20 min per equilibrare la temperatura per l'infezione.
    Nota: i batteri piastra su piastre di agar sangue per garantire quelli utilizzati per le infezioni sono omogenei e non contaminati dopo l'infezione.
  5. Infect cellule ospiti con batteri ad una molteplicità di infezione (MOI batteri: host) di 100: 1.
    Nota: numero di cellule HUVEC è determinato eseguendo un test di esclusione del trypan una singola ben prima dell'infezione. Numero di cellule batteriche viene determinata mediante densità ottica (ad esempio, 0,5 OD = 5 x 10 8 cellule / ml). Bconcentrazione acterial viene regolato alla corretta MOI basato sulla concentrazione HUVECs 21.
  6. Mettere 6 pozzetti con HUVECs infetti in incubatrice anaerobica e permettono ai batteri di interagire con le cellule ospiti per 30 min.
  7. Preparare saponina in BHI (1,0% w / v) all'interno della camera anaerobica e filtrata attraverso un filtro da 0,2 micron.
  8. La sopravvivenza di entrambi i batteri attaccati e interiorizzato.
    1. Rimuovere le piastre dal termostato, i media aspirare, lavare tre volte con anaerobica PBS e aggiungere 2 ml di filtrati 1,0% saponina (preparato come descritto al punto 4.8). Incubare per 15 minuti per consentire la lisi della cellula ospite.
    2. Raschiare fondo di ogni pozzetto con raschietto cellulare. Raccogliere la miscela di cellule da ciascun pozzetto e fare una diluizione 1: 1 in BHI.
    3. Procedere per fare diluizioni seriali del campione. A seconda delle specie batteriche e concentrazione, regolare diluizioni seriali. Iniziare con 1: 100 o 1: 1.000 diluizioni.
    4. Piatto 200 ml di diluizione desiderata su piastre di agar sangue. Wrap tegli piastre in parafilm e posto in incubatrice anaerobica a 37 ° C.
    5. A seguito di sette giorni di incubazione a 37 ° C, rimuovere le piastre e contare unità formanti colonie (CFU) utilizzando una scatola luminosa di contare manualmente colonie.
      Nota: CFU vengono enumerati. Per grandi quantità di CFU, le immagini possono essere prese e software possono essere utilizzati per facilitare l'enumerazione di CFU.
  9. La sopravvivenza dei batteri interiorizzato.
    1. Rimuovere le piastre dal termostato. Lavare tre volte con PBS e anaerobica aggiungere media 2 ml di VEGF con integrate antibiotici (300 mg / ml di gentamicina e 400 ug / ml di metronidazolo).
    2. Incubare per 1 ora. Assicurati di testare gli antibiotici in modo che siano al 100% efficace nell'uccidere il ceppo batterico desiderato e fare in modo che essi non penetrano le cellule ospiti 22,23.
    3. Aspirare il terreno, aggiungere 2 ml di filtrato 1,0% saponina. Incubare per 15 minuti per consentire la lisi della cellula ospite.
    4. Raschiare inferiore di ogni well con raschietto cellulare. Raccogliere la miscela di cellule da ciascun pozzetto e rendere diluizione 1: 1 in BHI.
    5. Preparare diluizioni seriali del campione (1: 100, 1: 1000).
    6. Piatto 200 ml di diluizione desiderata su piastre di agar sangue. Avvolgere piastre in parafilm e posto in incubatrice anaerobica.
    7. Dopo sette giorni di incubazione a 37 ° C togliere piastre e contare CFU.

figure-protocol-2
Figura 2. Rappresentazione schematica di un protocollo utilizzato per la sopravvivenza dei batteri anaerobici con cellule eucariotiche. Entrambi i test per una sopravvivenza batterica totale e la sopravvivenza di batteri internalizzati possono essere eseguite contemporaneamente. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

5. internalizzazione di batteri in Ce HostLLS (Fluorescent Microscopy)

Nota: P. gingivalis è etichettato con 2 ', 7'-Bis- (2-carbossietil) -5- (e-6) -Carboxyfluorescein, acetossimetil Ester (BCECF-AM). BCECF-AM è un colorante membrana permeabile non fluorescente; la sua conversione a BCECF fluoresceina tramite l'azione di esterasi intracellulari può indicare la vitalità cellulare. P. gingivalis è etichettato con il BCECF-AM colorante e poi utilizzato per infettare le cellule eucariotiche. A seguito di infezione, le cellule vengono fissate ed etichettati con DAPI e TRITC-falloidina. La macchia DAPI utilizzato per colorare il nucleo della cellula eucariotica anche etichettare nucleo della cellula batterica, che fornisce una contromisura per identificare i batteri non vitali che non possono metabolicamente fendere BCECF-AM. Cellule ospiti sono evidenziati con TRITC-falloidina, un actina colorante rosso.

  1. Coprioggetti Autoclave. Aggiungere asetticamente coprioggetti a piastre da 12 pozzetti prima della semina cellule endoteliali a 5 x 10 4 cellule / pozzetto. (Giorno preparati prima dell'esperimento)
  2. hanno cellule endoteliali preparati su 18 mm (# 1.5) spessore coprioggetto circolari in piastre da 12 pozzetti come descritto sopra.
  3. Preparare batteri anaerobici cresciuti a metà fase di log (OD 660 = 0,5-0,7), come descritto nella sezione 1.
  4. Batteri Lavare 2x con PBS anaerobica per centrifugazione a 5.000 xg e sospende pellet in PBS a 5-7 x 10 8 cellule / ml.
  5. Aggiungere 20 ml di 0,2 mM BCECF-AM a 2 ml di sospensione batterica (5-7 x 10 8 cellule / ml) ad una concentrazione finale di BCECF-AM di 2 mM.
  6. Incubare a 37 ° C per 30 minuti al buio.
  7. Piastre di trasferimento con le cellule endoteliali seminate su 18 mm (# 1.5 spessore) lamelle circolari dal coltura tissutale incubatore nella camera anaerobico. Lavare con PBS e scambio con i media VEGF anaerobica.
    Nota: Verificare che HUVECs sono sani al microscopio ottico. HUVECs dovrebbe essere ~ 80% confluenti, morfologia dovrebbe essere paragonabile ai produttori.
  8. Centrifuga etichettato batteri a5.000 xg per 10 min per rimuovere residui di colorante BCECF-AM. Sospendere in 2 ml di mezzi VEGF anaerobica.
  9. Infettare le cellule ospiti con batteri etichettati a MOI di 100: 1 (batteri: host).
  10. Incubare in ambiente anaerobico a 37 ° C per 30 min.
  11. Dopo che le cellule lavare infezione con PBS per tre volte e fissare in preparati al momento 4,0% paraformaldeide per 10 min.
    Nota: Dopo aver fissato le cellule, esperimento può essere condotto all'esterno della camera anaerobica.
  12. Lavare coprioggetto con PBS per tre volte.
  13. Aggiungere 1 ml di 0,2% Triton X-100 per 10 min.
  14. Lavare coprioggetto con PBS per tre volte.
  15. Aggiungere 50 ml di TRITC falloidina (50 mg / ml) per vetrini per 45 min.
  16. Lavare coprioggetto tre volte, togliere dal 12-pozzetti e posto su un vetrino con mezzo di montaggio morbido-set contenente DAPI. Sigillare i lati con smalto.
    Nota: vetrini possono essere conservati per un paio di mesi al buio. Evitare l'esposizione alla luce per evitare che foto-sbiancamento.
  17. Vista diapositiveutilizzando un microscopio confocale.
    1. Qui, utilizzare un sistema di 34 canali spettrali (rivelatore a serie di 32 canali e due rivelatori PMT lato, oltre a un rilevatore di luce trasmessa) configurato attorno ad un AxioObserver (invertito) stare con uno stadio XY motorizzato. Il sistema dispone di cinque laser: diodo blu (405 nm), multi-linea Argon (458, 488, 514 nm), LED verde (561 nm), rosso HeNe (633 nm) e un laser pulsato 440 nm. Dotare di un sistema di imaging a vita a fluorescenza con 2 rilevatori GaAsP ibridi (per FRET-FLIM).
    2. Rileva la fluorescenza da DAPI e TRITC in un canale usando un filtro dual-band con lunghezze d'onda di eccitazione di 340-380 nm e 540-560 nm, ed un filtro per le emissioni di 435-485 nm e 570-590 nm, rispettivamente. Rileva la fluorescenza da BCECF-AM utilizzando un filtro di eccitazione con lunghezza d'onda di 440-500 nm e un filtro di emissione di 510-590 nm.
      Nota: Controlli per BCECF-AM dovrebbe essere fatto su ogni ceppo batterico in fase di studio per garantire la corretta etichettatura dei batteri vitali. In primo luogo verificare che nonviabbatteri LE sono DAPI-positivi e BCECF-negativi. In secondo luogo, in modo che batteri vivi possono metabolizzare BCECF-AM in fluoresceina BCECF. Concentrazioni variabili dei batteri o BCECF-AM dye possono avere bisogno di essere testati per l'etichettatura ottimale.

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Risultati

Protocolli di cui sopra sono stati utilizzati nello studio interazione ospite-patogeno tra P. gingivalis e cellule endoteliali. P. gingivalis W83 e un P. gingivalis V3150 portando una delezione di PG0228 stati utilizzati nello studio. Il PG0228 è previsto per codificare una proteina che può alterare i livelli di RNA e proteine, che possono incidere in definitiva interazione di P. gingivalis con cellule ospiti. Per studiare l'effetto di PG0228 su P. capacità di interagire ...

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Discussione

Tutti i metodi di cui sopra possono essere utilizzati per progettare saggi specifici per valutare l'interazione di batteri anaerobici con cellule eucariotiche. Tuttavia, ci sono diverse considerazioni per eseguire con successo gli esperimenti. Innanzitutto sono i ceppi microbici essere utilizzati in uno studio.

E 'fondamentale nel confronto di due ceppi sia con il saggio di sopravvivenza come anche per microscopia che sono in fase di crescita simili e raggiungono concentrazioni cellu...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare il Dr. Hiroshi Miyazaki, il Dr. Scott Henderson, il Dr. Todd Kitten, il Dr. Justin Hutcherson, la Dr. Catherine Jauregui e Collin R. Berry. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni NIH NIDCR R01DE016124, R01DE018039 e R01DE023304 a J.P. Lewis.

La microscopia è stata eseguita presso il Dipartimento di Anatomia e Microscopia di Neurobiologia della VCU, supportata, in parte, con finanziamenti dal NIH-NINDS Center core grant (5P30NS047463).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Camera anaerobica in vinile-Tipo BProdotti da laboratorioModello 2000 incubatore 
TSA II Trypticase Ay Agar con il 5% di sangue di pecoraBBL221261
Cellule endoteliali della vena ombelicale umana PoolLifeLine TechnologyFC-0044
VascuLife VEGF Medium Kit completoLifeLine TechnologyLL-0003
TrypKitLifeLineLL-0013
SaponinaRiedel-de Haen16109
Gentamicina solfato saleSigma-AldrichG-1264
MetronidazoloSigma-AldrichM-3761
BCECF-AMLifeTechnologiesB1150
TRITC falloidina Sigma-AldrichP1951
18 mm Vetrini coprioggetti circolari Microscopiaelettronica Sciences72222-01
Mezzo di montaggio VectaShield con DAPIVector LaboratoriesH-1200
timidi

Riferimenti

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