Questo articolo presenta due protocolli: uno per misurare i batteri anaerobi che possono invadere e sopravvivere con successo all'interno dell'ospite, e l'altro per visualizzare i batteri anaerobici che interagiscono con le cellule ospiti. Questo studio può essere applicato a qualsiasi anaerobo coltivabile e a qualsiasi tipo di cellula eucariotica.
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Articolo metodologico
Porphyromonas gingivalis come organismo modello per la Valutazione Interazione di batteri anaerobici con cellule ospiti
In questo articolo
Sommario
Abstract
I batteri anaerobici lontano superano aerobi in molte nicchie umani, come l'intestino, bocca e vagina. Inoltre, infezioni anaerobiche sono comuni e spesso di origine indigena. La capacità di alcuni agenti patogeni anaerobici di invadere le cellule umane dà loro misure di adattamento per sfuggire immunità innata nonché per modulare il comportamento della cellula ospite. Tuttavia, garantire che i batteri anaerobici sono vivo durante un'indagine sperimentale degli eventi che può porre problemi. Porphyromonas gingivalis, un anaerobio Gram-negativi, è in grado di invadere una varietà di cellule non fagocitiche eucariotiche. In questo articolo viene descritto come con successo la cultura e valutare la capacità di P. gingivalis di invadere le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC). Sono stati sviluppati due protocolli: uno per misurare batteri che possono con successo invadere e sopravvivere all'interno dell'ospite, e l'altro per visualizzare i batteri interagiscono con le cellule ospiti. Queste tecniche richiedono l'uso di un anaeRobic camera per la fornitura di P. gingivalis con un ambiente anaerobico per la crescita ottimale.
Il primo protocollo si basa sulla misurazione di protezione antibiotico, che è ampiamente utilizzato per studiare l'invasione delle cellule ospiti da batteri. Tuttavia, il saggio di protezione antibiotico è limitata; solo i batteri intracellulari che sono coltivabili a seguito di trattamento antibiotico e lisi della cellula ospite sono misurati. Per valutare tutti i batteri interagiscono con le cellule ospiti, sia vivi e morti, abbiamo sviluppato un protocollo che utilizza il microscopio a fluorescenza per esaminare l'interazione ospite-patogeno. I batteri sono fluorescente con 2 ', 7'-Bis- (2-carbossietil) -5- (e-6) -carboxyfluorescein acetossimetil estere (BCECF-AM) e utilizzato per infettare cellule eucariotiche in condizioni anaerobiche. Dopo fissazione con paraformaldeide e permeabilizzazione con 0,2% Triton X-100, cellule ospiti sono etichettati con TRITC falloidina e DAPI etichettare citoscheletro cellulare e nucleo, rispettivamente. Molteplici images prelevati in differenti punti focali (Z-stack) sono ottenuti per la visualizzazione spazio-temporale dei batteri. I metodi utilizzati in questo studio possono essere applicati a qualsiasi anaerobio coltivabili e qualsiasi tipo di cellula eucariotica.
Introduzione
Batteri anaerobici colonizzano quasi tutte le superfici del corpo umano. Sebbene predominante nella flora dei tratti intestinali e genito-urinario in cui le concentrazioni di ossigeno sono bassi, esistono anche ad alti livelli sulla pelle, bocca, naso e gola 1. I batteri anaerobici sono una causa comune di infezioni endogene e sono spesso isolati da siti malati. Tuttavia, a causa della loro natura esigente, anaerobi possono essere difficili da isolare e cultura. Gli studi che coinvolgono batteri anaerobi devono essere effettuate in condizioni ristrette. Tecniche anaerobico-cultura moderna permettono ai ricercatori di imitare le impostazioni anaerobici nece....
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Protocollo
I seguenti protocolli descrivono i metodi per la coltura e lo studio l'invasione da parte della specie anaerobiche, P. gingivalis; Tuttavia, possono essere utilizzati tali protocolli per un certo numero di agenti patogeni anaerobici. Anche se vengono utilizzati HUVECs, questo protocollo può essere utilizzato per altre cellule eucariotiche sia immunitarie e non immuni.
1. anaerobica Camera uso e manutenzione
Nota: P. gingivalis è un anaerobio sensibile ai normali livelli di ossigeno riscontrati nell'aria ambiente. Un ambiente anaerobico controllato è di vitale importanza per la coltivazi....
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Risultati
Protocolli di cui sopra sono stati utilizzati nello studio interazione ospite-patogeno tra P. gingivalis e cellule endoteliali. P. gingivalis W83 e un P. gingivalis V3150 portando una delezione di PG0228 stati utilizzati nello studio. Il PG0228 è previsto per codificare una proteina che può alterare i livelli di RNA e proteine, che possono incidere in definitiva interazione di P. gingivalis con cellule ospiti. Per studiare l'effetto di PG0228 su P. capacità di interagire .......
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Discussione
Tutti i metodi di cui sopra possono essere utilizzati per progettare saggi specifici per valutare l'interazione di batteri anaerobici con cellule eucariotiche. Tuttavia, ci sono diverse considerazioni per eseguire con successo gli esperimenti. Innanzitutto sono i ceppi microbici essere utilizzati in uno studio.
E 'fondamentale nel confronto di due ceppi sia con il saggio di sopravvivenza come anche per microscopia che sono in fase di crescita simili e raggiungono concentrazioni cellu.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il Dr. Hiroshi Miyazaki, il Dr. Scott Henderson, il Dr. Todd Kitten, il Dr. Justin Hutcherson, la Dr. Catherine Jauregui e Collin R. Berry. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni NIH NIDCR R01DE016124, R01DE018039 e R01DE023304 a J.P. Lewis.
La microscopia è stata eseguita presso il Dipartimento di Anatomia e Microscopia di Neurobiologia della VCU, supportata, in parte, con finanziamenti dal NIH-NINDS Center core grant (5P30NS047463).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Camera anaerobica in vinile-Tipo B | Prodotti da laboratorio | Modello 2000 incubatore | |
| TSA II Trypticase Ay Agar con il 5% di sangue di pecora | BBL | 221261 | |
| Cellule endoteliali della vena ombelicale umana Pool | LifeLine Technology | FC-0044 | |
| VascuLife VEGF Medium Kit completo | LifeLine Technology | LL-0003 | |
| TrypKit | LifeLine | LL-0013 | |
| Saponina | Riedel-de Haen | 16109 | |
| Gentamicina solfato sale | Sigma-Aldrich | G-1264 | |
| Metronidazolo | Sigma-Aldrich | M-3761 | |
| BCECF-AM | LifeTechnologies | B1150 | |
| TRITC falloidina | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 18 mm Vetrini coprioggetti circolari Microscopia | elettronica Sciences | 72222-01 | |
| Mezzo di montaggio VectaShield con DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
Riferimenti
- Hentges, D. J. The Anaerobic Microflora of the Human Body. Clin. Infect. Dis. 16 (4), S175-S180 (1993).
- Willis, A. T. Anaerobic bacteriology: clinical and laboratory practice. , (2014).
- Wren, M. W., Baldwin, A. W., Eldon, C. P., Sanderson, P. J.
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Ristampe e permessi
