Acqua in emulsioni olio: un nuovo sistema di montaggio idrosolubili proteine ​​clorofilla vincolante con pigmenti idrofobi

Sommario

Questo manoscritto descrive un metodo semplice e ad alta produttività per assemblare proteine ​​solubili in acqua con pigmenti idrofobiche che è basato su emulsioni acqua-in-olio. Dimostriamo l'efficacia del metodo per l'assemblaggio di clorofille nativi con quattro varianti di ricombinante solubile in acqua-clorofilla proteine ​​leganti (WSCPs) di piante Brassica espressi in E. coli.

Abstract

Clorofille (Chls) e batterioclorofilla (BChls) sono i cofattori principali che effettuano la raccolta luce fotosintetica e di trasporto degli elettroni. La loro funzionalità dipende in modo critico dalla loro specifica organizzazione all'interno di grandi ed elaborati complessi proteici multisubunit transmembrana. Per comprendere a livello molecolare come questi complessi facilitano conversione dell'energia solare, è essenziale comprendere proteina-pigmento, e le interazioni pigmenti pigmento, e il loro effetto sulla dinamica eccitati. Un modo per ottenere questo senso sia costruendo e studiando complessi di Chls con semplici proteine ​​ricombinanti solubili in acqua. Tuttavia, incorporando le Chls lipofile e BChls in proteine ​​solubili in acqua è difficile. Inoltre, non esiste un metodo generale, che potrebbero essere utilizzati per l'assemblaggio delle proteine ​​solubili in acqua con pigmenti idrofobi. Qui, dimostriamo un sistema di throughput semplice ed alta basato su emulsioni acqua-in-olio, che consente assembly di proteine ​​solubili in acqua con Chls idrofobi. Il nuovo metodo è stato convalidato assemblando versioni ricombinanti della clorofilla proteina legante idrosolubile di Brassicaceae piante (WSCP) con Chl a. Dimostriamo l'assemblaggio di successo di Chl A utilizzando lisati grezzi di WSCP esprimono E. cellule coli, che può essere usato per sviluppare un sistema di screening genetico per nuove proteine ​​Chl-leganti idrosolubili, e per studi di interazione Chl-proteina e processi di assemblaggio.

Introduzione

pigmenti idrofobi, come clorofille (Chls), batterioclorofilla (BChls) e carotenoidi sono i cofattori primari in centri di reazione fotosintetici e le proteine ​​di raccolta di luce che effettuano trasporto di elettroni, e la cattura l'energia della luce e il trasferimento. I centri di reazione e la maggior parte dei complessi di raccolta della luce Chl-leganti sono proteine ​​transmembrana. La Fenna-Matthews-Olson (FMO) proteine ​​di batteri fotosintetici verde-zolfo non oxygenic ^1,2, e la proteina peridinina-Chl (PCP) dei dinoflagellati ³ sono esempi eccezionali di solubili in acqua proteine ​​luce raccolta. Il legame clorofilla proteine ​​solubili in acqua (WSCPs) di Brassicacee, Polygonaceae, Chenopodiaceae e piante Amaranthaceae ^{4, 5} sono un altro esempio unico, ma a differenza di FMO e PCP, questi non sono coinvolti nella raccolta della luce, né in alcuna della reazione fotosintetica primaria , e la loro precisa pHYfunzioni siological sono ancora poco chiari ^5-8. La loro alta affinità Chl vincolante hanno portato ad una funzione suggerito come portatori transitori di Chls e derivati ​​Chl ^9,10. In alternativa, è stato ipotizzato che WSCP svolge un ruolo nei collettori Chls in cellule danneggiate e protegge contro Chl-indotta danni photooxidative ^7,11-13. Più di recente, è stato suggerito che le funzioni WSCP come un inibitore della proteasi e svolge un ruolo durante la resistenza erbivoro e regola la morte delle cellule durante lo sviluppo del fiore ^14. WSCPs sono divisi in due classi principali in base alle loro proprietà fotofisiche. La prima classe (classe I, ad es. Da Chenopodium album) può subire fotoconversione su di illuminazione. WSCPs Classe II da piante del genere Brassica, che non subiscono fotoconversione ^5,10, sono ulteriormente suddivisi in classe IIa (ad es., Dalla Brassica oleracea, Raphanus sativus) e IIb (ad es., Da lepidium virginicum ). La struttura di classe IIb WSCP da lepidium virginicum è stato risolto con la cristallografia a raggi X con una risoluzione di 2.0 Å ^8. Si rivela un omotetramero simmetrica in cui le subunità proteiche formano un core idrofobico. Ogni subunità lega un singolo Chl che si traduce in una stretta disposizione di quattro Chls stipati all'interno delle core.This semplice tutti convenire Chl rende WSCPs un sistema modello potenzialmente utile per studiare vincolante e assemblaggio di complessi Chl-proteina, e gli effetti della vicina Chls e ambienti proteine ​​sulle proprietà spettrali ed elettroniche di singoli Chls. Inoltre, può fornire modelli per la costruzione di proteine ​​artificiali Chl vincolanti che possono essere utilizzati per i moduli che raccolgono la luce nei dispositivi fotosintetici artificiali.

Studi rigorosi di WSCPs nativi non sono realizzabili perché i complessi purificati da piante contengono sempre una miscela eterogenea di tetrameri con diverse combinazioni di Chl ae Chl b ^9. Pertanto, è necessario un metodo per assemblare WSCPs ricombinanti espresse con Chls in vitro. Questo è contestata dalla trascurabile idrosolubilità Chls che rende impossibile assemblare il complesso in vitro per semplice miscelazione dei apoproteine ​​idrosolubili con pigmenti in soluzioni acquose. In vitro assemblaggio miscelando i apoproteine ​​con membrane tilacoidi ¹⁵ è stata dimostrata, ma questo metodo è limitato al nativo Chls presente nei tilacoidi. Schmidt et al. riportato sul montaggio diversi derivati ​​Chl e BCHL con WSCP dal cavolfiore (CaWSCP) esprimendo una proteina ricombinante, istidina-marcato in E. coli immobilizzare esso su una colonna Ni-affinità e l'introduzione di strumenti derivati ​​Chl solubilizzati nei detergenti ^11. Con successo della ricostituzione di WSCPs ricombinanti da A. thaliana ^6, e cavolini di Bruxelles (BoWSCP), giapponese ravanello selvatico (RshWSCP) unsono stati anche riferito d Virginia pepperweed (LvWSCP) con un metodo simile.

Qui, vi presentiamo un romanzo, in generale, il metodo semplice per l'assemblaggio di Chls con WSCP che non richiede codifica o immobilizzare le proteine. Essa si basa sulla preparazione di emulsioni dalle loro soluzioni acquose dei apoproteine ​​idrosolubili in olio minerale. Le proteine ​​sono quindi incapsulati in acqua-in-olio (W / O) microgocce con un'elevata superficie in rapporto al volume ^16. I cofattori idrofobi vengono disciolti nell'olio e vengono facilmente introdotti nelle goccioline della fase oleosa. Riportiamo di utilizzare il metodo per l'assemblaggio di diverse varianti di apoproteine ​​WSCP ricombinante espresse in E. coli con Chl a. Dimostriamo il gruppo dal lisato grezzo di batteri WSCP-iperespressione che possono essere utilizzati come un sistema di screening per lo sviluppo di nuovi Chl proteine ​​leganti.

Protocollo

1. Preparazione Chl uno stock Solutions

1. PUNTO CRITICO: eseguire tutte le fasi della preparazione clorofilla in una cappa chimica, sotto luce verde (520 nm) o al buio, al fine di ridurre al minimo fotodanneggiamento. Aggiungere sempre azoto o argon prima del congelamento dei pigmenti per la conservazione. Assicurarsi che tutti i solventi sono grado analitico.
2. Pesare circa 5 mg di cellule Spirulina platensis liofilizzati o altre cellule cianobatterio che contengono solo Chl a nelle membrane tilacoidi e schiacciarlo con un mortaio e pestello.
3. Caricare cellule schiacciato su una colonna di vetro e lavare con circa 50-100 ml di 100% di acetone per rimuovere carotenoidi. Eliminare il arancione / verde frazione eluita.
   Nota: Se la frazione arancione non sia eluito con 100 ml di acetone continuano lavare le cellule con acetone fino frazione verde inizia ad eluire.
4. Scambio di acetone con il 100% di metanolo e raccogliere la frazione verde contenente Chl a. Il volume di fract eluitaioni può variare tra 50-100 ml. All'inizio, la frazione eluita ha un colore verde scuro, che cambia in verde pallido a fine eluizione. Quando il colore della frazione eluita si trasforma in verde pallido fermare l'eluizione.
5. Si evapora il metanolo usando un evaporatore rotante fino l'estratto è completamente asciutta. Non applicare calore alla soluzione; accertarsi che la temperatura bagnomaria dell'evaporatore non superi 30 ° C.
   Nota: Il tempo di evaporazione dipende dal volume della frazione metanolo essere evaporato e può variare tra 10-60 min. È importante asciugare completamente estratto.
6. Sciogliere i pigmenti estratto secco in un piccolo volume di etere dietilico (5-10 ml) e filtrata attraverso cotone idrofilo. Assicurarsi che i pigmenti sono completamente disciolti in etere prima del filtraggio.
7. Far evaporare l'etere etilico fino a quando i pigmenti sono completamente asciutti (10-30 min).
   Nota: I pigmenti secchi possono essere eliminati con e tenuti sotto azoto o argon a -20 ° C, al buio, fino al procedimento.
8. Sciogliere i pigmenti secchi nel minor volume possibile di 100% metanolo (circa 1 ml), anche se non tutto è completamente sospeso. Aggiungere 4 ml di acetone alla soluzione, e flick il vetro delicatamente per sciogliere completamente i pigmenti.
9. Usando una pipetta Pasteur, caricare il campione delicatamente su una colonna di DEAE Sepharose equilibrata in 100% acetone.
10. carotenoidi Eluire (una banda giallo-arancio) con il 100% di acetone. Poi, eluire Chl a (fascia verde) con 3: miscela 1 v / v acetone / metanolo.
    Nota: Il volume di acetone e la miscela acetone / metanolo è approssimativamente equivalente al volume di DEAE Sepharose caricata sulla colonna.
11. Verifica Chl purezza, in cromatografia su strato sottile utilizzando un 68: 25: 5: 2 diclorometano / n-esano / isopropanolo / metanolo (v / v) come eluente la miscela ^17.
12. Si evapora il solvente usando un evaporatore rotante fino alla Chl a completa asciugatura (10-60 min).
    Nota: Il secco Chl a poter essere spurgato con azoto o argon e conservati in atmosfera di argon a -20 ° C al buio.
13. Preparare Chl una soluzione stock di ri-dissoluzione secco Chl a in 2-4 ml di etanolo al 100%.
    Nota: Il coefficiente di estinzione di Chl a a 663 nm è 74.400 cm ^-1 M ^-1 (83,3 cm ^-1 (mg / ml) ^-1) in etanolo. Una tipica soluzione di riserva deve avere OD di 1.860 corrispondente ad una concentrazione di 25 mM (23 mg / ml). Aggiunta di 20 microlitri di questo stock da un'emulsione contenente 5 ml di fase organica, e 1 mg di WSCP in 1 ml di risultati di fase acquosa in una miscela con 10 volte eccesso molare di Chl a vs. WSCP.

2. Preparazione fase organica dell'emulsione

Nota: La fase organica dell'emulsione è composto da olio minerale contenente 4,5% (v / v) Span 80, e 0,4% (v / v) Tween 80.

1. Pesare in 50 ml tubo 0,2 g di Tween 80, 1,8 g di Span 80, e 38 g di olio minerale. Mescolare bene tutti i componenti e raffreddare su ghiaccio.
   Nota: La fase organica può essere memorizzato in 4 ° C fino ad una settimana.

3. Preparazione della fase acquosa dell'emulsione

Nota: La fase acquosa dell'emulsione può essere composto da uno WSCP purificato, o l'estratto grezzo di batteri iperesprimono WSCP.

1. Preparazione di una fase acquosa contenente WSCP purificata.
   1. Grow batteri E.coli BL21 contenenti WSCP plasmide ¹² in 1 L di terreno LB a 37 ° C fino a OD di 0.3-0.6.
   2. Indurre l'espressione delle proteine ​​con l'aggiunta di 1 mM IPTG. Dopo l'induzione crescere batteri a 30 ° C per 12-16 ore.
   3. batteri Harvest per centrifugazione a 5.000 xg per 10 minuti a 4 ° C.
   4. Sciogliere il pellet nel buffer e ultrasuoni vincolante sul ghiaccio (30 sec a 15 sec spento, cinque volte). Usare 10 ml di tampone per il pellet ottenuto dalla centrifugazione di 250 ml diterreno LB con cellule che sovraesprimono la proteina.
      Nota: A seconda del metodo di purificazione, il tampone di legame può essere composto da 100 mM tampone fosfato, pH 7,2 o 50 mM Tris, pH 7,5, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA.
   5. Centrifugare il lisato cellulare a 12.000 xg per 30 min a 4 ° C.
   6. Purificare WSCP mediante cromatografia di affinità. A seconda del tag fuso WSCP, purificare le proteine ​​ricombinanti utilizzando il sistema di cromatografia di affinità disponibile in commercio adatto per la purificazione della proteina seguendo le istruzioni del produttore.
   7. Per la preparazione dell'emulsione, utilizzare WSCP purificata in 50 mM tampone fosfato, pH 7,8. Assicurarsi che la quantità di proteine ​​finale usata per la ricostituzione è 0,5-1,0 mg per 1 ml di tampone.
2. Preparazione di una fase acquosa contenente lisato batterico grezzo con WSCP.
   1. Crescere le cellule di E.coli BL21 contenenti WSCP plasmide esprimente in 250 ml di terreno LB a 37 ° C fino a OD 0.3-0.6.
   2. Indurre l'espressione della proteina con1 mM IPTG e crescere i batteri notte a 30 ° C.
   3. cellule batteriche Harvest per centrifugazione a 5.000 xg per 10 minuti a 4 ° C.
   4. Sciogliere il pellet in 1-2 ml di 50 mM tampone fosfato di sodio pH 7,8, Sonicare (30 sec acceso, 15 sec off, tre volte) e centrifugare a 12.000 xg per 30 min a 4 ° C.
   5. Preparare la fase acquosa dell'emulsione mescolando 0,125 ml di surnatante con 0,875 ml di 50 mM sodio fosfato tampone pH 7.8.

4. Montaggio di WSCP con Chl a in emulsione

1. Transfer 5 ml di miscela olio-tensioattivo in una fiala di vetro e raffreddare in ghiaccio. Prima di pipettamento, verificare che tutti i componenti della fase organica vengono miscelati accuratamente e non vi è alcuna separazione di fase tra tensioattivi e olio minerale.
2. Aggiungere 1 ml di fase acquosa ghiacciata preparato come al punto 3 a 5 ml di fase organica.
3. Mescolare le due fasi usando un omogeneizzatore tessuto per 2 min a 9500 rpm su ghiaccio.
4. PUNTO CRITICO: Da questo punto in poi, eseguire tutte le ulteriori passi sotto la luce verde (520 nm) al fine di minimizzare fotodanneggiamento. Aggiungere 20 ml di 25 mM Chl una soluzione madre (vedi paragrafo 1.13) per l'emulsione. Disperdere muovendo e invertendo la fiala di vetro. Assicurarsi che il Chl è distribuito uniformemente in emulsione.
5. Incubare la emulsione per 1-2 ore in ghiaccio al buio.
6. Al fine di abbattere l'emulsione e goccioline di acqua separata dalla fase organica trasferire l'emulsione in provette di plastica da 1,5 ml e centrifugare a 14000 xg per 5 min a temperatura ambiente.
   Nota: Se il gruppo ha successo, la fase acquosa inferiore dovrebbe avere un colore verde.
7. Smaltire la fase superiore dell'olio e aggiungere 1 ml di olio minerale. Mescolare bene l'olio minerale con l'emulsione pellet dal vortice o girando la provetta accuratamente. Centrifugare il campione a 14.000 xg per 5 min a temperatura ambiente. Ripetere questa operazione fino a quando un menisco chiaro che separa il acquosa e minatorefasi di petrolio al, senza alcuna emulsione intermedio si ottiene.
8. Eseguire questo passaggio in una cappa chimica. Dopo le fasi di petrolio acquose e minerali sono chiaramente separati, rimuovere l'olio minerale e aggiungere 1 ml di acqua satura di etere etilico. Vortex e centrifugare il campione a 14.000 xg per 5 min a temperatura ambiente. Ripetere questa operazione due volte.
9. Dopo la seconda centrifugazione, eliminare l'etere etilico e lasciare i tubi aperti per 5-20 min nella cappa.
10. Infine, caricare la fase acquosa contenente la WSCP / Chl un complesso su una colonna dissalazione ed eluire con tampone appropriato per ulteriori esperimenti.
    Nota: La proteina è stabile in buffer Tris fosfati o in una vasta gamma di pH (6.0-7.5). Il campione può essere conservato a 4 ° C al riparo dalla luce fino a un mese.

Risultati

Apoproteine ​​WSCP ricombinanti sono stati assemblati con Chl a in emulsioni / O W secondo il protocollo descritto nella sezione precedente. Il protocollo è stato implementato utilizzando fasi acquose contenenti sia WSCPs puri, o lisati cellule di E.coli sovraesprimono WSCP (Figura 1). Il protocollo è semplice, veloce e non richiede particolari attrezzature tranne un omogeneizzatore tessuto.

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Discussione

Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un nuovo sistema generale per l'assemblaggio delle proteine ​​clorofilla-binding solubili in acqua con pigmenti idrofobiche. Qui si dimostra che il nuovo sistema di ricostituzione basato su W / O emulsione è un approccio generale dimostrato di funzionare per l'assemblaggio di apoproteine ​​WSCP da cavolini di Bruxelles, cavolfiore, rafano giapponese e Virginia pepperweed ricombinante espresse in E. coli. Qui i risultati sono presentati dalla ricostituzione di...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Olio minerale	Sigma	M5904
Span80	Sigma	85548
Tween80	Sigma	P8074
Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartucce	Bio Rad	10011164	Affinity cromatografia per la purificazione WSCP con sequenza nativa.
Colonna HF His Trap	GE Healthcare Life Science	17-5248-02	Cromatografia di affinità per la purificazione WSCP con His-tag
DEAE Sepharose Fast	Flow GE Healthcare Life Science	17-0709-01	Terreno cromatografico per la purificazione della clorofilla