Questo manoscritto descrive un metodo semplice e ad alta produttività per assemblare proteine solubili in acqua con pigmenti idrofobiche che è basato su emulsioni acqua-in-olio. Dimostriamo l'efficacia del metodo per l'assemblaggio di clorofille nativi con quattro varianti di ricombinante solubile in acqua-clorofilla proteine leganti (WSCPs) di piante Brassica espressi in E. coli.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Acqua in emulsioni olio: un nuovo sistema di montaggio idrosolubili proteine clorofilla vincolante con pigmenti idrofobi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Clorofille (Chls) e batterioclorofilla (BChls) sono i cofattori principali che effettuano la raccolta luce fotosintetica e di trasporto degli elettroni. La loro funzionalità dipende in modo critico dalla loro specifica organizzazione all'interno di grandi ed elaborati complessi proteici multisubunit transmembrana. Per comprendere a livello molecolare come questi complessi facilitano conversione dell'energia solare, è essenziale comprendere proteina-pigmento, e le interazioni pigmenti pigmento, e il loro effetto sulla dinamica eccitati. Un modo per ottenere questo senso sia costruendo e studiando complessi di Chls con semplici proteine ricombinanti solubili in acqua. Tuttavia, incorporando le Chls lipofile e BChls in proteine solubili in acqua è difficile. Inoltre, non esiste un metodo generale, che potrebbero essere utilizzati per l'assemblaggio delle proteine solubili in acqua con pigmenti idrofobi. Qui, dimostriamo un sistema di throughput semplice ed alta basato su emulsioni acqua-in-olio, che consente assembly di proteine solubili in acqua con Chls idrofobi. Il nuovo metodo è stato convalidato assemblando versioni ricombinanti della clorofilla proteina legante idrosolubile di Brassicaceae piante (WSCP) con Chl a. Dimostriamo l'assemblaggio di successo di Chl A utilizzando lisati grezzi di WSCP esprimono E. cellule coli, che può essere usato per sviluppare un sistema di screening genetico per nuove proteine Chl-leganti idrosolubili, e per studi di interazione Chl-proteina e processi di assemblaggio.
Introduzione
pigmenti idrofobi, come clorofille (Chls), batterioclorofilla (BChls) e carotenoidi sono i cofattori primari in centri di reazione fotosintetici e le proteine di raccolta di luce che effettuano trasporto di elettroni, e la cattura l'energia della luce e il trasferimento. I centri di reazione e la maggior parte dei complessi di raccolta della luce Chl-leganti sono proteine transmembrana. La Fenna-Matthews-Olson (FMO) proteine di batteri fotosintetici verde-zolfo non oxygenic 1,2, e la proteina peridinina-Chl (PCP) dei dinoflagellati 3 sono esempi eccezionali di solubili in acqua proteine luce raccolta. Il legame clorofilla proteine ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Preparazione Chl uno stock Solutions
- PUNTO CRITICO: eseguire tutte le fasi della preparazione clorofilla in una cappa chimica, sotto luce verde (520 nm) o al buio, al fine di ridurre al minimo fotodanneggiamento. Aggiungere sempre azoto o argon prima del congelamento dei pigmenti per la conservazione. Assicurarsi che tutti i solventi sono grado analitico.
- Pesare circa 5 mg di cellule Spirulina platensis liofilizzati o altre cellule cianobatterio che contengono solo Chl a nelle membrane tilacoidi e schiacciarlo con un mortaio e pestello.
- Caricare cellule schiacciato su una colonna di vetro e lavare con circa 50-100 m....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Apoproteine WSCP ricombinanti sono stati assemblati con Chl a in emulsioni / O W secondo il protocollo descritto nella sezione precedente. Il protocollo è stato implementato utilizzando fasi acquose contenenti sia WSCPs puri, o lisati cellule di E.coli sovraesprimono WSCP (Figura 1). Il protocollo è semplice, veloce e non richiede particolari attrezzature tranne un omogeneizzatore tessuto.
.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un nuovo sistema generale per l'assemblaggio delle proteine clorofilla-binding solubili in acqua con pigmenti idrofobiche. Qui si dimostra che il nuovo sistema di ricostituzione basato su W / O emulsione è un approccio generale dimostrato di funzionare per l'assemblaggio di apoproteine WSCP da cavolini di Bruxelles, cavolfiore, rafano giapponese e Virginia pepperweed ricombinante espresse in E. coli. Qui i risultati sono presentati dalla ricostituzione di.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
DN riconosce il sostegno dell'Unione europea del 7 ° PQ progetti PEPDIODE (GA 256.672) e REGPOT-2012-2013-1 (GA 316.157), e un assegno di ricerca personale (n ° 268/10) dalla Israel Science Foundation. Ringraziamo il Prof. Shmuel Rubinstein, Facoltà di Ingegneria e Scienze Applicate, Università di Harvard, Cambridge, MA, USA per prendere le immagini di microscopia confocale.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Olio minerale | Sigma | M5904 | |
| Span80 | Sigma | 85548 | |
| Tween80 | Sigma | P8074 | |
| Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartucce | Bio Rad | 10011164 | Affinity cromatografia per la purificazione WSCP con sequenza nativa. |
| Colonna HF His Trap | GE Healthcare Life Science | 17-5248-02 | Cromatografia di affinità per la purificazione WSCP con His-tag |
| DEAE Sepharose Fast | Flow GE Healthcare Life Science | 17-0709-01 | Terreno cromatografico per la purificazione della clorofilla |
Riferimenti
- Bryant, D. A., Frigaard, N. -U. Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated. Trends Microbiol. 14, 488-496 (2006).
- Tronrud, D. E., Wen, J. Z., Gay, L., Blankenship, R. E. The structural basis for the difference in absorba....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
