Articolo metodologico

Ottimizzazione del test ferita Scratch per rilevare i cambiamenti in murini mesenchimali stromali migrazione cellulare dopo i danni da fumo di sigaretta estratto solubile

DOI:

10.3791/53414

⸱

3 dicembre 2015

 ,  ,  , 
1Department of Biology, College of the Holy Cross

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La capacità di migrare è una funzione chiave di molti tipi di cellule diverse, comprese le cellule stromali mesenchimali (MSC). Tuttavia, quantificare le alterazioni della capacità migratoria dopo un danno è difficile. Questo protocollo descrive un test di migrazione facilmente adattabile che utilizza statistiche rigorose per quantificare i cambiamenti nella capacità migratoria delle MSC dopo il danno.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La migrazione cellulare è vitale per molti processi fisiologici e patologici, tra cui lo sviluppo, la riparazione e la rigenerazione dei tessuti, le metastasi del cancro e le risposte infiammatorie. Dato l'attuale interesse per il ruolo delle cellule stromali mesenchimali nel mediare la riparazione tissutale, siamo interessati a quantificare la capacità migratoria di queste cellule e a capire come la capacità migratoria possa essere alterata dopo un danno. L'ottimizzazione di un saggio di migrazione rigorosamente quantitativo, facile da personalizzare ed economico da eseguire, è la chiave per rispondere alle domande relative alle alterazioni della migrazione cellulare in risposta a vari stimoli. Gli attuali metodi per quantificare la migrazione cellulare, tra cui i saggi scratch, i saggi di migrazione trans-pozzetto (camere di Boyden), gli array di micropilastri e i saggi della zona di esclusione cellulare, presentano una serie di limitazioni in termini di riproducibilità, personalizzazione, quantificazione ed economicità. Nonostante il suo uso preminente, il test scratch è confuso da problemi di riproducibilità legati al danno del microambiente cellulare, impedimenti alla migrazione cellulare, influenza delle cellule senescenti vicine e proliferazione cellulare, nonché dalla mancanza di una quantificazione rigorosa. Il test di scratch ottimizzato qui descritto dimostra risultati solidi, capacità di analisi quantificabili e basate su immagini, economicità e adattabilità ad altre applicazioni.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La migrazione cellulare è altamente coordinato e vitale in molti processi fisiologici quali lo sviluppo dei tessuti, la riparazione e la rigenerazione, nonché processi patologici quali metastasi del cancro e l'arteriosclerosi 1. Una comprensione della migrazione delle cellule è particolarmente rilevante per terapie emergenti utilizzati per riparare i tessuti danneggiati e il trattamento di condizioni patologiche, comprese le tecnologie di trapianto di cellule e tessuti artificiali di innesto 2. Dato l'attuale interesse per il ruolo delle cellule stromali mesenchimali (MSC) nella mediazione riparazione dei tessuti 3, quantificare la capacità migratoria di queste cellule utilizzando un metodo che è rigorosamente quantificabile, adattabile, e conveniente è di interesse. È importante sottolineare che un tale test deve essere sufficientemente sensibile per rilevare i cambiamenti relativamente sottili cellulare capacità migratoria dopo un danno. Gli attuali metodi per quantificare la migrazione delle cellule, tra cui saggi e vinci, trans pozzetti test di migrazione (Boyden chambre), array micropillar, e saggi zona di esclusione cellulare in possesso di una serie di limitazioni nella riproducibilità, personalizzazione, la quantificazione, e costo-efficacia 1,4,5. Il test zero ottimizzata qui descritto dimostra esiti robuste capacità di analisi quantificabili e basati su immagini, costo-efficacia, e l'adattabilità ad altre applicazioni.

Scratch saggi sono stati utilizzati in molteplici capacità di valutare la migrazione cellulare e la proliferazione in diverse condizioni sperimentali 5. Il test prevede la semina le cellule designate, crescendo loro di completare o nei pressi di confluenza, e graffiare il monostrato risultante con un ago sterile o pipetta punta 6. Analisi è più comunemente effettuata confrontando la larghezza del graffio su più punti di tempo in luoghi selezionati casualmente 7-9. Nonostante il suo uso prominente, il dosaggio zero è confuso da problemi con la riproducibilità e la quantificazione. Variabilità ingenerazione del graffio non solo modificando il microambiente delle cellule, ma può anche impedire la migrazione delle cellule danneggiando la superficie sottostante piastra e extracellulare matrice 5. I saggi sono spesso condotti per 7-12 ore, ma per linee cellulari che mostrano una migrazione più lenta e tempi di analisi più lunghi, la proliferazione diventa una variabile confondente 7,10. Infine, le cellule senescenti generati dal processo di graffiare può rilasciare fattori che interferiscono con la segnalazione extracellulare necessaria per colmare il divario in monostrato 1. Ottimizzazione dosaggio zero richiede la creazione di un vuoto costante che non interferisce con le proprietà superficiali, minimizzando dosaggio lunghezza di tempo, e prevenire la morte delle cellule indesiderate durante la manipolazione. Il saggio basato tappo è una ottimizzazione di un saggio zona di esclusione cellule. Questo saggio utilizza un tappo posto al centro del pozzo che esclude la crescita cellulare, ma permette alle cellule di essere placcato intorno alla zona di esclusione centrale.Per valutare la migrazione, il tappo viene rimosso, e la zona di esclusione risultante fornisce una superficie per la migrazione a verificarsi. Tuttavia, questo test è difficile da personalizzare o adattare 10 e per alcune applicazioni, questa tecnica può anche essere costo proibitivo.

In contrasto con saggi graffiatura e loro derivati, saggi di migrazione trans-well (o camera di Boyden saggi) valutano la migrazione quantificando il numero di celle che si muovono da una camera, attraverso una membrana microporosa filtro, in una camera contenente agenti chemiotattici 8,11, 12. Questa tecnica ha limitato l'utilità di cellule aderenti come MSC perché dopo la migrazione attraverso la membrana porosa, le cellule aderiscono al lato della membrana esposta agli agenti chemiotattici, e può essere difficile da quantificare con precisione. Mentre il test è in grado di esaminare alcuni modelli di migrazione tridimensionali, i tipi di cellule ristrette per il quale è in grado di quantificare accuratamente limite migrazione cellulare sua utilità 10. Un'altra alternativa per saggi scratch utilizza una matrice di micro-pilastro, che misura la motilità cellulare attraverso uno spazio tridimensionale utilizzando la capacità delle cellule di deformarsi e migrare nella matrice come un surrogato. Polydimethlysiloxane (PDMS) elastomeri curati su uno stampo preciso e trattati con ozono e fibronectina produce un microambiente omogeneo e non degradabile. Spaziatura Micro-pilastro può anche essere variata come necessario per misurare la capacità delle cellule di entrare nella matrice 4. Lo stampo viene creato attraverso profonda ioni reattivi di wafer di silicio per creare una versione negativa di alta con formato matrice 13. Mentre l'analisi è rafforzata dalla sua personalizzazione, capacità di modellare la migrazione tridimensionale, e l'analisi attraverso la visualizzazione diretta delle cellule migranti, difficoltà nella creazione di array di micro-pilastro ostacola economicamente la sua diffusione.

Il dosaggio zero ottimizzata descritto in questo protocollo offre un efficiente, cosMetodo t-efficace per produrre graffi coerenti che possono essere analizzati utilizzando il software liberamente disponibile. Invece di semplici misure di larghezza effettuate attraverso il graffio prima e dopo la migrazione delle cellule, il software permette all'utente di determinare le aree totali scratch prima e dopo la migrazione. Tale avanzamento limita il problema di cercare di determinare dove il graffio opportuno prendere le misure di larghezza, e se la larghezza del graffio è uniforme lungo la sua lunghezza. Inoltre, attenta ottimizzazione di numero di cellule, cellule confluenza e il tipo e grado di danno inflitto sulle cellule è discusso per ottimizzare ulteriormente il dosaggio.

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Protocollo

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Nota: Per questo studio, le cellule stromali mesenchimali del polmone (LR-MSC) dal tessuto polmonare distale sono stati isolati sia in base alla loro espressione di marcatori di superficie cellulare (CD45 neg, CD31 neg, Sca-1 alto, EpCAM neg) 14,15, utilizzando espianto fuori crescita del 16, o tramite digestione enzimatica 17. Aderente LR-MSC sono state coltivate in DMEM con elevato glucosio e non glutammina, 15% FBS, glutammina antibiotici / antimicotici, e 2 mM 1x (ormai completo media) e incubato a 37 ° C, 5% CO 2. LR-MSC sono stati diversi passaggi 3-4 volte per garantire una popolazione di cellule con caratteristiche di crescita relativamente omogenei per il saggio di migrazione.

1. Preparare un Confluent monostrato

  1. Per staccare MSC da 100 mm di piatti standard della cultura, lavare le cellule con 10 ml di 37 ° C PBS preriscaldata, aspirare il PBS e aggiungere 4 ml di tripsina (0,25%). Incubare 3-5 minuti a 37 ° C incubatore. Aspirare il cells in una provetta conica, aggiungere uguale volume di mezzi completi e centrifugare a 300 g per 5 min a pellet le cellule.
    Nota: più lunga incubazione in tripsina può alterare i recettori di superficie delle cellule e potenzialmente influenzare la migrazione.
  2. Aspirare i media e risospendere le cellule in mezzi freschi completo. Contare le cellule, escluse le cellule morte con trypan blue e piastra cellule stromali mesenchimali 500.000 in 4 ml di completo media su un piatto di coltura cellulare 60 mm.
    Nota: A seconda della fonte delle cellule, possono essere necessari per determinare il numero ottimale di cellule necessarie.
  3. Incubare le cellule fino a quando le piastre sono il 90% confluenti per il fissaggio cellulare ottimale e la proliferazione, di solito 48-72 ore per MSC.
    Nota: 100% confluenza non è consigliabile, dato che molti di ancoraggio-dipendente contatto celle esperienza inibizione, che possono alterare la capacità migratoria. Piastre con meno del 80% di confluenza provocheranno foto inutilizzabili perché il software di analisi di immagine interpreterà gaps tra le cellule come parte del perimetro del graffio (vedi Figura 1D).
  4. Dopo che le cellule hanno raggiunto il 90% di confluenza, danneggiare le cellule come appropriato per l'applicazione. Per valutare il danno cellulare dopo l'esposizione al fumo di sigaretta estratto solubile (CSE), generare il 100% CSE disegnando il fumo dal 1 Università del Kentucky sigaretta ricerche (3R4F) attraverso 25 ml di completo media in un pallone Büchner oltre 2 min 18.
  5. Incubare le cellule per 24 ore in 4 ml 1-4% CSE diluito in completo dei media. Dopo l'incubazione, lavare le cellule due volte con 4 ml di PBS sterile calda, prima della sostituzione con 4 ml mezzi freschi completo.
    Nota: le cellule distruttive ad alta concentrazione di estratto di fumo di sigaretta (> 5%) può ridurre in modo sostanziale confluenza.

2. Creazione Scratch

  1. In un ambiente sterile, togliere il coperchio dalla piastra 60 millimetri di MSC danneggiati, e laici un regolo (per esempio, un righello di plastica sterilizzata) across il bordo superiore della piastra. Senza rimuovere il supporto, utilizzare una sterile 200 microlitri pipetta punta guidata dal straight-edge sterili per fare uno a quattro graffi paralleli in tutto il piatto circa 5 mm di distanza e 50 mm di lunghezza.
    Nota: Un regolo minimizza la quantità di rotazione necessari adeguamenti alla piastra quando è sul palco microscopio. È indispensabile che i graffi appaiono completamente verticale (o orizzontale) sullo schermo. Generazione multipli graffi su una piastra 60 mm non altera il microambiente in modo che colpisce la migrazione cellulare (dati non mostrati), ma può essere una considerazione per altri tipi di cellule. L'uso dei pozzi più piccoli non è raccomandato in quanto la variabilità delle cellule cresce vicino al bordo del pozzo diventa più pronunciato e può interessare generazione uniforme dei graffi.
  2. Aspirare media e lavare delicatamente le piastre con 2 ml di mezzi completi pre-riscaldato per impedire cellule di aderire al centro del graffio, e per rimuovere cellules che sono stati allentato dal graffio. Sostituire con 4 ml di mezzi freschi completo.
  3. Utilizzando un pennarello indelebile sterile, etichettare ogni graffio da 1-4 sul lato inferiore della piastra in posizione che non interferiscono con le immagini dei graffi.
    Nota: E 'importante che le immagini della stessa zero vengono confrontati prima e dopo la migrazione, poiché non vi può essere la variazione a larghezza zero.

3. Prendendo iniziali Immagini Scratch

Nota: Se il test scratch viene eseguita su piastre multiple, si raccomanda che siano prese immagini iniziali di tutti i graffi su un singolo piatto prima graffi sono effettuati sulla piastra successiva.

  1. Utilizzare un microscopio a contrasto di fase invertito con una macchina per generare le immagini necessarie per l'analisi.
  2. Posizionare la piastra di coltura sul microscopio, e utilizzare l'obiettivo di bassa potenza (10X) per individuare zero # 1. Se la formazione di condensa sul coperchio della piastra di coltura sta impedendo una chiara image delle cellule, utilizzare un palcoscenico riscaldata a 37 ° C.
  3. Mantenendo il graffio completamente orizzontale e nel centro del campo di vista, ottenere più immagini come necessario comprenda 90% della lunghezza della graffiatura. Ottenere immagini di porzioni distinte della zero con alcuna sovrapposizione tra le immagini.
    Nota: La rifrazione della luce ai bordi del piatto cultura sovraespone le immagini, rendendole impossibile analizzare. Pertanto, non prendere le immagini dal primo e l'ultimo 5% della lunghezza della zero.
  4. Salvare le immagini da ogni zero in una cartella separata.
  5. Ripetere i passaggi 3,2-3,4 per graffi 2, 3, e 4.
  6. Piastre per l'incubatore restituire immediatamente dopo l'imaging iniziale. Lasciate che le cellule migrano per 4-7 ore.
    Nota: 7 ore è ottimale quando si valuta MSC danneggiate con CSE. Incubando le cellule per più di 7 ore non è raccomandato perché la proliferazione cellulare può fungere da variabili di confondimento per la migrazione cellulare (vedi nota Opzionale 8.2 sotto).
4. Analizzando iniziali Scratch Immagini

  1. Scaricare ImageJ e installare il plugin di Wound Healing Tool (fare riferimento alla tabella dei materiali / attrezzature).
  2. Aprire il file di immagine in ImageJ, quindi fare clic su "Processo" e "Trova bordi" per evidenziare le cellule circostanti il graffio per la guarigione della ferita strumento per calcolare l'area zero (Figura 2B). Quindi, fai clic su "Immagine", "Regola", "Soglia colori" e nel menu a discesa con l'etichetta "Soglia colori" modificare il valore di "B & W".
  3. All'interno del menu "Soglia colori", regolare entrambi i cursori soglia di luminosità fino a raggiungere ottimale contrasto tra il graffio e la cella di fronte. Per consentire la massima gamma nel tentativo di creare contrasto nell'immagine, spostare completamente il cursore inferiore a destra (immagine completamente nera), e quindi regolare il cursore superiore per generare il massimo contrasto.
  4. Lentamente regolare la BRI superioreghtness cursore da sinistra verso destra fino a quando l'immagine viene visualizzata in modo pulito il contorno del graffio (Figura 2C). Una volta che sono stati identificati i bordi del graffio, fare clic su "Altre Strumenti" nella barra degli strumenti ImageJ, selezionare "MRI_Wound_Healing_Tool" dal menu a discesa, e premere il tasto "m" (che apparirà nella barra degli strumenti ImageJ) per evidenziare l'area scratch e l'uscita dell'area calcolata in un risultato finestra a comparsa (figura 2D).
  5. Copia e incolla tutti i numeri dalla finestra dei risultati (Figura 2E) in un foglio di calcolo Excel. Assicurati di separare i dati dai singoli graffi.

5. Prendendo finali Immagini Scratch

  1. Dopo che le cellule sono migrate (4-7 ore), ripetere i passaggi 3,2-3,4. Immagine le piastre nello stesso ordine in cui sono stati graffiato in modo che le cellule su ogni piatto hanno avuto uguale tempo di migrare.
    Nota: Le celle possono essere esposte in più punti di tempo, a seconda della loro sensitività a cambiamenti di temperatura e di pH. In alternativa, l'imaging cellulare dal vivo può essere usato per seguire le cellule in tempo reale durante la loro migrazione.

6. Analisi finali Scratch Immagini

  1. Ripetere i passaggi 4,2-4,5 per le immagini e vinci finali.

7. calcolo dell'area Scratch per quantificare la migrazione

  1. Calcolare l'area di pre-migrazione media dalla media dei valori dell'area iniziali dei rispettivi graffi.
  2. Calcolare la quantità totale di migrazione sottraendo l'area di migrazione finale per ogni immagine, calcolata al punto 6, dalla zona di pre-migrazione media (passo 7,1). Generare un elenco di valori per ciascun zero rappresenta la variazione nella migrazione.
  3. Pool i dati da più graffi all'interno dello stesso gruppo di prova (vale a dire tutti i piatti e tutti i graffi sulle cellule esposte a 0% CSE). Utilizzare una analisi della varianza di test per analizzare le differenze tra i gruppi sperimentali.
  4. Se le cellule sono lenti a migraree richiedono un tempo di incubazione più lungo dopo graffi (maggiore di 10-12 ore), eseguono un BrDU o EdU incorporazione dosaggio 19 per determinare se le cellule stanno subendo qualsiasi proliferazione durante il periodo in cui il test di migrazione è in corso. Scegli un tempo saggio di migrazione per evitare significativa proliferazione cellulare.

8. Facoltativo

  1. Per valutare se significativo senescenza cellulare si verifica come risultato della procedura di graffi, eseguire una senescenza associata Beta-galattosidasi test su una piastra di prova in un momento predeterminato dopo graffi 19.

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Risultati

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I saggi e vinci qui presentati sono stati eseguiti utilizzando cellule mesenchimali stromali residenti polmone murini (LR-MSC) e isolate come riferito nelle note di protocollo. La LR-MSC sono state seminate ad una densità di 500.000 cellule in un piatto di coltura di tessuti 60 mm, e cresciuto a 90% di confluenza in 48 ore. Per generare danni, 4% CSE (descritto sopra) è stato incubato con le cellule per 24 ore dopo il periodo di semina iniziale, ma prima del dosaggio zero. Per ogni test, il graffio è stata generata util...

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Discussione

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Il protocollo qui descritto fornisce un metodo quantitativo robusto, standardizzato per eseguire ed analizzare saggi di scratch. Saggi scratch semplici sono abitualmente utilizzati in diversi settori di studio per esaminare la migrazione cellulare. Tuttavia, tradizionalmente il dosaggio zero è mancato un set-up e la quantificazione protocollo standardizzato, che ha portato a problemi con riproducibilità 7,10. Molte delle modifiche e ottimizzazioni per migliorare il dosaggio zero hanno ridotto questi problemi,...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Siamo grati agli altri membri del laboratorio per la loro assistenza tecnica nello sviluppo del test per i danni CSE, e per il loro supporto e consulenza durante lo sviluppo di questo test. Inoltre, siamo grati all'Holy Cross Fenwick Scholar Committee per il loro sostegno a Nicholas Cormier e al programma Holy Cross College Honors per il loro sostegno ad Alexander Yeo.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEM (glucosio alto, senza glutammina aggiunta)Life Technologies31053-036
Siero fetale bovino, Thermo Scientific HyCloneFisher ScientificSH3091002
Antibiotico/antimicotico, Thermo Scientific HyClone Fisher ScientificSV3007901
Glutammina, 200 mM, Thermo Scientific HyCloneFisher ScientificSH3003401
Reagente di dissociazione cellulare TypeLELife Technologies12563-01
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco, Thermo Scientific HyClone Fisher ScientificSH3002802
Falcon piastre per coltura tissutale standard da 60 mmFisher Scientific08-772B
Fisherbrand Sterile 200 μ l puntali per pipetteFisher Scientific02-707-502
Microscopio a luce invertita con attacco per fotocameraSoftware ImageJ variabile
 http://imagej.nih.gov/ij/
MRI_Wound_Healing pluginhttp://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool
Software di analisi statisticaMicrosoft Excel

Riferimenti

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