Approcci sperimentale per lo studio mitocondriale localizzazione e funzione di un nucleare di cellule ciclo chinasi, Cdk1

Demet Candas; Lili Qin; Ming Fan; Jian-Jian Li

doi:10.3791/53417

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Articolo metodologico

Approcci sperimentale per lo studio mitocondriale localizzazione e funzione di un nucleare di cellule ciclo chinasi, Cdk1

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DOI:

10.3791/53417

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25 febbraio 2016

Demet Candas¹ , Lili Qin¹ , Ming Fan¹ , Jian-Jian Li¹

¹Radiation Oncology, University of California, Davis

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo come studiare la localizzazione mitocondriale di una chinasi (ciclo cellulare) e come determinare la sua posizione sub-mitocondriale, nonché potenziali substrati/bersagli mitocondriali. L'espressione forzata di proteine nei mitocondri fornisce uno strumento utile per studiare le conseguenze funzionali della localizzazione mitocondriale di una proteina di interesse.

Abstract

Sebbene i mitocondri possiedano un proprio apparato trascrizionale, solo l'1% delle proteine mitocondriali viene sintetizzato all'interno dell'organello. Le proteine codificate dal nucleo vengono trasportate nei mitocondri guidate dalle loro sequenze di targeting mitocondriali (MTS); tuttavia, la maggior parte delle proteine mitocondriali localizzate manca di una MTS identificabile. Tuttavia, il fatto che la MTS possa istruire le proteine ad entrare nei mitocondri fornisce uno strumento prezioso per studiare le funzioni mitocondriali di proteine normalmente nucleari e/o citoplasmatiche. Recentemente abbiamo identificato il complesso chinasi del ciclo cellulare CyclinB1/Cdk1 nei mitocondri. Per studiare in modo specifico le funzioni mitocondriali di questo complesso, la sovraespressione mitocondriale e il knock-down di questo complesso senza interferire con le sue funzioni nucleari o citoplasmatiche erano essenziali. Marcando CyclinB1/Cdk1 con MTS, siamo stati in grado di ottenere una sovraespressione mitocondriale di questo complesso per studiare i suoi bersagli mitocondriali e le sue funzioni. Attraverso l'etichettatura di Cdk1 dominante-negativo con MTS, l'inibizione dell'attività di Cdk1 è stata ottenuta in particolare nei mitocondri. I potenziali bersagli mitocondriali del complesso CyclinB1/Cdk1 sono stati identificati utilizzando un approccio proteomico basato su gel. A differenza della tradizionale analisi su gel 2D, abbiamo impiegato la tecnologia dell'elettroforesi su gel a differenza bidimensionale (2D-DIGE) seguita dalla colorazione con fosfoproteina per marcare in modo fluorescente le proteine fosforilate in modo differenziale nelle cellule mitocondriali che esprimono Cdk1. L'identificazione di macchie fosfoproteiche che erano alterate nei mitocondri portatori di Cdk1 wild type rispetto a quelli dominanti negativi ha rivelato l'identità dei bersagli mitocondriali di Cdk1. Infine, per determinare l'effetto della localizzazione mitocondriale di CyclinB1/Cdk1 nella progressione del ciclo cellulare, è stato utilizzato un test di proliferazione cellulare utilizzando un analogo sintetico della timidina EdU (5-etinil-2'-deossiuridina) per monitorare le cellule mentre attraversano il ciclo cellulare e replicano il loro DNA. Nel complesso, abbiamo dimostrato una varietà di approcci disponibili per studiare la localizzazione mitocondriale e l'attività di una chinasi del ciclo cellulare. Si tratta di metodi avanzati, ma facili da seguire, che saranno utili a molti ricercatori di biologia cellulare.

Introduzione

Nei mammiferi, la progressione del ciclo cellulare dipende da eventi altamente ordinate controllati da cicline e chinasi ciclina-dipendenti (CDK) ^1. Attraverso la sua citoplasmatica, nucleare, e la localizzazione centrosomica, CyclinB1 / Cdk1 è in grado di sincronizzare i diversi eventi in mitosi, come ripartizione membrana nucleare e la separazione centrosome ^2. CyclinB1 / Cdk1 protegge le cellule in mitosi contro l'apoptosi ³ e promuove fissione mitocondriale, un passaggio fondamentale per un'equa distribuzione dei mitocondri delle cellule figlie di nuova formazione ^4.

In proliferazion....