Approcci sperimentale per lo studio mitocondriale localizzazione e funzione di un nucleare di cellule ciclo chinasi, Cdk1

Summary

Qui, descriviamo come studiare la localizzazione mitocondriale di una chinasi (ciclo cellulare) e come determinare la sua posizione sub-mitocondriale, nonché potenziali substrati/bersagli mitocondriali. L'espressione forzata di proteine nei mitocondri fornisce uno strumento utile per studiare le conseguenze funzionali della localizzazione mitocondriale di una proteina di interesse.

Abstract

Sebbene i mitocondri possiedano un proprio apparato trascrizionale, solo l'1% delle proteine mitocondriali viene sintetizzato all'interno dell'organello. Le proteine codificate dal nucleo vengono trasportate nei mitocondri guidate dalle loro sequenze di targeting mitocondriali (MTS); tuttavia, la maggior parte delle proteine mitocondriali localizzate manca di una MTS identificabile. Tuttavia, il fatto che la MTS possa istruire le proteine ad entrare nei mitocondri fornisce uno strumento prezioso per studiare le funzioni mitocondriali di proteine normalmente nucleari e/o citoplasmatiche. Recentemente abbiamo identificato il complesso chinasi del ciclo cellulare CyclinB1/Cdk1 nei mitocondri. Per studiare in modo specifico le funzioni mitocondriali di questo complesso, la sovraespressione mitocondriale e il knock-down di questo complesso senza interferire con le sue funzioni nucleari o citoplasmatiche erano essenziali. Marcando CyclinB1/Cdk1 con MTS, siamo stati in grado di ottenere una sovraespressione mitocondriale di questo complesso per studiare i suoi bersagli mitocondriali e le sue funzioni. Attraverso l'etichettatura di Cdk1 dominante-negativo con MTS, l'inibizione dell'attività di Cdk1 è stata ottenuta in particolare nei mitocondri. I potenziali bersagli mitocondriali del complesso CyclinB1/Cdk1 sono stati identificati utilizzando un approccio proteomico basato su gel. A differenza della tradizionale analisi su gel 2D, abbiamo impiegato la tecnologia dell'elettroforesi su gel a differenza bidimensionale (2D-DIGE) seguita dalla colorazione con fosfoproteina per marcare in modo fluorescente le proteine fosforilate in modo differenziale nelle cellule mitocondriali che esprimono Cdk1. L'identificazione di macchie fosfoproteiche che erano alterate nei mitocondri portatori di Cdk1 wild type rispetto a quelli dominanti negativi ha rivelato l'identità dei bersagli mitocondriali di Cdk1. Infine, per determinare l'effetto della localizzazione mitocondriale di CyclinB1/Cdk1 nella progressione del ciclo cellulare, è stato utilizzato un test di proliferazione cellulare utilizzando un analogo sintetico della timidina EdU (5-etinil-2'-deossiuridina) per monitorare le cellule mentre attraversano il ciclo cellulare e replicano il loro DNA. Nel complesso, abbiamo dimostrato una varietà di approcci disponibili per studiare la localizzazione mitocondriale e l'attività di una chinasi del ciclo cellulare. Si tratta di metodi avanzati, ma facili da seguire, che saranno utili a molti ricercatori di biologia cellulare.

Introduction

Nei mammiferi, la progressione del ciclo cellulare dipende da eventi altamente ordinate controllati da cicline e chinasi ciclina-dipendenti (CDK) ^1. Attraverso la sua citoplasmatica, nucleare, e la localizzazione centrosomica, CyclinB1 / Cdk1 è in grado di sincronizzare i diversi eventi in mitosi, come ripartizione membrana nucleare e la separazione centrosome ^2. CyclinB1 / Cdk1 protegge le cellule in mitosi contro l'apoptosi ³ e promuove fissione mitocondriale, un passaggio fondamentale per un'equa distribuzione dei mitocondri delle cellule figlie di nuova formazione ^4.

In proliferazion....

Protocol

1. Isolamento dei mitocondri da cellule in coltura

1. Preparazione di isolamento Buffer per le celle (IBC) Buffer
   1. Preparare 0,1 M Tris / MOPS (tris (idrossimetil) aminometano / 3- (N -morpholino) propanosulfonico): Sciogliere 12.1 g di Tris in 800 ml di acqua distillata, regolare il pH a 7,4 utilizzando MOPS polvere, aggiungere acqua distillata per un totale volume di 1 L e conservare a 4 ^° C.
   2. Preparare 0,1 M EGTA (etilene glicole bis (2-amminoetil etere) tetraacetico) / Tris: Sciogliere 38.1 g di EGTA in 800 ml di acqua distillata, regolare il pH a 7,4 con Tris polvere, aggiungere acqua distillata fino ....

Results

Localizzazione sub-mitocondriale di CyclinB1 e Cdk1

estrazione di carbonato di sodio viene utilizzato per determinare se una proteina si trova all'interno dei mitocondri o sulla superficie esterna, cioè della membrana esterna. Una volta che una proteina è indicata per localizzare all'interno dei mitocondri, ulteriore determinazione di localizzazione sub-mitocondriale può essere effettuato tramite mitoplasting .......

Discussion

Come le proteine ​​destinate ad altri organuli subcellulari, le proteine ​​mitocondriali mirato possiedono segnali di targeting all'interno della loro struttura primaria o secondaria che li dirigono al organello con l'assistenza di translocating proteine ​​elaborato e piegatrici ^21,22. I mitocondri di targeting sequenze (MTS) ottenuti da proteine ​​residenti esclusivamente mitocondriali come COX8 possono essere aggiunti al N-terminale della sequenza di gene bersaglio specifiche proteine ​​nei mitocond.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
32P ATP	PerkinElmer	BLU002001MC
Anticorpo secondario anti-topo	Invitrogen	A-11003	Alexa-546 coniugato
Anticorpo secondario anti-coniglio	Invitrogen	A11029	Alexa-488 ATP coniugato
	Research Organics	1166A	Per il saggio della chinasi in vitro
Anticorpo Cdk1	Tecnologia di segnalazione cellulare	9112
Tampone chinasi Cdk1	New England Biolabs	P6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit di imaging	Life Technologies	C10337	Per l'analisi del
ciclo cellulare con marcatura EdU	Tecnologia di segnalazione cellulare	4844S	per l'immunocolorazione mitocondriale
Anticorpo ciclina B1	Santa Cruz Biotech	sc-752
CyclinB1/Cdk1 complesso enzimatico	New England Biolabs	P6020S	Evitare il congelamento/scongelamento
CyDye DIGE Kit di etichettatura fluorescente	GE Healthcare Life Sciences	25-8009-83
DIGE Gel e DIGE Buffer Kit	GE Scienze della vita sanitaria	28-9480-26 AA
Dimetilformammide	Sigma Aldrich	319937	DMF
Ditiotreitolo	Bio-Rad	161-0611	DTT
dNTP	EMD Millipore	71004	Per mutagenesi sito-specifica
Dpn I enzima	Stratagene	200519-53	Per mutagenesi sito-specifica
Dry Strip cover fluid	GE Healthcare Life Sciences	17-1335-01	Utilizzato come olio minerale
EDTA	J.T. Baker	4040-03
EGTA	Acros Organics	409910250
Concentratore Eppendorf Vacufuge	Fisher Scientific	07-748-13	Utilizzato come concentratore per centrifughe sottovuoto
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01	Soluzione di montaggio anti-sbiadimento
Citometro a flusso Fortessa	BD Biosciences	649908	Per ciclo cellulare analisi con marcatura EdU
Histone H1	Calbiochem	382150	Per il saggio delle chinasi in vitro
Kit di estrazione su gel QIAquick	Qiagen	28704	Per la purificazione di frammenti di DNA da gel di agarosio
Immobiline DryStrip Gels	GE Healthcare Life Sciences	18-1016-61	Strisce IEF (focalizzazione isoelettrica)
Glutatione immobilizzato	Thermo Scientific	15160	Perle di glutatione-agarosio
Iodoacetamide	Sigma Aldrich	I1149	IAA
IPGphor 3 Unità di messa a fuoco isoelettrica	GE Healthcare Life Sciences	11-0033-64	Supporti per strisce IPGphor
Isopropil-b-D-tio-galattopiranoside	RPI Corp	156000-5.0	IPTG
Leupeptin	Sigma Aldrich	L9783	Per tampone di lisi cellulare
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668027	Reagente di trasfezione
Lisina	Sigma Aldrich	L5501	Per l'etichettatura CyDye
Lisozima	EMD Chemicals	5960
Mitoctracker Rosso/Verde	Invitrogen	M7512/M7514	Coloranti fluorescenti mitocondriali
MOPS	EMD Chemicals	6310
pEGFP-N1	Clonetech	6085-1	Vettore che esprime GFP
Pfu	Stratagene	600-255-52
pGEX-5X-1	GE Healthcare Life Sciences	28-9545-53	Vettore che esprime GST
Fenilmetilsulfonilfluoruro	Shelton Scientific IB01090
salina tamponata con fosfato	PMSF Life Technologies	14040	PBS
Spectra/Por 4 tubi per dialisi	Spectrum Labs	132700	come tubo a membrana porosa per dialisi
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain	Life Technologies	P-33300	Per la colorazione delle fosfoproteine su gel 2D
Cocktail di inibitori della proteinasi	Calbiochem	539134	Per tampone di lisi cellulare
Kit di mutagenesi sito-specifica QuikChange	Stratagene	200519-5
Kit QIAprep Spin Miniprep	Kit di isolamento plasmidico	Qiagen	27104
RO-3306	Alexis Biochemicals	270-463-M001	Inibitore di Cdk1
Rotenone	MP Biomedicals	150154	Inibitore del complesso I
Carbonato di sodio	Fisher Scientific	S93359
Cloruro di sodio	EMD Chemicals	SX0420-5	Per tampone di lisi cellulare
Ortovanadato di sodio	MP Biomedicals	159664	Per tampone di lisi cellulare
Pirofosfato di sodio decaidrato	Alfa Aesar	33385	Per tampone di lisi cellulare
Sodio β-glicerofosfato	Alfa Aesar	L03425	Per tampone di lisi cellulare
SpectraMax M2e	Molecular Devices	M2E	Lettore di micropiastre
Saccarosio	Fisher Scientific	57-50-1
Pestello per smerigliatrice di tessuti	Kimble Chase	885301-0007	Per l'isolamento dei mitocondri
Tubo per smerigliatrice di tessuti	Kimble Chase	885303-0007	Per l'isolamento dei mitocondri
Soluzione di acido tricloroacetico	Sigma Aldrich	T0699	TCA
Tris	MP Biomedicals	103133
Triton-x-100	Teknova	T1105
Tripsina	Calbiochem	650211
Typhoon Imager	GE Healthcare Life Sciences	28-9558-09	Scanner laser su gel per 2D-DIGE
Ubichinone	Sigma Aldrich	C7956