Lo strato granulare esterno cerebellare è il sito della più grande amplificazione transito nel cervello sviluppo. Qui, vi presentiamo un protocollo di indirizzare la modificazione genetica di questo strato al culmine della proliferazione usando ex vivo elettroporazione e la cultura di fette cerebellare da embrionali Giorno 14 embrioni di pollo.
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Articolo metodologico
Ex Cultura Vivo del Chick cerebellare fette e spazialmente mirata elettroporazione di granuli precursori delle cellule
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo strato cerebellare granuli esterno (EGL) è il sito del più grande ampliamento di transito nel cervello in via di sviluppo, e un ottimo modello per studiare la proliferazione e la differenziazione neuronale. Inoltre, le modifiche evolutive della sua capacità proliferativa sono stati responsabili per la drammatica espansione delle dimensioni del cervelletto nei amnioti, rendendo il cervelletto un ottimo modello per gli studi evo-devo del cervello dei vertebrati. Le cellule che costituiscono il EGL, progenitori dei granuli cerebellari, rappresentano anche una cella significativo di origine per medulloblastoma, il più comune tumore pediatrico neuronale. A seguito di transito amplificazione, precursori dei granuli migrano radialmente nello strato granulare interno del cervelletto, dove essi rappresentano la più grande popolazione neuronale nel cervello dei mammiferi maturo. In pulcino, il picco di EGL proliferazione avviene verso la fine della seconda settimana di gestazione. Al fine di indirizzare la modificazione genetica di questo strato ail picco della proliferazione, abbiamo sviluppato un metodo per la manipolazione genetica ex vivo attraverso elettroporazione di fette cervelletto da embrionali Giorno 14 embrioni di pollo. Questo metodo riassume alcuni aspetti importanti di in vivo granuli sviluppo dei neuroni e sarà utile per generare una conoscenza approfondita delle cerebellare proliferazione delle cellule dei granuli e la differenziazione, e quindi dello sviluppo del cervelletto, l'evoluzione e la malattia.
Introduzione
Il cervelletto si trova all'estremità anteriore del romboencefalo ed è responsabile per l'integrazione di elaborazione sensoriale e motore nel cervello maturo e regolazione dei processi cognitivi elevati 1. Nei mammiferi e uccelli, possiede una morfologia complessa ed è fortemente lamellare, un prodotto di ampio amplificazione transito dei progenitori durante lo sviluppo che produce oltre la metà dei neuroni nel cervello adulto. Il cervelletto è stato oggetto di studio per neurobiologi da secoli e in epoca molecolare ha anche ricevuto notevole attenzione. Ciò si riferisce non solo alla sua intrinsecamente interessante biologia, ma anche per il fatt....
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Protocollo
Nota: Tutti gli esperimenti sono stati effettuati con conformità a King College di Londra, Regno Unito e le linee guida per la cura degli animali nel Regno Unito Home Office.
1. La dissezione di e14 cervelletto
- Incubare le uova marroni embrionate di gallina a 38 ° C e 14 ° giorno embrionale.
- Utilizzando le forbici uovo decapitano embrione di pollo in ovo e rimuovere la testa di una capsula di Petri contenente ghiaccio PBS freddo (Figura 1A).
- Utilizzando pinze standard, fare incisioni dietro ogni occhio tutto il percorso attraverso il tessuto, rimuovere gli occhi e mascella superiore....
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Risultati
Questa sezione illustra esempi di risultati che si possono ottenere con la fetta elettroporazione e la cultura del cervelletto da embrionale Giorno 14 pulcino. La dissezione del cervelletto è illustrato nella figura 1 e la camera di elettroporazione impostato è mostrato in Figura 2. Si dimostra che è possibile per l'elettroporazione e con successo cultura fette cerebellare, che mantengono la loro struttura e morfologie cellulari .......
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Discussione
Il protocollo qui riportato descrive un metodo per dissezione, electroporating e coltura fette di embrionale Giorno 14 cervelletto dal pulcino. Questo protocollo permette di targeting di elettroporazione per piccole regioni focali della EGL, compreso isolato di mira singoli lobi cerebellari. Consente analisi genetica e di imaging ad alta risoluzione e convenienza, e ad un basso costo rispetto alle tecniche consolidate nei roditori 43-47. Tale analisi non è attualmente possibile in vivo a causa del lu.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il metodo presentato in questo articolo è nata dal lavoro finanziato dalla BBSRC BB / I021507 / 1 (TB, RJTW) e un dottorato studentship MRC (MH).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tritatutto per tessuti McIlwain | Mickle Laboratory Engineering Ltd | Taglio a 300 μ m per ottenere i migliori risultati. | |
| Aquila media basale (Gibco) | Life Technologies | 41010-026 | |
| L-glutammina | Sigma | G7513 | |
| penicillina/streptomicina | Sigma | P4333 | |
| 0,4 μ inserto per coltura | m Millipore | PICM0RG50 | |
| TSS20 Ovodyne electroporator | Intracel | 01-916-02 | Utilizzare 3 impulsi da 10 V, 10 msec per l'elettroporazione. |
Riferimenti
- Schmahmann, J. D. The role of the cerebellum in cognition and emotion: personal reflections since 1982 on the dysmetria of thought hypothesis, and its historical evolution from theory to therapy. Neuropsychology Review. 20, 236-260 (2010).
- Becker, E. B., Stoodley, C. J.
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Ristampe e permessi
