Ex Cultura Vivo del Chick cerebellare fette e spazialmente mirata elettroporazione di granuli precursori delle cellule

Sommario

Lo strato granulare esterno cerebellare è il sito della più grande amplificazione transito nel cervello sviluppo. Qui, vi presentiamo un protocollo di indirizzare la modificazione genetica di questo strato al culmine della proliferazione usando ex vivo elettroporazione e la cultura di fette cerebellare da embrionali Giorno 14 embrioni di pollo.

Abstract

Lo strato cerebellare granuli esterno (EGL) è il sito del più grande ampliamento di transito nel cervello in via di sviluppo, e un ottimo modello per studiare la proliferazione e la differenziazione neuronale. Inoltre, le modifiche evolutive della sua capacità proliferativa sono stati responsabili per la drammatica espansione delle dimensioni del cervelletto nei amnioti, rendendo il cervelletto un ottimo modello per gli studi evo-devo del cervello dei vertebrati. Le cellule che costituiscono il EGL, progenitori dei granuli cerebellari, rappresentano anche una cella significativo di origine per medulloblastoma, il più comune tumore pediatrico neuronale. A seguito di transito amplificazione, precursori dei granuli migrano radialmente nello strato granulare interno del cervelletto, dove essi rappresentano la più grande popolazione neuronale nel cervello dei mammiferi maturo. In pulcino, il picco di EGL proliferazione avviene verso la fine della seconda settimana di gestazione. Al fine di indirizzare la modificazione genetica di questo strato ail picco della proliferazione, abbiamo sviluppato un metodo per la manipolazione genetica ex vivo attraverso elettroporazione di fette cervelletto da embrionali Giorno 14 embrioni di pollo. Questo metodo riassume alcuni aspetti importanti di in vivo granuli sviluppo dei neuroni e sarà utile per generare una conoscenza approfondita delle cerebellare proliferazione delle cellule dei granuli e la differenziazione, e quindi dello sviluppo del cervelletto, l'evoluzione e la malattia.

Introduzione

Il cervelletto si trova all'estremità anteriore del romboencefalo ed è responsabile per l'integrazione di elaborazione sensoriale e motore nel cervello maturo e regolazione dei processi cognitivi ^elevati 1. Nei mammiferi e uccelli, possiede una morfologia complessa ed è fortemente lamellare, un prodotto di ampio amplificazione transito dei progenitori durante lo sviluppo che produce oltre la metà dei neuroni nel cervello adulto. Il cervelletto è stato oggetto di studio per neurobiologi da secoli e in epoca molecolare ha anche ricevuto notevole attenzione. Ciò si riferisce non solo alla sua intrinsecamente interessante biologia, ma anche per il fatto che essa è fortemente implicata nella malattia umana, compresa malattie genetiche dello sviluppo come disturbi dello spettro autistico ^{2 e} più visibile il tumore cerebellare, il medulloblastoma ^3, che è il cervello pediatrico più diffuso tumore. È importante sottolineare che si tratta di un ottimo sistema modello entro which per studiare l'allocazione destino e neurogenesi durante lo sviluppo cerebrale ^4. Negli ultimi anni, è stato anche affermato come sistema modello per lo studio comparato di sviluppo del cervello, a causa della grande diversità di forme cerebellari visto attraverso la filogenesi dei vertebrati ^5-10.

Il cervelletto si sviluppa dalla metà dorsale del rhombomere 1 in romboencefalo ¹¹ ed evolutivamente comprende due popolazioni progenitrici primari, il labbro rombico e zona ventricolare. Il labbro romboidale si estende intorno alla regione dorsale del neuroepitelio del romboencefalo al confine con la lamiera del tetto. E 'il luogo di nascita dei neuroni eccitatori glutamatergici del cervelletto ^12-14. La zona ventricolare suscita le inibitorie GABAergiche neuroni del cervelletto, il più prominente dei grandi neuroni Purkinje ^14,15. Più tardi, in fase di sviluppo (da circa 13,5 giorno embrionali nel topo; e6 in pulcino ^16), glutamatergico Progenmodifiche ai contenuti migrano tangenzialmente dal labbro romboidale e formano uno strato pial di progenitori: una zona progenitore secondaria chiamato lo strato esterno dei granuli (EGL). È questo livello che subisce l'ampia amplificazione di transito che conduce l'enorme numero di neuroni granulari presenti nel cervello maturo.

Proliferazione nel EGL è stata a lungo legata alla posizione sub-pial che deriva dalla migrazione tangenziale dalla rombico labbro ^17, con l'interruttore di uscita del ciclo cellulare e la differenziazione neuronale di progenitori essendo associato con la loro uscita dallo strato esterno EGL in mezzo EGL ^18. Extensive migrazione tangenziale di cellule granulari post-mitotici in asse mediale-laterale si verifica nel mezzo ed interno EGL ^19, prima finale migrazione radiale nello strato granuli interno della corteccia cerebellare maturo. La migrazione delle cellule dal labbro rombico sulla superficie cerebellare dipende segnalazione CXCL12 dalla pia ^20-22 E cellule granulari esprimono il recettore CXCR4 CXCL12. La loro migrazione tangenziale è quindi ricorda quello di tangenzialmente neocorticale popolazioni migranti interneuroni inibitori ^23-25. Curiosamente, elettroni studi microscopici ¹⁷ hanno suggerito che le cellule EGL con una morfologia proliferativa mantenere il contatto piale, che collega il comportamento delle cellule con capacità proliferativa in un modo che ricorda i progenitori basali della corteccia dei mammiferi ^26. Ciò si riflette nel summenzionato stratificazione della EGL in tre sottolivelli che sono definiti da distinti ambienti extracellulari e dove precursori dei granuli hanno genica distinto firme ^18.

Proliferazione di progenitori nel oEGL avviene con una normale distribuzione delle dimensioni clone tale che quando progenitori sono singolarmente geneticamente etichettati al termine dello sviluppo embrionale nel topo, danno luogo ad una media di 250-500 mediana postmitotici gneuroni ranule ^27,28. Proliferazione dipende segnalazione SHH mitogenic dal sottostante Purkinje neuroni ^29-32. La capacità di rispondere a SHH ha dimostrato di essere interamente dipendente cella autonoma espressione del fattore di trascrizione Atoh1, sia in vitro che in vivo ^{33 34,35.} Allo stesso modo, l'uscita del ciclo cellulare e la differenziazione ha dimostrato di essere dipendente dalla espressione del fattore di trascrizione a valle NeuroD1 ^36, che è probabilmente un repressore diretta di Atoh1 ^37.

Nonostante questi progressi, e un notevole avanzamento nel decifrare la cellula base biologica di uscita ciclo cellulare ^38-42, i meccanismi molecolari fondamentali (s) che sono alla base della decisione di uscire dal ciclo cellulare e la transizione da un progenitore di un neurone di differenziazione, e la associato postmitotici migrazione tangenziale nel EGL interno così come l'interruttore dopoalla migrazione radiale, rimanere completamente sconosciuto. Questo è in gran parte a causa della intrattabilità sperimentale della EGL: si sta sviluppando tardi, e difficili da indirizzare geneticamente poiché molte delle stesse molecole neurogenici sono anche fondamentale precedenza nella vita dei precursori dei granuli al labbro romboidale. Per superare questo problema, numerosi autori hanno sviluppato in vivo e ex vivo elettroporazione come metodo per indirizzare il cervelletto postnatale nei roditori ^43-48. Qui, la strada nell'uso di ex vivo elettroporazione in pulcino per studiare la EGL, che rappresenta notevoli vantaggi in termini di costi e convenienza. Il nostro metodo di elettroporazione e ex vivo della cultura fetta di tessuto cerebellare pulcino utilizza tessuto sezionato dal giorno embrionale 14 pulcini al culmine di EGL proliferazione. Questo metodo permette di targeting genetico della EGL indipendentemente dal labbro romboidale e porranno le basi per la dissezione genetica della transizione da granuliprogenitore di postmitotici neurone granello nel cervelletto.

Protocollo

Nota: Tutti gli esperimenti sono stati effettuati con conformità a King College di Londra, Regno Unito e le linee guida per la cura degli animali nel Regno Unito Home Office.

1. La dissezione di e14 cervelletto

1. Incubare le uova marroni embrionate di gallina a 38 ° C e 14 ° giorno embrionale.
2. Utilizzando le forbici uovo decapitano embrione di pollo in ovo e rimuovere la testa di una capsula di Petri contenente ghiaccio PBS freddo (Figura 1A).
3. Utilizzando pinze standard, fare incisioni dietro ogni occhio tutto il percorso attraverso il tessuto, rimuovere gli occhi e mascella superiore. Effettuare una seconda incisione tutto il percorso attraverso la faringe rimuovere la mascella inferiore (Figura 1B).
4. Utilizzando pinze standard, rimuovere tutta la pelle dalla superficie del cranio con il peeling via (Figura 1C) e rimuovere le ossa frontali e parietali, rivelando cervello.
5. Dal punto di vista ventrale, rimuovere faringeo cartilagine e mesenchima ausiliario.
6. Da un lato dorsale, attentoly rimuovere mesenchima dorsale per romboencefalo facendo attenzione a non danneggiare pia, e tutto il cervello separato (Figura 1D).
7. Effettuare un'incisione tutto il percorso attraverso il tessuto tra mesencefalo e rombencefalo rombencefalo e separato tra cervelletto (Figura 1E).
8. Facendo incisioni tutto il percorso attraverso il tessuto ad entrambe le giunzioni laterali del cervelletto e piatto alare del hindbrain, rimuovere tutta cervelletto, avendo cura di mantenere l'integrità del pia tutta dissezione (Figura 1F). Rimuovere la formazione plesso coroideo (Figura 1G).
9. Spostare il cervelletto sezionato in freddo ghiaccio HBSS.

2. Fetta Cultura della E14 cervelletto

1. Trasferire la cervelletto alla piattaforma sterile di un Tissue Chopper utilizzando una spatola o un 3 ml pipetta Pasteur con la punta asportate per allargare l'apertura. Rimuovere il liquido in eccesso con una pipetta.
2. Tagliare tutto intero cervelletto in tha richiesto orientamento a 300 micron di spessore utilizzando il chopper tessuto impostare una velocità di taglio al 50% del massimo. L'integrità dei tessuti è più facilmente conservato in sezione sagittale; tuttavia, l'orientamento è anche un fattore importante per l'analisi delle cellule (cellule di Purkinje dendriti sono sagittalmente allineati, mentre assoni delle cellule granuli corrono trasversalmente, perpendicolare al piano di dendriti di cellule di Purkinje).
3. Usando una pipetta Pasteur 3 ml, coprire il cervelletto tagliato a freddo ghiaccio HBSS.
4. Trasferire le fettine in HBSS a una capsula di Petri 60 millimetri contenente ghiaccio fresco HBSS freddo con un 3 ml pipetta Pasteur con la punta tagliata.
5. Sotto un microscopio da dissezione illuminato con una sorgente di luce a fibre ottiche, garantire la separazione delle singole porzioni utilizzando pinze orologeria. Identificare le fette da elettroporate, basato sulla loro integrità dei tessuti e la posizione medio-laterale.
   Nota: Ogni dissezione dall'embrione attraverso tagliare incubazione in terreno di coltura dura circa 10-20 minuti a seconda upoesperienza n. Eseguire dissezioni una alla volta a garantire che cervelletti spendere quantità minima di tempo tra decapitazione ed ex vivo della cultura.

3. elettroporazione di fette

1. Costruire una camera di elettroporazione fissando l'anodo di un elettroporatore alla base di una capsula di Petri 60 mm con nastro isolante. Aggiungere circa 1 ml di HBSS per coprire l'elettrodo.
2. Collocare un inserto 0,4 micron cultura sopra dell'elettrodo rivestito in HBSS. Lasciare l'inserto cultura per riposare sull'elettrodo assicurandosi che c'è sempre il contatto tra l'inserto e l'elettrodo.
   Nota: In questa configurazione, l'inserto di coltura con le fette poggerà sulla superficie della soluzione, mantenendo il circuito ma permettendo il targeting spaziale del catodo.
3. Fette identificati di trasferimento (fino a cinque per inserto cultura) sui inserto cultura con 3 ml pipetta Pasteur con la punta tagliata. Separati e lasciare riposare su inserto cultura in un sagittAl orientamento.
4. Usando una pipetta, rimuovere l'eccesso di HBSS in modo che le fette siano più immersi in soluzione.
5. Usando una pipetta punta P10, pipetta DNA (ad una concentrazione di 1 mg / mL) diluito con il 20% veloce verde sulla superficie della regione di destinazione di una fetta. 20% verde veloce assicura soluzione di DNA viscosa e impedisce proibitivamente ampia dispersione del DNA. Aggiungere circa 5 DNA microlitri / veloce soluzione verde per ogni sezione (Figura 2B).
6. Posizionare il catodo, nel tessuto mirato desiderato e l'elettroporazione con 3 x 10 V, 10 impulsi di durata msec. Evitare il contatto diretto del catodo con il tessuto. Invece, usate tensione superficiale del liquido per mantenere conduttanza (posizionare il catodo più vicino al tessuto come possibile senza toccare il tessuto).
7. Ripetere la consegna del DNA ed elettroporazione di più regioni di EGL su ogni singola porzione del cervelletto, se lo desideri.
8. Al termine di elettroporazione, cultura trasferimento Insert a 30 mm piastra di Petri.
9. Per ogni cultura, aggiungere 1 ml di terreno di coltura pre-riscaldato (basale medio Aquila, 0,5% (w / v) D - (+) - glucosio, 1% supplemento B27, 2 mM di L-glutammina, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina) sotto l'inserto cultura tale che l'inserto cultura è in contatto con il mezzo, ma fette non sono immersi in esso.
10. Incubare culture a 37 ° C / 6% CO ₂ fino a 3 giorni. Sostituire tutto il terreno di coltura ogni 24 ore con terreno fresco pre-riscaldato.
11. Dopo coltura, fissare fette su inserti coltura per 1 ora a 4% paraformaldeide (o O / N a 4 ° C) in un piatto fresco 30 mm senza mezzi di coltura.

4. Imaging di cerebellari Fette

1. Dopo fissazione, lavare fette 3 volte per 5 minuti in PBS.
2. Utilizzando una lama di rasoio, sezionare ogni fetta cerebellare elettroporate e colta dall'inserto cultura tagliando intorno la fetta e la rimozione della fetta e la regione di inserto viene rispettato. FareNon tentare di rimuovere fetta dalla superficie dell'inserto cultura.
3. Montare fette in circa 1 ml di mezzo di montaggio contenente DAPI (se lo si desidera) sotto un vetrino facendo attenzione a non introdurre bolle, e immagine utilizzando scansione laser microscopia confocale.
   Nota: parametri di imaging possono essere variati secondo le costrutti elettroporate, ea discrezione del singolo utente.

Risultati

Questa sezione illustra esempi di risultati che si possono ottenere con la fetta elettroporazione e la cultura del cervelletto da embrionale Giorno 14 pulcino. La dissezione del cervelletto è illustrato nella figura 1 e la camera di elettroporazione impostato è mostrato in Figura 2. Si dimostra che è possibile per l'elettroporazione e con successo cultura fette cerebellare, che mantengono la loro struttura e morfologie cellulari ...

Discussione

Il protocollo qui riportato descrive un metodo per dissezione, electroporating e coltura fette di embrionale Giorno 14 cervelletto dal pulcino. Questo protocollo permette di targeting di elettroporazione per piccole regioni focali della EGL, compreso isolato di mira singoli lobi cerebellari. Consente analisi genetica e di imaging ad alta risoluzione e convenienza, e ad un basso costo rispetto alle tecniche consolidate nei roditori ^43-47. Tale analisi non è attualmente possibile in vivo a causa del lu...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tritatutto per tessuti McIlwain	Mickle Laboratory Engineering Ltd		Taglio a 300 μ m per ottenere i migliori risultati.
Aquila media basale (Gibco)	Life Technologies	41010-026
L-glutammina	Sigma	G7513
penicillina/streptomicina	Sigma	P4333
0,4 μ inserto per coltura	m Millipore	PICM0RG50
TSS20 Ovodyne electroporator	Intracel	01-916-02	Utilizzare 3 impulsi da 10 V, 10 msec per l'elettroporazione.