Method Article

Migliorata la generazione di cardiomiociti indotte usando un costrutto policistronico Esprimendo rapporto ottimale di Gata4, MEF2C e Tbx5

DOI:

10.3791/53426

⸱

November 13th, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, McAllister Heart Institute, University of North Carolina, Chapel Hill

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descriviamo qui un protocollo per la generazione di iCM utilizzando la somministrazione mediata da retrovirus di Gata4, Tbx5 e Mef2c in un costrutto policistico. Questo protocollo produce una popolazione relativamente omogenea di cellule riprogrammate con una migliore efficienza e qualità ed è prezioso per studi futuri sulla riprogrammazione di iCM.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La conversione diretta dei fibroblasti cardiaci (CFS) in cardiomiociti indotte (ICMS) ha un grande potenziale per la medicina rigenerativa, offrendo strategie alternative per il trattamento di malattie cardiache. Questa conversione è stato ottenuto mediante espressione forzata di fattori definiti come Gata4 (G), MEF2C (M) e Tbx5 (T). Tradizionalmente, ICMS sono generati da un cocktail di virus che esprimono questi singoli fattori. Tuttavia, riprogrammazione efficienza è relativamente basso e la maggior parte in vitro G, M, T-trasdotte fibroblasti non diventano completamente riprogrammati, rendendo difficile lo studio dei meccanismi di riprogrammazione. Abbiamo recentemente dimostrato che la stechiometria di G, M, T è fondamentale per un'efficiente riprogrammazione ICM. Un stechiometria ottimale di G, M, T ad alto livello relativo di M e bassi livelli di G e T ottenuti utilizzando il nostro vettore MGT policistronico (di seguito denominato MGT) significativamente maggiore efficienza riprogrammazione e una migliore qualità Icm in vitro. Qui forniamo una descrizione dettagliata della metodologia utilizzata per generare ICMS con MGT costrutto da fibroblasti cardiaci. Isolamento di fibroblasti cardiaci, la generazione di virus per la riprogrammazione e la valutazione del processo di riprogrammazione sono inclusi anche di fornire una piattaforma per la generazione efficiente e riproducibile di ICMS.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le malattie cardiovascolari rimangono la principale causa di morte in tutto il mondo, con 17,3 milioni di decessi all'anno1. La perdita di cardiomiociti dovuta a infarto del miocardio o insufficienza cardiaca progressiva è una delle principali cause di morbilità e mortalità2. A causa della limitata capacità rigenerativa, i cuori dei mammiferi adulti di solito soffrono di compromissione della funzione di pompa e insufficienza cardiaca a seguito di lesioni3-6. Pertanto, l'efficiente (ri)generazione di cardiomiociti in vivo e in vitro per il trattamento delle malattie cardiache e per la modellizzazione delle malattie è una questione critica che deve essere affrontata.

Il recente sviluppo della riprogrammazione diretta, che riprogramma direttamente le cellule da un fenotipo differenziato all'altro senza passare attraverso lo stato pluripotente, offre un promettente approccio alternativo per la medicina rigenerativa. Il cuore dei mammiferi contiene abbondanti fibroblasti cardiaci (FC), che rappresentano circa la metà delle cellule del cuore e proliferano massicciamente dopo la lesione7-9. Pertanto, il vasto pool di FC potrebbe fungere da fonte endogena di nuovi CM per la terapia rigenerativa se potessero essere riprogrammati direttamente in CM funzionali. È stato dimostrato che una combinazione di fattori di trascrizione, come Gata4 (G), Mef2c (M) e Tbx5 (T), con o senza microRNA o piccole molecole può riprogrammare i fibroblasti in iCM10-26. È importante sottolineare che questa conversione può essere indotta anche in vivo e si traduce in un miglioramento della funzione cardiaca e in una riduzione delle dimensioni della cicatrice in un cuore infartuato16,27-29. Questi studi indicano che la riprogrammazione cardiaca diretta può essere una potenziale strada per guarire un cuore ferito. Tuttavia, la bassa efficienza della riprogrammazione iCM è diventata un ostacolo importante per ulteriori studi meccanicistici. Inoltre, la riproducibilità della riprogrammazione cardiaca è un'altra questione controversa di questa tecnologia11,30,31.

Molto recentemente, abbiamo generato un set completo di costrutti policistronici che codificano G,M,T in tutti i possibili ordini di splicing con sequenze 2A identiche in un singolo mRNA. Questi costrutti policistronici hanno prodotto vari livelli di espressione delle proteine G, M e T, che hanno portato a un'efficienza di riprogrammazione significativamente diversa25. Il costrutto più efficiente, denominato MGT, che mostrava un'espressione relativamente alta di Mef2c e una bassa espressione di Gata4 e Tbx5, ha migliorato significativamente l'efficienza di riprogrammazione e ha prodotto grandi quantità di iCM con espressione di marcatori CM, robusta oscillazione del calcio e battito spontaneo25. Inoltre, utilizzando il costrutto policistronico MGT, il nostro studio ha evitato l'uso di vettori multipli e ha generato cellule con rapporto di espressione omogeneo di G,M,T, fornendo così una piattaforma migliorata per la ricerca sulla riprogrammazione cardiaca. Per aumentare la riproducibilità sperimentale, qui descriviamo in dettaglio come isolare i fibroblasti, produrre cassette MGT trasportatrici di retrovirus, generare iCM e valutare l'efficienza della riprogrammazione.

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Protocol

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Il protocollo descritto qui utilizza topi neonati. La cura degli animali e gli esperimenti sono eseguiti in conformità con le linee guida stabilite dalla Divisione di Medicina di Laboratorio animali (àlam) presso l'Università del North Carolina, Chapel Hill.

1. Preparazione di buffer e Media

  1. Preparare fibroblasti (FB) mezzo: Supplemento 500 ml supporti IMDM con 100 ml di siero fetale bovino (FBS) e 6 ml di penicillina / streptomicina.
  2. Preparare ICM medio: Supplemento 400 ml supporti DMEM con 100 ml mezzi M199 e 50 ml di FBS.
  3. Preparare media B27: Supplemento 490 ml RPMI1640 multimediali con 10 ml B27 media.
  4. Preparare Plat-E terreno di coltura: Supplemento 500 ml supporti DMEM con 50 ml di FBS, 5 ml di penicillina / streptomicina e 5 ml aminoacidi non essenziali.
  5. Preparare Plat-E medio trasfezione: Supplemento 500 ml supporti DMEM con 50 ml di FBS e 5 ml aminoacidi non essenziali.
  6. Prepare gelatina rivestito 24 pozzetti: Aggiungere soluzione di gelatina 0,5 ml di 0,1% ad un pozzo di 24 pozzetti, incubare a 37 ° C per almeno 10 minuti e aspirare a destra prima dell'uso.
  7. Preparare tampone etichettatura FACS: Supplemento 500 ml DPBS con 10 ml di FBS e 2 ml di EDTA (0,5 M) per raggiungere una concentrazione finale di 2 mm. Passare attraverso un filtro di 0,22 micron e conservare a 4 ° C.
  8. Preparare MACS ordinamento buffer: Supplemento 500 ml DPBS con 2,5 g BSA e 2 ml di EDTA (0,5 M) per ottenere una concentrazione finale di 2 mM. Passare attraverso un filtro di 0,22 micron e conservare a 4 ° C.
  9. Preparare tampone HBS 2x per trasfezione: integrare 500 ml di tampone HEPES (50 mM) con 280 mM NaCl (8,1816 g), KCl 10 mM (0,37,275 mila g), 1,5 mM Na 2 HPO 4 (0,10,647 mila g), glucosio 12 mM (1,08,096 mila g ). Aggiungere circa 650 ml NaOH 10 N per aggiustare il pH a 7,05-7,12. Filtrare attraverso un filtro di 0,22 micron pori e conservare a 4 ° C.
  10. Preparare 2,5 M CaCl 2 soluzione per la trasfezione: Aggiungere 18,376 g CaCl 2 a 50 ml DDH 2 O. Filtrare attraverso un filtro di 0,22 micron pori e conservare a 4 ° C.
  11. Preparare ICC (immunoistochimica) tampone fissazione: Aggiungere 5 ml di paraformaldeide (PFA, 32%) a 35 ml DPBS per raggiungere una concentrazione finale del 4%.
  12. Preparare tampone permeabilizzazione ICC: Aggiungere 0,1 ml di Triton a 100 ml DPBS per raggiungere una concentrazione finale di 0,1%.
  13. Preparare ICC tampone bloccante: Aggiungere 5 g di albumina di siero bovino (BSA) per 100 ml DPBS per raggiungere una concentrazione finale del 5%.
  14. Preparare tampone colorazione ICC: Aggiungere 1 g BSA a 100 ml DPBS per raggiungere una concentrazione finale di 1%.

2. Generazione di neonatali mouse fibroblasti cardiaci

  1. Generare fibroblasti cardiaci dal metodo di coltura espianto
    1. Clean neonatale αMHC-GFP topo transgenico (P1 a P2) con il 75% di etanolo. Tagliare la testa con le forbici sterili. Poi fare una incisione orizzontale da sotto un'ascella all'altra. Utilizzare uno sterileforcipe smussato e piegate a sezionare il cuore e collocarlo in un pozzetto della piastra 24 pozzetti contenenti tampone PBS ghiacciata.
      1. In alternativa, spremere il cuore dopo l'incisione orizzontale.
    2. Controllare espressione GFP nel cuore al microscopio a fluorescenza. Poiché l'espressione GFP è guidato da αMHC promotore che è un promotore specifico cardiaco, cuore di topo transgenico dovrebbe essere in verde 15, mentre il cuore negativo è scarsa in alcuna fluorescenza.
    3. Prendere 3-4 GFP cuori positivi in un centro ben piatto di coltura 60 mm e tritateli pezzetti meno di 1 mm 3 dimensioni di forbici sterili e pinze.
    4. Mettere 3-4 cuori tritato in un piatto 10 centimetri con 2 ml di mezzi FB. Lasciate che i tessuti stabilirsi per 3 ore.
    5. Lentamente aggiungere 8 ml supporti FB pre-riscaldato per i piatti contenenti tessuti cardiaci. Non disturbare i tessuti per tre giorni.
    6. Sostituire i media ogni tre giorni.
    7. Il giorno 7, aspirmangiato il terreno di coltura e lavare le cellule con DPBS. Aggiungere 3 ml 0,05% tripsina per ciascuna piastra e digerire a 37 ° C per 5 min.
    8. Aggiungere 5 ml supporto FB per placare la tripsina. Staccare delicatamente le cellule con un raschietto cellulare. Pipettare media su e giù per dissociare ulteriormente meccanicamente il tessuto.
    9. Raccogliere le cellule e filtrare attraverso 40 micron filtri cellulari per evitare la contaminazione dei frammenti di tessuto cardiaco, e poi pellet cellule facendo girare a 200 xg per 5 min.
    10. Lavare le cellule una volta con MACS tampone e le cellule sono pronte per l'ordinamento.
  2. Generare fibroblasti cardiaci dal metodo di digestione enzimatica
    1. Harvest GFP cuori positivi come 2.1.1. Trasferire tutti i cuori in un piatto 10 centimetri con 10 ml di DPBS ghiacciate.
    2. Spremere ventricoli con pinza sterile per rimuovere il sangue e lavare una volta con DPBS gelide.
    3. Tagliare i cuori di essere libero di altri tessuti e grasso.
    4. Tagliare ogni cuore in circa 4 pezzi che sono ancora collegate liberamente.
    5. Se meno di 20 cuori, trasferire i cuori in un tubo da 15 ml con 8 ml caldo 0,05% tripsina-EDTA, e incubare a 37 ° C per 15 min.
      1. Se ci sono 20-30 cuori, trasferire i cuori in una provetta conica da 50 ml con 10 ml caldo 0,05% tripsina-EDTA, e incubare a 37 ° C per 15 min.
    6. Eliminare la tripsina e aggiungere 5 ml (per meno di 20 cuori) o 10 ml (per 20-30 cuori) caldo collagenasi di tipo II (0,5 mg / ml) in HBSS.
    7. Vortex tubo sul vortex per 1 min a livello velocità intorno 4 a 6 (se il liquido non ottiene fino al coperchio, allora la velocità è bene).
    8. Incubare la provetta in 37 ° C bagnomaria per 3-5 minuti.
    9. Vortex la provetta per 1 min.
    10. Sedimenti per 1 min per gravità fino a che i pezzi di tessuto stabilirsi, raccogliere il liquido in un nuovo tubo contenente 5 ml di medie FB freddo.
    11. Ripetere i punti 2.2.6-2.2.10 3-5 volte.
    12. Unire tutte le collezioni filtrando attraverso 40 micron colino cellaper rendere sospensione singola cella.
    13. Centrifugare a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C.
    14. Risospendere le cellule in 10 ml MACS buffer e centrifugare a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C.
    15. Opzionale: se ci sono un sacco di cellule del sangue, risospendere le cellule con 1 ml di RBC tampone di lisi (150 mm NH 4 Cl, 10 KHCO mm 3, e 0.1 mM EDTA), tenere in ghiaccio per 1 minuto, quindi diluire con 10 ml MACS buffer e centrifugare a 200 xg per 5 min. Lavare una volta con il tampone MACS.
  3. Isolamento di Thy1.2 + fibroblasti da MACS (magnetico attivato separazione delle cellule)
    1. Determinare il numero di cellule vitali attraverso tripano colorazione blu.
      1. Prendere 10 celle microlitri dalla sospensione cellulare 10 ml al punto 2.2.14. Mescolare con 10 microlitri 0,4% trypan soluzione blu.
      2. Aggiungere il composto di un emocitometro. Lasciare riposare per 3-5 minuti e poi esaminare immediatamente al microscopio. Le cellule morte vengono colorate in cellule blu e vitali sono senza macchia.
      3. contare tutte le cellule vitali in quattro piazze 1 millimetro d'angolo del emocitometro. Determinare il numero di cellule vitali: il numero medio per quadrato x 2 (fattore di diluizione) x 10 4 x 10 (volume totale della sospensione cellulare).
    2. Per meno di 1 x 10 7 cellule, risospendere le cellule con 10 microlitri microsfere Thy1.2 in 90 microlitri di buffer MACS refrigerati. Aggiungere più perline proporzionalmente se ci sono più di 1 x 10 7 cellule. Mescolare bene e incubare in frigorifero (2-8 ° C) per 30 min.
    3. Aggiungere 10 ml MACS tampone e campioni di spin a 200 xg per 5 minuti; lavare una volta con tampone 10 ml MACS e centrifugare di nuovo.
    4. Portare il volume a 2 ml in tampone MACS.
    5. Impostare un separatore MACS in cappuccio. Inserire una colonna LS al separatore. Applicare 3 ml MACS Buffer alla colonna di equilibrare esso.
    6. Passare la sospensione cellulare attraverso la colonna LS equilibrata.
    7. Lavare 3 volte con 2 ml di buffer MACS ogni volta.
    8. Prendere colonna LS fuori tlui separatore ed eluire 3 volte con 2 ml MACS tampone in un nuovo tubo da 50 ml.
    9. Spin a 200 xg per 5 min.
    10. Risospendere le cellule in 10 ml di FB media, contano le cellule e le sementi in piastre a giusta densità. Per fibroblasti generati dal metodo di coltura espianto, la semina di cellule densità potrebbe essere circa 2-3 x 10 4 cellule / pozzetto di 24 pozzetti. Per fibroblasti generati dal metodo di digestione enzimatica, la densità di cellule potrebbe essere di circa 4-5 x 10 4 cellule / pozzetto di 24 pozzetti.

3. Generazione di Retrovirus per ICM Riprogrammazione

Nota: Effettuare le seguenti operazioni in un BSL2 Cappa di sicurezza biologica in condizioni sterili. Il corretto smaltimento delle cellule transfettate, puntali e tubi si consiglia di evitare il rischio di rischi ambientali e per la salute.

  1. Mantenere le cellule Plat-E a Plat-E multimediale integrato con 1 mg / ml puromicina e 10 ug / ml blasticidin a 37 ° C con 5% di CO 2.
  2. Il giorno 2, sostituire il mezzo con Plat-E terreno di coltura privo di puromicina e blasticidin.
  3. Il giorno 0, dividere le celle Plat-E in 10 cm piatti del giorno prima trasfezione a circa 4-5 x 10 6 cellule per piastra. Le cellule devono essere ~ 80-90% confluenti il ​​giorno della trasfezione.
  4. Il giorno 1, il cambiamento culturale dei media ai media di trasfezione su cellule entro 1 ora prima della trasfezione. Trasfezione procedimento è il seguente:
    1. Trasfezione utilizzando kit commerciali
      1. Mescolare 20 ml di reagente di trasfezione (ad esempio Lipofectamine) e 500 microlitri mezzi siero ridotto (ad esempio, Opti-MEM). Aggiungere 10 ug del plasmide retrovirale per altri 500 microlitri ridotte supporti siero. Incubare ogni miscela a temperatura ambiente (RT) per 5 min.
      2. Aggiungere lentamente il composto plasmide di miscela di trasfezione. Questo passaggio potrebbe richiedere 15-30 secondi. Incubare la miscela per 20 minuti a temperatura ambiente (soluzione può apparire torbida).
      3. Aggiungete il composto goccia a goccia per le cellule.
      4. Incubare per una notte in un incubatore a 37 °.
    2. Trasfezione con fosfato di calcio.
      1. Mescolare 40 ml 2.5 M CaCl 2 e 440 ml DDH 2 O, quindi aggiungere 20 mg del plasmide retrovirale (regolare la quantità di DDH 2 O in modo che il volume totale è di 500 microlitri).
      2. Aggiungere 500 microlitri 2x HBS in una provetta da 15 ml.
      3. Vortex la HBS e nel frattempo aggiungere la miscela Calcio-DNA alla HBS cadere saggio. Questa fase dura circa 30 secondi per ogni campione. Quindi al massimo fare 3-4 campioni contemporaneamente.
      4. Incubare a temperatura ambiente per 3 minuti di incubazione per più tempo porta a grandi precipitato e meno cellule assumerà il precipitato.
      5. Aggiungere il composto cadere saggio alle cellule e osservare sotto 20X microscopio. Precipitati fini (un sacco di piccoli sono buone, ma pochi grandi non sono buone) dovrebbe essere visto.
      6. Incubare una notte a 37 ° C incubatore.
  5. Il giorno 2, cambiare media su cellule con 8 ml preriscaldata coltura. Incubare per 24 ore.
  6. Il giorno 3 e il giorno 4, raccogliere coltura supernatante dai piatti utilizzando una siringa monouso 10 ml sterile, filtrandola attraverso un filtro di acetato di cellulosa dimensioni 0,45 micron pori, e il trasferimento in un tubo da 50 ml. Aggiungere 2 ml di soluzione retrovirus precipitazioni per ogni 8 ml contenente il virus surnatante. Mescolare delicatamente e incubare una notte a 4 ° C.
  7. Il giorno 5, girare la miscela virale a 1.500 xg a 4 ° C per 30 min. Le particelle virali dovrebbero apparire in pellet bianco sul fondo della provetta.
  8. Scartare il surnatante. Spin down soluzione residua mediante centrifugazione a 1500 xg per 5 min. Eliminare tutte le tracce di liquido per aspirazione, facendo molta attenzione a non disturbare le particelle retrovirali precipitati in pellet.
  9. Risospendere pellet retrovirali con 100 microlitri di buffer DPBS per ogni 8 ml surnatante virale. Aliquotail virus su ghiaccio. Utilizzare immediatamente o conservare a -80 ° C.

4. La riprogrammazione dei fibroblasti cardiaci

  1. Aggiungere 4 ml di 10 mg / ml soluzione polibrene nel Icm medio di 10 ml, e mescolare delicatamente pipettando su e giù. La concentrazione finale di polibrene è 4 mg / ml.
  2. Aggiungere 500 microlitri mezzi ICM contenente polibrene a ciascun pozzetto di 24 pozzetti seminato con fibroblasti.
  3. Aggiungere 10 microlitri retrovirus a ciascun pozzetto contenente sia 2-3 x 10 4 cellule della cultura espianto o 4-5 x 10 4 cellule da metodo digestione enzimatica. La quantità di virus deve essere aumentato proporzionalmente con l'aumento del numero di cellule in diverse piastre di coltura o piatti. Mettere la piastra a 37 ° C per 24-48 hr incubatore per consentire l'infezione virale. La linea di tempo per la riprogrammazione cardiaca è mostrato in Figura 1.
  4. Dopo trasduzione virale, sostituire il virus contenente media con 500 microlitri mezzi regolare ICM.
  5. Modificare i media ogni 2-3 giorni. Per la selezione positiva delle cellule trasdotte virali, aggiungere media ICM integrato con puromicina a 2 mg / ml alle cellule bersaglio. Keep it per tre giorni. Dopo di che, mantenere puromicina nel mezzo ICM alla concentrazione di 1 mg / ml.
  6. Tre giorni dopo l'infezione virale, prendere la targa fuori dalla incubatrice e posizionarlo sotto un microscopio a fluorescenza invertito (20X) per osservare l'espressione della GFP.
    Nota: Dieci giorni dopo l'infezione virale, le cellule possono essere raccolte per l'analisi FACS e analisi ICC per determinare l'efficienza riprogrammazione (nel passaggio 5 e 6).
  7. Quattordici giorni dopo l'infezione virale, sostituire ICM media con i media B27. Modificare i media ogni tre giorni. Spontaneo pestaggio loci cella può apparire da tre (cellule da metodo di digestione enzimatica) o quattro (cellule da espianto metodo cultura) settimane dopo la trasduzione virale.

5. Analisi immunocitochimica di efficienza Riprogrammazione

  1. Cellule risciacquocon ghiaccio PBS freddo per tre volte; rimuovere la soluzione in eccesso.
  2. Aggiungere 0,5 ml di tampone di fissaggio ICC a ciascun pozzetto di piastre da 24 pozzetti. Fissare le cellule a temperatura ambiente per 15-20 minuti.
  3. Risciacquare le cellule con PBS per tre volte.
  4. Aggiungere 0,5 ml di buffer permeabilizzazione ICC a ciascun pozzetto di piastre da 24 pozzetti. Permeabilize le cellule a temperatura ambiente per 15 min.
  5. Risciacquare le cellule con PBS per tre volte.
  6. Aggiungere 0,5 ml ICC tampone di bloccaggio in ciascun pozzetto di 24 pozzetti, incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
  7. Anticorpi primari diluiti con tampone colorazione ICC. Aggiungere 200 ml di soluzioni di anticorpi a ogni pozzetto e incubare una notte a 4 ° C. I fattori di diluizione anticorpo sono elencati in Materiali.
  8. Il giorno dopo, lavare le cellule con PBS per tre volte.
  9. Aggiungere 200 microlitri di soluzioni di anticorpi secondari alle cellule e incubare per 1 ora a RT nel buio.
  10. Lavare le cellule con PBS per tre volte.
  11. Aggiungere 150 ml soluzione contenente DAPI in ogni pozzetto di montaggio. Lasciare macchia nuclei per 1 min. Poicoprire ogni pozzetto con copertura in vetro rotondo slittamento e premere delicatamente la polizza contro la superficie inferiore con una pinza per rimuovere le bolle d'aria.
  12. Aspirare la soluzione in eccesso ed i campioni sono pronti per l'imaging. Le immagini rappresentative che mostrano le cellule riprogrammate che esprimono marcatore cardiaco cTnT e αActinin a d14 sono mostrati in figura 2B.

6. Analisi FACS di Riprogrammazione Efficienza

  1. Lavare accuratamente le cellule una volta con DPBS. Aggiungere 0,3 ml di tripsina (0,05%) a ciascun pozzetto e incubare a 37 ° C per 5 min.
  2. Battere delicatamente la piastra per facilitare il sollevamento delle cellule. Controllare il distacco delle cellule sotto il microscopio. Aggiungere 1 ml di FACS tampone di quando la maggior parte delle cellule sono dissociate. Pipetta su e giù per dissociare ulteriormente meccanicamente le cellule.
  3. Trasferire le cellule nella piastra 24 pozzetti ad una piastra ben pozzo profondo 96 pozzo a pozzo. Spin a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C per raccogliere le cellule.
  4. Lavare le cellule una volta conBuffer di FACS.
  5. Aggiungere 100 ml di soluzioni di fissaggio / permeabilizzazione per risospendere le cellule per 20 minuti a 4 ° C.
  6. Lavare le cellule due volte con soluzione di lavaggio 1x, pellet, e rimuovere il surnatante.
  7. Preparare la soluzione anticorpo primario contro GFP e cTnT in tampone di lavaggio 1x. Risospendere accuratamente ciascun campione con soluzione di anticorpi 50 microlitri e incubare a 4 ° C per 30 min.
  8. Lavare le cellule una volta nella soluzione di lavaggio 1x, pellet, e rimuovere il surnatante.
  9. Aggiungere 50 ml soluzione di anticorpo secondario contenente Alexa Fluor IgG anti-coniglio 488 asino coniugato e Alexa Fluor 647 asino coniugato anti-topo IgG per ogni campione. Incubare a 4 ° C per 30 minuti in scuro.
  10. Lavare le cellule una volta nella soluzione di lavaggio 1x, pellet, e rimuovere il surnatante.
  11. Risospendere le cellule in 400 microlitri di buffer di fissazione (DPBS con 1% PFA). Trasferimento delle cellule in provetta FACS con tappo colino cella. I campioni sono pronti per il rilevamento di FACS. Il rappresentante analisi FACS di riprogrammazione efficiency utilizzando pMxs-puromicina-MGT costrutto con o senza selezione puromicina è mostrato in Figura 2A.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le fasi di riprogrammazione sono riassunti da schema in figura 1. Dopo MGT trasduzione, l'espressione della GFP in riprogrammazione delle cellule potrebbe essere rilevato fin dal giorno 3. puromicina selezione di cellule trasdotte parte da giorno 3 e viene mantenuta durante le prime due settimane se PMX-puro è usato costrutto -MGT. Di giorno 10 al giorno 14, espressione di marcatori cardiaci come cTnT e αActinin potrebbe essere rilevato da entrambi ICC (Figura 2B, punto 5) e FACS

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per il successo generazione ICM quando si utilizza questo protocollo, ci sono diversi fattori importanti che hanno un impatto sull'efficienza complessiva. In particolare le condizioni di fibroblasti di partenza e la qualità di codifica retrovirus MGT possono influenzare notevolmente l'efficienza riprogrammazione.

È importante generare fibroblasti fresco e sano possibile. Per espianto metodo di coltura, i fibroblasti possono essere utilizzati prima di sette giorni dopo gli espianti so...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siamo grati per l'assistenza tecnica esperta del nucleo di citometria a flusso UNC e del nucleo di microscopia UNC. Ringraziamo i membri del laboratorio Qian e del laboratorio Liu per le utili discussioni e le revisioni critiche del manoscritto. Questo studio è stato supportato da NIH/NHLBI R00 HL109079 sovvenzione al Dr. Liu e all'American Heart Association (AHA) Scientist Development Grant 13SDG17060010 e alla Ellison Medical Foundation (EMF) New Scholar Grant AG-NS-1064-13 al Dr. Qian.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
anti-troponina cardiaca TThermo ScientificMS-295-PO1:200 per FACS e 1:400 per ICC
anti-GFPLife TechnologiesA111221:500 sia per FACS che per ICC
anti-aActininSigma-AldrichA78111:500 sia per FACS che per ICC
anti-Connexin43Sigma-AldrichC62191:500 per  ICC
anit-Mef2cAbcamab646441:1.000 per ICC 
anti-Gata4Santa Cruz Biotechnologysc-1237 1:200 per ICC
anti-Tbx5Santa Cruz Biotechnologysc-178661:200 per ICC
Alexa Fluor 488– asino coniugato anti-coniglio IgGJackson ImmunoResearch Inc711-545-1521:500 sia per FACS che per ICC
Alexa Fluor 647... asino coniugato anti-topo IgGJackson ImmunoResearch Inc715-605-1501:500 sia per FACS che per ICC
Kit Cytofix/Cytoperm per colorazione intracellulareBD Biosciences554722
Rhod-3 Calcium Imaging KitLife TechnologiesR10145
Thy1.2 microsfereMiltenyi Biotec130-049-101
Soluzione Vectashield con DAPIVector labsH-1500
FBSSigma-AldrichF-2442
Tripsina-EDTA (0,05%)Corning25-052
PRMI1640 mediumLife Technologies11875-093
B27 supplementoLife Technologies17504-044
IMDMLife Technologies12440-053
Opti-MEM Siero ridottoMedium Life Technologies31985-070
M199 MediumLife Technologies10-060
DMEM, alto glucosioLife Technologies10-013
Penicillina-streptomicinaCorning30-002
Aminoacidi non essenzialiLife Technologies11130-050
Lipofectamine 2000Life Technologies11668500
blasticidinaLife TechnologiesA11139-03
puromicinaLife TechnologiesA11138-03
Collagenasi IIWorthingtonLS004176
polibreneMilliporeTR-1003-G
Triton X-100FisherBP151-100
CaCl< sub>2Sigma-AldrichC7902
HEPESSigma-AldrichH4034
NaClSigma-AldrichBP358-212
KClSigma-AldrichPX1405
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
GlucosioSigma-AldrichG6152
Albumina sierica bovinaFisher9048-46-8
paraformaldeideEMS15714
Soluzione di precipitazione del retrovirusALSTEMVC-200
Soluzione di blu di tripano allo 0,4%Sigma-AldrichT8154
gelatinaSigma-AldrichG1393
PBS di Dulbecco senza CaCl2 e MgCl2 (D-PBS, 1x)Sigma-AldrichD8537
HBSS (soluzione salina bilanciata Hanks)Corning21022
LS colonnaMiltenyi Biotec130-042-401
0,45 μ m filtro in acetato di cellulosa Thermo Scientific190-2545
piastre a 24 pozzettiCorning3524
piastre per coltura tissutale da 10 cm Thermo Scientific172958
60 mm   Corning3260
96 Well Clear V-Bottom 2 ml Piastra a pozzetti profondi in polipropileneDenville ScientificP9639
Provette a fondo tondo in polistirene con tappo per filtro cellulare.BD Biosciences352235
CentrifugaEppendorf5810R
Vortexer MINIVWR58816-121
EVOS FL Sistema di imaging cellulare automaticoTecnologie di vitaAMAFD1000
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Separatore MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-302
Vetrino coprioggetto rotondomicroscopia elettronica Scienze72195-15
Piatto di coltura a pozzetto centrale da in

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2015 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. , (2014).
  2. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, (2010).
  3. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493, 433-436 (2013).
  4. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
  5. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17169-17174 (2009).
  6. Choi, W. Y., Poss, K. D. Cardiac regeneration. Curr Top Dev Biol. 100, 319-344 (2012).
  7. Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A. Cardiac fibroblast: the renaissance cell. Circ Res. 105, 1164-1176 (2009).
  8. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16, 233-244 (2009).
  9. Moore-Morris, T., et al. Resident fibroblast lineages mediate pressure overload-induced cardiac fibrosis. J Clin Invest. 124, 2921-2934 (2014).
  10. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  11. Chen, J. X., et al. Inefficient reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes using Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 50-55 (2012).
  12. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8, e63577(2013).
  13. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1, 235-247 (2013).
  14. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100, 105-113 (2013).
  15. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142, 375-386 (2010).
  16. Inagawa, K., et al. Induction of cardiomyocyte-like cells in infarct hearts by gene transfer of Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 1147-1156 (2012).
  17. Islas, J. F., et al. Transcription factors ETS2 and MESP1 transdifferentiate human dermal fibroblasts into cardiac progenitors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 13016-13021 (2012).
  18. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110, 1465-1473 (2012).
  19. Muraoka, N., et al. MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures. Embo J. 33, 1565-1581 (2014).
  20. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141, 4267-4278 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 5588-5593 (2013).
  22. Protze, S., et al. A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells. J Mol Cell Cardiol. 53, 323-332 (2012).
  23. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8, 1204-1215 (2013).
  24. Wang, H., et al. Small Molecules Enable Cardiac Reprogramming of Mouse Fibroblasts with a Single Factor, Oct4. Cell Rep. , (2014).
  25. Wang, L., et al. Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 Influences the Efficiency and Quality of Induced Cardiac Myocyte Reprogramming. Circ Res. , (2014).
  26. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  27. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  28. Mathison, M., et al. In vivo cardiac cellular reprogramming efficacy is enhanced by angiogenic preconditioning of the infarcted myocardium with vascular endothelial growth factor. J Am Heart Assoc. 1, e005652(2012).
  29. Srivastava, D., Ieda, M., Fu, J., Qian, L. Cardiac repair with thymosin beta4 and cardiac reprogramming factors. Ann NY Acad Sci. 1270, 66-72 (2012).
  30. Muraoka, N., Ieda, M. Stoichiometry of transcription factors is critical for cardiac reprogramming. Circ Res. , 116-216 (2015).
  31. Srivastava, D., Ieda, M. Critical factors for cardiac reprogramming. Circ Res. 111, 5-8 (2012).

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