Descriviamo qui un protocollo per la generazione di iCM utilizzando la somministrazione mediata da retrovirus di Gata4, Tbx5 e Mef2c in un costrutto policistico. Questo protocollo produce una popolazione relativamente omogenea di cellule riprogrammate con una migliore efficienza e qualità ed è prezioso per studi futuri sulla riprogrammazione di iCM.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Migliorata la generazione di cardiomiociti indotte usando un costrutto policistronico Esprimendo rapporto ottimale di Gata4, MEF2C e Tbx5
In questo articolo
Sommario
Abstract
La conversione diretta dei fibroblasti cardiaci (CFS) in cardiomiociti indotte (ICMS) ha un grande potenziale per la medicina rigenerativa, offrendo strategie alternative per il trattamento di malattie cardiache. Questa conversione è stato ottenuto mediante espressione forzata di fattori definiti come Gata4 (G), MEF2C (M) e Tbx5 (T). Tradizionalmente, ICMS sono generati da un cocktail di virus che esprimono questi singoli fattori. Tuttavia, riprogrammazione efficienza è relativamente basso e la maggior parte in vitro G, M, T-trasdotte fibroblasti non diventano completamente riprogrammati, rendendo difficile lo studio dei meccanismi di riprogrammazione. Abbiamo recentemente dimostrato che la stechiometria di G, M, T è fondamentale per un'efficiente riprogrammazione ICM. Un stechiometria ottimale di G, M, T ad alto livello relativo di M e bassi livelli di G e T ottenuti utilizzando il nostro vettore MGT policistronico (di seguito denominato MGT) significativamente maggiore efficienza riprogrammazione e una migliore qualità Icm in vitro. Qui forniamo una descrizione dettagliata della metodologia utilizzata per generare ICMS con MGT costrutto da fibroblasti cardiaci. Isolamento di fibroblasti cardiaci, la generazione di virus per la riprogrammazione e la valutazione del processo di riprogrammazione sono inclusi anche di fornire una piattaforma per la generazione efficiente e riproducibile di ICMS.
Introduzione
Le malattie cardiovascolari rimangono la principale causa di morte in tutto il mondo, con 17,3 milioni di decessi all'anno1. La perdita di cardiomiociti dovuta a infarto del miocardio o insufficienza cardiaca progressiva è una delle principali cause di morbilità e mortalità2. A causa della limitata capacità rigenerativa, i cuori dei mammiferi adulti di solito soffrono di compromissione della funzione di pompa e insufficienza cardiaca a seguito di lesioni3-6. Pertanto, l'efficiente (ri)generazione di cardiomiociti in vivo e in vitro per il trattamento delle malattie cardiache e per la modellizzazione delle malattie è u....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Il protocollo descritto qui utilizza topi neonati. La cura degli animali e gli esperimenti sono eseguiti in conformità con le linee guida stabilite dalla Divisione di Medicina di Laboratorio animali (àlam) presso l'Università del North Carolina, Chapel Hill.
1. Preparazione di buffer e Media
- Preparare fibroblasti (FB) mezzo: Supplemento 500 ml supporti IMDM con 100 ml di siero fetale bovino (FBS) e 6 ml di penicillina / streptomicina.
- Preparare ICM medio: Supplemento 400 ml supporti DMEM con 100 ml mezzi M199 e 50 ml di FBS.
- Preparare media B27: Sup....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Le fasi di riprogrammazione sono riassunti da schema in figura 1. Dopo MGT trasduzione, l'espressione della GFP in riprogrammazione delle cellule potrebbe essere rilevato fin dal giorno 3. puromicina selezione di cellule trasdotte parte da giorno 3 e viene mantenuta durante le prime due settimane se PMX-puro è usato costrutto -MGT. Di giorno 10 al giorno 14, espressione di marcatori cardiaci come cTnT e αActinin potrebbe essere rilevato da entrambi ICC (Figura 2B, punto 5) e FACS
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Per il successo generazione ICM quando si utilizza questo protocollo, ci sono diversi fattori importanti che hanno un impatto sull'efficienza complessiva. In particolare le condizioni di fibroblasti di partenza e la qualità di codifica retrovirus MGT possono influenzare notevolmente l'efficienza riprogrammazione.
È importante generare fibroblasti fresco e sano possibile. Per espianto metodo di coltura, i fibroblasti possono essere utilizzati prima di sette giorni dopo gli espianti so.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Siamo grati per l'assistenza tecnica esperta del nucleo di citometria a flusso UNC e del nucleo di microscopia UNC. Ringraziamo i membri del laboratorio Qian e del laboratorio Liu per le utili discussioni e le revisioni critiche del manoscritto. Questo studio è stato supportato da NIH/NHLBI R00 HL109079 sovvenzione al Dr. Liu e all'American Heart Association (AHA) Scientist Development Grant 13SDG17060010 e alla Ellison Medical Foundation (EMF) New Scholar Grant AG-NS-1064-13 al Dr. Qian.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| anti-troponina cardiaca T | Thermo Scientific | MS-295-PO | 1:200 per FACS e 1:400 per ICC |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | 1:500 sia per FACS che per ICC |
| anti-aActinin | Sigma-Aldrich | A7811 | 1:500 sia per FACS che per ICC |
| anti-Connexin43 | Sigma-Aldrich | C6219 | 1:500 per ICC |
| anit-Mef2c | Abcam | ab64644 | 1:1.000 per ICC |
| anti-Gata4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1237 1 | :200 per ICC |
| anti-Tbx5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17866 | 1:200 per ICC |
| Alexa Fluor 488– asino coniugato anti-coniglio IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 711-545-152 | 1:500 sia per FACS che per ICC |
| Alexa Fluor 647... asino coniugato anti-topo IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 715-605-150 | 1:500 sia per FACS che per ICC |
| Kit Cytofix/Cytoperm per colorazione intracellulare | BD Biosciences | 554722 | |
| Rhod-3 Calcium Imaging Kit | Life Technologies | R10145 | |
| Thy1.2 microsfere | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | |
| Soluzione Vectashield con DAPI | Vector labs | H-1500 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F-2442 | |
| Tripsina-EDTA (0,05%) | Corning | 25-052 | |
| PRMI1640 medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| B27 supplemento | Life Technologies | 17504-044 | |
| IMDM | Life Technologies | 12440-053 | |
| Opti-MEM Siero ridotto | Medium Life Technologies | 31985-070 | |
| M199 Medium | Life Technologies | 10-060 | |
| DMEM, alto glucosio | Life Technologies | 10-013 | |
| Penicillina-streptomicina | Corning | 30-002 | |
| Aminoacidi non essenziali | Life Technologies | 11130-050 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668500 | |
| blasticidina | Life Technologies | A11139-03 | |
| puromicina | Life Technologies | A11138-03 | |
| Collagenasi II | Worthington | LS004176 | |
| polibrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| CaCl< sub>2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | BP358-212 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | PX1405 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| Glucosio | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| Albumina sierica bovina | Fisher | 9048-46-8 | |
| paraformaldeide | EMS | 15714 | |
| Soluzione di precipitazione del retrovirus | ALSTEM | VC-200 | |
| Soluzione di blu di tripano allo 0,4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| gelatina | Sigma-Aldrich | G1393 | |
| PBS di Dulbecco senza CaCl2 e MgCl2 (D-PBS, 1x) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| HBSS (soluzione salina bilanciata Hanks) | Corning | 21022 | |
| LS colonna | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| 0,45 μ m filtro in acetato di cellulosa | Thermo Scientific | 190-2545 | |
| piastre a 24 pozzetti | Corning | 3524 | |
| piastre per coltura tissutale da 10 cm | Thermo Scientific | 172958 | |
| 60 mm | Corning | 3260 | |
| 96 Well Clear V-Bottom 2 ml Piastra a pozzetti profondi in polipropilene | Denville Scientific | P9639 | |
| Provette a fondo tondo in polistirene con tappo per filtro cellulare. | BD Biosciences | 352235 | |
| Centrifuga | Eppendorf | 5810R | |
| Vortexer MINI | VWR | 58816-121 | |
| EVOS FL Sistema di imaging cellulare automatico | Tecnologie di vita | AMAFD1000 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Separatore MidiMACS | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Vetrino coprioggetto rotondo | microscopia elettronica Scienze | 72195-15 |
Riferimenti
- Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2015 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. , (2014).
- Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
