Viene descritto un metodo cromatografico in due fasi per la purificazione della proteina Shadoo ricombinante espressa come corpi di inclusione in Escherichia coli, nonché un protocollo per fibrillare Shadoo purificato in strutture amiloidi.
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Articolo metodologico
Purificazione e ripiegando a amiloide fibrille di (sua)
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il sistema di espressione coli Escherichia è uno strumento potente per la produzione di proteine eucariotiche ricombinanti. Lo usiamo per produrre Shadoo, una proteina appartenente alla famiglia prione. Un metodo cromatografico per la purificazione di (suo) 6 -tagged Shadoo ricombinante espressa come corpi di inclusione è descritto. I corpi di inclusione vengono solubilizzati in 8 M urea e legati ad un 2+ colonna -charged Ni eseguire cromatografia di affinità ionico. Proteine legate sono eluite da un gradiente di imidazolo. Le frazioni contenenti proteine Shadoo mediante cromatografia di esclusione dimensionale per ottenere una proteina altamente purificata. Nella fase finale è purificato Shadoo dissalati per eliminare i sali, urea e imidazolo. Proteina ricombinante Shadoo è un reagente importante per gli studi biofisici e biochimici di disturbi conformazione della proteina che si verificano nelle malattie da prioni. Molti rapporti hanno dimostrato che le malattie neurodegenerative da prioni provengono dalla deposizione di pugnalatale, ordinò fibrille amiloidi. Protocolli di esempio descrivono come alla fibrillazione Shadoo in fibrille amiloidi in acido e neutro / pHs di base sono presentati. I metodi su come produrre e fibrillazione Shadoo può facilitare la ricerca in laboratori che lavorano su malattie da prioni, in quanto consente per la produzione di grandi quantità di proteine in maniera rapida e basso costo.
Introduzione
Prion malattie neurodegenerative, tra cui l'encefalopatia spongiforme bovina nel bestiame, la scrapie ovina, malattia di Creutzfeldt-Jakob negli esseri umani, sono fatali e incurabile. Le malattie da prioni sono caratterizzate da cambiamenti conformazionali di proteina prionica cellulare principalmente composti da alfa-eliche, in cross-β-sheet arricchito amiloide conformer 1,2. Cross-beta-strutture contengono densamente imballati e beta-sheets cristallini come altamente ordinati stabilizzati con legami idrogeno 3,4. Amiloidi da prioni grado di autoreplicarsi causa delle beta-filoni sul bordo crescente che forniscono un modello per il reclutamento e la conversione di un'unità proteina monomerica.
Secondo l'ipotesi "unica proteina", conformero amiloide della proteina prionica è l'unico agente infettivo. Tuttavia, alcune altre biomolecole sono state proposte per essere essenziali per disturbi prioni. Ad esempio, le membrane cellulari si pensa di essere un luogo in cui conversiin si svolge e alcuni lipidi caricati negativamente hanno dimostrato di migliorare il processo di conversione 5,6. Inoltre, alcune proteine possono anche essere coinvolti in patologie da prioni. In particolare, ci sono altri due membri della famiglia proteina prionica: Doppel e Shadoo 7,8. Doppel ha una struttura relativamente rigida stabilizzata con ponti di-solfuro e non riesce ad auto-polimerizzarli e aggregata per fibrille amiloidi 9. In contrasto, simile alla proteina prionica, Shadoo può adottare una struttura β-sheet arricchito e di auto-associate in strutture fibrille amiloidi. È stato dimostrato che Shadoo può fibrillazione in condizioni native o dal legame membrane con carica negativa 10,11. Conversione di Shadoo in fibre amiloidi simili può essere associato a patologie. Infatti, i meccanismi con cui le strutture amiloidi simili causano la malattia sono poco conosciuti.
Shadoo porta un dominio idrofobico (HD) e una serie di tandem Arg / Gly ripete simile to la parte N-terminale della proteina prionica (Figura 1A). Poiché la parte N-terminale della proteina prionica, Shadoo è altamente caricato positivamente e sembra essere una proteina nativa strutturati 11,12. Shadoo sembra essere funzionalmente correlati a disturbi da prioni dal momento che può legarsi direttamente proteina prionica. Inoltre, la sua espressione è regolata giù durante prioni patologia 13,14. Tuttavia, il ruolo di Shadoo in malattie da prioni non è ancora stabilita.
Abbiamo sviluppato un plasmide che porta la sequenza codificante del gene murino Shadoo. Il plasmide è stato usato per trasformare E. coli per la produzione di N-terminale suo 6 proteina di fusione Shadoo. Questo sistema di espressione è ben consolidata nel nostro laboratorio ed è comunemente usato nei nostri progetti in corso 6,15,16. Una questione importante per l'espressione del Shadoo è la scelta del E. coli. Mentre BL21 competente ceppo batterico è comunemente utilizzato per l'espressione di pro ricombinanteproteine Shadoo è stato espresso con successo e purificato solo dal ceppo batterico trasformato SoluBL21. SoluBL21 competente E. coli è una migliore mutante di ceppo ospite BL21 sviluppato per la produzione di proteine la cui espressione nel BL21 genitore non dava prodotto solubile rilevabile. Espressione ad alto livello di Shadoo in SoluBL21 E. coli porta all'accumulo della proteina in corpi di inclusione. Come caratteristica generale, quando una proteina non nativo è altamente espresso in E. coli, questa proteina si accumula nei corpi di inclusione insolubili. Shadoo probabilmente aggrega attraverso interazioni non covalenti idrofobiche o ionici (o una combinazione di entrambi) strutture dinamiche altamente arricchito formata dalla proteina ripiegata a vari gradi. Di conseguenza, la purificazione comprende almeno due fasi: (i) una separazione selettiva della proteina da altre biomolecole in un mezzo denaturazione, e (ii) un rinaturazione della proteina purificata mediante piegatura in vitrotecniche.
La separazione selettiva di Shadoo è stato ottenuto in una soluzione tampone contenente urea 8M (o in alternativa 6M guanidina-HCl). La rimozione di urea e rinaturazione della proteina può essere fatto mediante diversi protocolli: (i) rinaturazione in una soluzione a pH acido per ottenere una proteina non strutturata Shadoo monomerica, o (ii) rinaturazione in una soluzione di pH ≥ 7 per ottenere Shadoo polimerizzato in fibre amiloidi stabili con caratteristici motivi cross-β-sheet.
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Protocollo
1. Generazione di plasmidi e Shadoo Expression
Nota: Il gene che codifica la proteina murino Shadoo (Shadoo 25-122), è stato subclonato nel vettore di espressione pET-28 11. Questo clone è stata trasformata in E. coli SoluBL21 ceppo batterico, per esprimere la proteina Shadoo con un tag hexahistidine N-terminale, (HHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMKGGRGGARGSARGVRGGARGASRVRVRP APRYGSSLRVAAAGAAAGAAAGVAAGLATGSGWRRTSGPGELGLEDDENGAMGGNGTDRGVYSYWAWTSG), come spiegato in precedenza 11. Il plasmide può essere richiesto da parte degli autori. Il peso molecolare di Shadoo calcolata dalla sua sequenza aminoacidica è 12,243.2 Da.
Nota: Eseguire tutte le manipolazioni con i batteri sotto una cappa a flusso laminare o in prossimità di Bunsen fiamma.
- Trasforma batteri SoluBL21 competenti con la PET-28-Il suo 6 -Shadoo plasmide, utilizzando un protocollo shock termico standard. Per questo mix 1 a 5 ml di plasmide (tipicamente 10 a 100 pgng) in 50 ml di batteri in un tubo. Eseguire lo shock termico a 42 ° C per 45 sec.
- Cultura batteri trasformati a 37 ° C fino a 600 di 0,5-0,7 in Luria Bertani-mezzo supplementato con 40 mg / ml kanamicina (Figura 1B).
- Indurre Shadoo espressione O / N con l'aggiunta di 240 mg / ml isopropilico-β-D-thiogalactopyranoside, ITPG, alla cultura. Batteri Cultura sotto agitazione a 150 rpm a 37 ° C. Nota: In genere, la coltura batterica raggiunge A 600 3 O / N.
Nota: Trasformato batteri possono essere conservati a -80 ° C per la futura produzione di proteine. Per questo, aggiungere 10% -50% (v / v) di glicerolo sterile in aliquote coltura batterica e congelarli a -80 ° C.
Figura 1. Schema di Shadoo espressione costrutto, batteri trasformazione e l'induzione dell'espressione Shadoo (come descritto al punto 1). (A) Il costrutto di espressione per Shadoo codifica un tag hexahistidine fusa all'N-terminale della proteina, Nt. Lo schema mostra che le proteine Shadoo contiene ripetizioni base arginina / glicina (cilindro verde), un dominio idrofobico (HD), e un singolo sito N-glicosilazione (CHO), seguiti da un C-terminale (Ct). (B) pET-28-Il suo 6 -Shadoo plasmide si trasforma in batteri SoluBL21 da shock termico per 45 secondi a 42 ° C. Batteri trasformati sono placcati su agar selettivo contenente 40 mg / ml kanamicina. Una singola colonia dalla piastra è usata per inoculare una coltura in una beuta agitatore 1000-3000 ml. L'espressione della proteina ricombinante è indotta con 1 mM IPTG. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
2. Purificazione di Shadoo proteine da bassa pressione cromatografia liquida (LPLC)
- Lisi cellulare e inconclusione corpi preparazione
- Raccogliere la sospensione batterica e le trasferisce in tubi centrifugazione (Figura 2).
- Spin a 2.500 xg per 20 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante per decantazione e risospendere pellet in 15 ml di tampone (50 mM Tris, EDTA 10 mM, pH 8 con anti-proteasi cocktail) per ogni pastiglia derivata da 500 ml di coltura cellulare.
Nota: precipitato risospeso possono essere congelati e conservati a -20 ° C per diversi giorni. Congelamento facilita cellule batteriche lisi. - Controllare la sovra-espressione della proteina ricombinante utilizzando batteri greggio pellet mediante analisi SDS-PAGE e colorazione Coomassie.
- Per questo, centrifuga 1 ml di coltura batterica a pellet cellule. Aggiungere 100 microlitri soluzione Laemmli denaturazione (277,8 mM Tris-HCl, pH 6,8, 4,4% SDS, 44,4% w / v glicerolo, 0,02% blu di bromofenolo) a pellet e riscaldare a 100 ° C per 5 min.
- Carico 10 ml di campione ad un gel di acrilammide 12%, eseguire SDS-PAGE e visuAlize proteine separate da Coomassie colorazione.
- Aggiungere Triton X-100 a concentrazione finale 0,5% al pellet risospeso completamente dalla 2.1.2).
- Incubare la sospensione in bagno d'acqua a 37 ° C per 30 min.
- Sonicare la sospensione per 5 minuti a 6-12 micron ampiezza picco-picco in acqua ghiacciata per lisare le cellule batteriche.
- Trasferimento sonicata sospensione nella pulite provette da 50 ml di centrifugazione.
- Tubi centrifugare a 15.000 xg per 15 min a 4 ° C.
- Rimuovere il surnatante per decantazione e aggiungere 5 ml di tampone di legame (20 mM tampone Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M Urea, imidazolo 5 mM) per provetta.
- Tubi immettono sul rotante volante O / N di proteine da corpi di inclusione risospendere completamente.
Figura 2. Schema di purificazione di inclusioneorgani (come descritto al punto 2.1). trasformate batteri esprimenti Shadoo vengono raccolte per centrifugazione e risospese in tampone di lisi. La sospensione viene incubata a 37 ° C per 30 minuti, e quindi sonicato per rompere meccanicamente cellule batteriche. Sonicazione è fatto su ghiaccio per evitare il riscaldamento del campione. Celle rotte sono raccolte per centrifugazione e risospese in un tampone contenente 8 M di urea per solubilizzare proteine da corpi inclusi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. - Cromatografia Ni 2+ -affinity
Nota: Cromatografia viene eseguita utilizzando un sistema FPLC Ni 2+ -charged, 5 ml Sepharose colonna chelante (Figura 3A). Tutte le soluzioni vengono caricati sulla colonna con una portata di 1 ml / min.- Iniettare 10 ml di 0,2 M Niso soluzione 4 acqua nella colonna Sepharose per caricarlacon ioni Ni 2+.
- Equilibrare la colonna caricata con Ni 2+ ioni iniettando 30-50 ml di tampone di legame contenente una bassa concentrazione di imidazolo (20 mM tampone Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M Urea, imidazolo 5 mM).
- Caricare le proteine urea-solubilizzato con un sistema di iniezione 50 ml.
- Recupero della frazione flow-through lavando a fondo la colonna con 10 ml bassa imidazolo tampone di legame (20 tampone mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M Urea, 5 Imidazole mM) al fine di rimuovere un massimo di proteine non legate dalla colonna.
- Lavare la colonna con 50-100 ml di tampone di lavaggio (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M urea, 80 mM imidazolo) per eluire le proteine non specificamente legato alla colonna.
- Applicare 15 min gradiente lineare di 80-800 mM imidazolo in tampone contenente 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M Urea. Raccogliere 1 ml frazioni durante l'applicazione del gradiente. Nota: proteine His-tag vengono eluiti ingegnoha pendenza di tampone contenente imidazolo-(utilizzata come concorrente).
- Prendete una un'aliquota 8 microlitri di ogni frazione e aggiungere 4 ml soluzione denaturazione 4x Laemmli (vedi 2.1.3.1). Soluzioni di calore a 100 ° C per 5 min.
- Carico 10 ml di dimensioni proteine marcatore e 10 ml di ogni campione al gel di acrilammide al 12%, eseguire SDS-PAGE e visualizzare le proteine separate da Coomassie colorazione. Nota: Il peso molecolare di Shadoo calcolato formano la sua sequenza di aminoacidi è 12,243.2 Da.
- Piscina tutte le frazioni contenenti Shadoo.
Figura 3. procedura di purificazione (come descritto nei punti 2.2-2.4). (A) Ni 2+ ioni possono essere coordinati da residui di istidina, che permette la purificazione selettiva di proteine polyhistidine-tag. Imidazolo è usato per eluire la proteina, attraversola sua capacità di coordinare con il 2+ -ion Ni e spostare la proteina legato. (B) Proteine di varia raggio idrodinamico che sono stati presenti a Ni 2+ -column sono separati su una colonna esclusione dimensioni. Le proteine vengono eluite dal più grande al quelle più piccole. (C) Prima dell'uso, frazioni contenenti Shadoo sono raggruppati e dissalate per rimuovere l'urea, imidazolo e sali. Saggi di controllo qualità includono SDS-PAGE / Coomassie colorazione, Western blotting. Purificata Shadoo può essere liofilizzato. Liofilizzato Shadoo è stabile per mesi se conservato a -20 ° C. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. - Cromatografia di esclusione
Nota: Una seconda fase di purificazione consiste nella cromatografia di esclusione dimensionale che separa proteine Shadoo dalle altre proteine co-eluite durante la prima fase di purificazione(Figura 3B).- Equilibrare Superdex colonna 120 ml di volume totale letto iniettando 250 ml di tampone 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M Urea alla portata di 1,5 ml / min.
- Carica frazioni pool contenenti Shadoo dalla 2.2.9 alla colonna equilibrata. Raccogliere 1 ml frazioni dopo il volume vuoto della colonna 40 ml al flusso costante del buffer sopra.
- Prelevare un'aliquota 10 microlitri di ogni frazione ed effettuare un'analisi SDS-PAGE e colorazione Coomassie come descritto sopra per scoprire quale frazioni contengono Shadoo.
- Piscina frazioni contenenti Shadoo.
- Dissalazione
Nota: Procedura Desalting rimuove sali, imidazolo e l'urea per ottenere proteine Shadoo ricombinante in un buffer adatto per ulteriori studi biofisici e biochimici (Figura 3C). Lo stesso risultato può essere ottenuto campioni dialisi contro tampone.- Equilibrare una colonna dissalazione di 53 ml con 150 ml10 mM di tampone di acetato di ammonio, pH 5, a velocità di flusso di 5 ml / min.
- Carico pool frazioni Shadoo sulla colonna. Dopo iniezione del tampone acetato di ammonio raccogliere manualmente frazioni che mostrano un aumento del segnale a 280 nm in uscita del rivelatore UV.
- Liofilizzare il Shadoo dissalato e conservarlo a -20 ° C.
- Sciogliere Shadoo liofilizzata in un buffer adeguata, ad esempio 10 mM di tampone sodio acetato, pH 5, prima dell'uso.
Nota: Il tag polyhistidine può essere rimosso con enterokinase.
3. In Vitro Assemblaggio di Shadoo in amiloide fibrille a pH fisiologico
Nota: I aggregati proteici Shadoo e spontaneamente forme fibrille a pH ≥ 7 11.
Figura 4. Schema di Shadoo ripiegamento di fibrille amiloidi (come descriLetto al punto 3). purificato Shadoo converte spontaneamente di fibrille amiloidi quando disciolto in tampone a pH ≥ 7. In una soluzione acida, Shadoo converte in fibrille amiloidi su incubazione con 1 M Gdn-HCl agitando. Test di controllo di qualità sono la microscopia elettronica e ThT colorazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- Diluire Shadoo ad una concentrazione finale di 2 mM in tampone 20 mM Tris-HCl, pH 7.4. Misurare la concentrazione misurando la densità ottica della soluzione a 280 nm ed utilizzando il coefficiente di estinzione dedotta dalla composizione aminoacidica Shadoo di 20.970.
- Incubare 500 microlitri della soluzione in un tubo di plastica conica a 4 ° C per due settimane, per consentire la conversione spontanea proteine per strutture amiloidi (Figura 4).
- Aggiungere appena preparato thioflavin T (ThT) per una conce finalentration di 10 mM di un'aliquota di 100 microlitri della soluzione Shadoo. Incubare la soluzione per 5 minuti a temperatura ambiente. Misurare emissione di fluorescenza da 460 a 520 nm con una lunghezza d'onda di eccitazione di 435 nm per verificare la presenza di strutture amiloidi 17.
4. In Vitro Assemblaggio di Shadoo di amiloide fibrille a pH acido
- Diluire Shadoo in 1 M GdnHCl, tampone 20 mM Na-acetato, pH 5 per una concentrazione finale di 2 mM.
- Incubare 500 ml di questa soluzione in un tubo conico con agitazione continua a 37 ° C, per 3-7 giorni.
- Controllare la presenza di fibrille amiloidi aggiungendo ThT ad un'aliquota della soluzione, come in 3.3.
- Dializzare sospensione ottenuta contro 10 mM tampone Na-acetato, pH 5,0, per purificare Shadoo fibrille amiloidi.
- Conservare fibrille purificati a +4 ° C.
Figura 5. Risultati rappresentativi. Frazioni proteiche eluite da Ni 2 + -charged colonna chelante (A) e della colonna esclusione dimensione (B) sono stati analizzati utilizzando SDS-PAGE e colorazione Coomassie. Identificazione di Shadoo purificato è stata valutata utilizzando SPRN anticorpo anti-Shadoo (C). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Risultati
Circa 5-10 mg di proteine Shadoo purificato viene ottenuto per litro di coltura batterica. Una purificazione a due fasi è necessario per ottenere Shadoo ricombinante di elevata purezza. Il primo passo è effettuata mediante cromatografia di affinità con un Ni 2 + colonna -charged che conserva i suoi-proteine taggati. Frazioni eluite sono sottoposti a SDS-PAGE e colorazione con Coomassie Brilliant Blue (Figura 5A). Le frazioni contenenti proteine Shadoo sono raggruppati e ulteriormente pu...
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Discussione
Un protocollo semplice ed efficace sia per l'espressione e la purificazione di una grande quantità di topo ricombinante proteina Shadoo è presentato. Il metodo descritto consente solubilizzazione successo e purificazione (His 6) -tagged proteina Shadoo ricombinante. È importante, come indicato nel titolo, che quando espresso in un batterio E. procariotico coli Shadoo accumula nei corpi di inclusione. Prima Shadoo purificazione, i batteri devono essere lisate per sonicazione in un tampone...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Natalie Doude e David Westerway (Università di Alberta) per averci fornito Sho cDNA, Christophe Chevalier (INRA) per la costruzione dei plasmidi, Michel Brémont (INRA) per averci fornito i batteri BL21Sol; Christine Longin (INRA) per l'assistenza GST e Edith Pajot-Augy (INRA) per i commenti e la correzione di bozze.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| AKTA FPLC | GE, Amersham | # 1363 | |
| HiLoad 16/60 Superdex | GE Healthcare | 17-1069-01 | |
| HiTrap IMAC | GE Healthcare | GE17-0920-05 | |
| HiPrep26/10 Colonna di desalinizzazione | GE Healthcare | GE17-5087-01 | |
| SoluBL21 Competente E. coli | Genlantis | C700200 | |
| pET-28b+ | Novogen | 69865-3 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LB-Brodo medio | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Eppendorf Biofotometar | Eppendorf | 550507804 | |
| Trito X-100 | Life Technologies | 85111 | |
| NiSO4 | Sigma-Aldrich | 656895 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich RES3098T | ||
| Compresse di Cocktail di Inibitori della Proteasi | Roche | 4693116001 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Gdn-HCl | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| marcatore di dimensione della proteina | Thermo Fisher Scientifico | 26620 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
