In tempo reale Imaging di Pianta Dynamics cellulare con superficie variabile angolo epifluorescenza Microscopia

Summary

L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare come monitorare la dinamica delle proteine ​​fluorescenti-taggato sulla superficie delle cellule di piante con variabile angolo epifluorescenza, mostrando punti di GFP-tagged PATROL1, una proteina del traffico di membrana a lampeggiare, nella corteccia cella del complesso stomi in Arabidopsis thaliana.

Abstract

La superficie cellulare di una pianta è la sua interfaccia per percepire i segnali ambientali; risponde con cambiamenti biologici cellulari come il traffico di membrana e il riarrangiamento del citoscheletro. L'analisi di immagini in tempo reale e ad alta risoluzione di tali eventi intracellulari aumenterà la comprensione della biologia delle cellule vegetali a livello molecolare. La microscopia ad epifluorescenza ad angolo variabile (VAEM) è una tecnica emergente che fornisce immagini time-lapse di alta qualità di proteine marcate in fluorescenza sulla superficie cellulare vegetale. In questo articolo vengono descritte le procedure pratiche per la preparazione del campione VAEM, la regolazione del sistema ottico VAEM, l'acquisizione di filmati e l'analisi delle immagini. Come esempio di osservazione VAEM, vengono presentati risultati rappresentativi sulla dinamica dei PATROL1. Si tratta di una proteina essenziale per il movimento stomatico, che si ritiene sia coinvolta nel trasporto della pompa protonica alle membrane plasmatiche nel complesso stomatico di Arabidopsis thaliana. L'osservazione in tempo reale VAEM delle cellule di guardia e delle cellule sussidiarie nei cotiledoni di A. thaliana ha mostrato che le PATROL1 marcate in fluorescenza apparivano come strutture puntiformi sulle membrane plasmatiche per diversi secondi e poi scomparivano. L'analisi chimografica dei dati dei film VAEM ha determinato la distribuzione temporale della presenza (definita "tempo di permanenza") delle strutture puntiformi. L'uso di VAEM è discusso nel contesto di questo esempio.

Introduction

La superficie della cellula vegetale, compresa la membrana plasmatica e il suo citoplasma immediatamente adiacente, è la regione principale della percezione e dell'integrazione di una cellula vegetale di segnali biotici e abiotici dall'ambiente extracellulare. In risposta a questi segnali, i componenti della superficie cellulare, comprese le proteine della membrana plasmatica e il citoscheletro corticale, subiscono cambiamenti dinamici, su una scala temporale da secondi a minuti^1-4. Pertanto, l'imaging in tempo reale e ad alta risoluzione di proteine fluorescenti sulla superficie cellulare può illuminare le risposte di una pianta ai segnali ambientali a livello molecolare.

La microscopia a scansione laser confocale è un potente strumento per la determinazione della localizzazione delle proteine 3 marcate in fluorescenza^{, tuttavia}, è spesso difficile monitorare la dinamica delle proteine in tempo reale a causa dei suoi tempi di cattura relativamente lunghi. Una tecnica emergente per il monitoraggio in tempo reale delle proteine nella cellula vegetale è la microscopia a epifluorescenza ad angolo variabile (VAEM), che è un adattamento di apparecchiature solitamente utilizzate per la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF). Nella microscopia TIRF, la sorgente luminosa di eccitazione a fluorescenza è un campo luminoso evanescente che viene generato quando l'angolo di ingresso del laser è sufficientemente basso da riflettere totalmente internamente la luce all'interfaccia vetro-acqua. La profondità di penetrazione del campo luminoso evanescente è di circa 100 nm. La microscopia TIRF è uno strumento eccezionale per l'imaging di singole molecole, come il rilevamento dell'esocitosi nelle cellule animali⁵. Tuttavia, la luce evanescente non può raggiungere le membrane plasmatiche o il citoplasma corticale nelle cellule vegetali, perché hanno pareti cellulari spesse. Recentemente, le apparecchiature di microscopia TIRF sono state adattate dai biologi delle cellule vegetali, osservando che un laser, se angolato leggermente più in profondità rispetto a quando veniva utilizzato per indurre fenomeni di riflessione interna totale, potrebbe eccitare la superficie dei campioni di cellule vegetali, ottenendo un imaging di cellule vegetali di alta qualità^6,7. La profondità di illuminazione di eccitazione viene variata regolando l'angolo di ingresso del laser; pertanto, questa tecnica è descritta come VAEM. Questo sistema ottico è anche chiamato microscopia TIRF ad angolo variabile (VA-TIRFM) perché esiste la possibilità che la riflessione totale possa avvenire all'interfaccia parete cellulare-periplasma⁷, tuttavia, il termine VAEM è usato in questo articolo, come da primo rapporto negli impianti⁶.

L'obiettivo di questo protocollo è dimostrare le procedure pratiche per l'utilizzo di VAEM per visualizzare le dinamiche delle proteine marcate in fluorescenza sulle superfici delle cellule vegetali. Inoltre, per l'analisi dei filmati VAEM viene descritto un protocollo di analisi delle immagini per quantificare il tempo di permanenza (durata della presenza) delle molecole. Come esempio viene utilizzato il lampeggio del punto GFP-PATROL1 sulle cellule del complesso stomatico nei cotiledoni di Arabidopsis thaliana. PATROL1 è stato identificato con approcci genetici avanzati come gene causale di un mutante con difetto di risposta stomatica in A. thaliana⁸. PATROL1 è un omologo vegetale di MUNC-13, che è un fattore di priming nell'esocitosi delle vescicole sinapsi⁸. In risposta a segnali ambientali, come la luce o l'umidità, si pensa che PATROL1 regoli in modo reversibile l'erogazione di una pompa protonica alle membrane plasmatiche nel complesso stomatico. I complessi stomatici comprendono ciascuno una coppia di cellule di guardia⁸ e cellule sussidiarie⁹ e richiedono una pompa protonica per il movimento stomatico. In queste cellule, la PATROL1 marcata con GFP si localizza in strutture puntiformi che rimangono sulla membrana plasmatica per meno di 1 minuto⁹.

Protocol

1. Preparazione di Giovani pianta

1. Sterilizzare i semi.
   1. Preparare la soluzione di sterilizzazione aggiungendo 500 microlitri NaClO (cloro disponibile: 5.0%) e 1 ml 10% Triton X-100 a 500 microlitri di acqua sterile.
   2. Posto circa 10 transgenico A. thaliana semi trasportano GFP-PATROL1 ⁸ in una provetta da 1,5 ml.
   3. Aggiungere la soluzione di etanolo 1 ml di 70%, e mescolare bene capovolgendo cinque volte. Lasciare agire per 1 min.
   4. Osservare i semi si depositano sul fondo della provetta. In una cappa a flusso laminare pulito, rimuovere delicatamente la etanolo al 70% con una micropipetta, e aggiungere 1 ml di soluzione di sterilizzazione. Mescolare bene capovolgendo cinque volte e lasciar riposare per 5 minuti.
   5. Lavare i semi. Ancora lavorando sotto condizioni asettiche su un banco pulito, rimuovere delicatamente la soluzione con una micropipetta, e aggiungere 1 ml di acqua sterile. Ripetere questa operazione cinque volte. I semi sterilizzati possono essere conservati in acqua sterile a 4 ° C per 2 giorni.
2. Cosìw i semi sterili su un 0,5% gellano gomma-solidificato 1/2 Murashige e Skoog piatto (pH 5,8) ^9. Nastro il coperchio sulla piastra utilizzando due strati di nastro chirurgico.
3. Incubare la piastra al buio a 4 ° C con una cella frigorifera, O / N.
4. Trasferire la lastra in una camera di crescita fissato a 23,5 ° C con un / 12 hr-chiaro-scuro ciclo di 12 ore con 100 mmol m ^-2 s ^-1 luci bianche, e incubare per 7 giorni. Piantine con cotiledoni di circa 1 mm di lunghezza possono essere raccolte.

2. Cadutalibera Montaggio di Cotyledon campioni

NOTA: Un fattore importante nella preparazione dei campioni per l'osservazione VAEM è di evitare l'inclusione di bolle d'aria tra il campione e il vetro di copertura. Bolle riducono notevolmente la qualità delle immagini di VAEM provocando differenze nell'indice di rifrazione. Un metodo semplice, che abbiamo chiamato 'cielo drop' di montaggio, può essere utilizzato per evitare le bolletra la A. cotiledoni thaliana e il vetro di copertura. Questo dovrebbe essere fatto immediatamente prima osservazione.

1. Mettere 30 ml di tampone basale [5 mM 2- (N -morpholino) -ethanesulfonic acid-Tris (MES-Tris) a pH 6,5, 50 mM KCl, 100 mM CaCl _2] al centro di un vetrino (dimensioni: 76 × 26 mm, spessore: 1,0-1,2 mm).
2. Rimuovere un cotiledone da una piantina 7 giorni di vita con le forbici dissezione. Float cotiledone con il lato rivolto verso l'alto di osservazione sulla goccia basale tampone (Figura 1, fase 1).
3. Mettere 30 ml di tampone basale al centro di un vetro di copertura (dimensioni: 18 × 18 mm, spessore: 0,12-0,17 mm) (Figura 1, fase 2). Ruotare il vetro di copertura a testa in giù con delicatezza. La tensione superficiale impedisce la caduta di tampone di cadere. Tenere il vetro di copertura con una pinzetta su un bordo. Posizionare il bordo opposto sul vetrino modo che la goccia buffer è approssimativamente sopra cotiledone.
4. Con il bordo del vetro di copertura ancora sul vetrino, e ancora tenendo il bordo opposto con pinzette, regolare la posizione della goccia tampone sotto il vetro di copertura in modo che sia direttamente sopra il campione cotiledone (Figura 1, fase 3). Lasciate andare il vetro di copertura. Montare una goccia sul campione risultante in un preparato senza bolle d'aria.
5. Pulire il tampone in eccesso utilizzando tessuti privo di lanugine. Osservare immediatamente la preparazione (vedi punto 3).
   NOTA: Non è necessario sigillare i campioni.

3. VAEM Osservazione e Movie acquisizione

NOTA: Il sistema di microscopia TIRF ^{9 utilizzati} nel presente studio è descritto come segue: Un microscopio invertito è dotato di una unità TIRF e una lente obiettivo TIRF con un'apertura numerica di 1,49. Per il controllo computerizzato del dell'angolo di ingresso del laser, viene utilizzata una scatola di controllo. Proteina fluorescente verde (GFP) è eccitato con un laser a semiconduttore 488 nm pompaggio ottico, e tegli fluorescenza viene rilevata attraverso un filtro passa-banda 510-550 nm per impedire autofluorescenza da cloroplasti. Il valore massimo misurato della potenza di uscita fibra è 13,0-13,5 mW. Per il rilevamento, un elettrone moltiplicando charge-coupled device (EM-CCD) Sistema di testa macchina fotografica e di un C-mount unità cambiamento di ingrandimento della fotocamera sono utilizzati.

1. Calibrare il laser centratura e messa a fuoco in base alle istruzioni del produttore.
   NOTA: Questo passaggio è fondamentale per precise osservazioni VAEM. Si raccomanda vivamente che i controlli periodici delle procedure di regolazione percorso laser, appropriata al microscopio, vengono effettuati.
   1. Determinare la posizione centrale illuminato con una luce obiettivo percorso senza lente sul soffitto della stanza microscopia. Per segnare la posizione centrale, mettere un sigillo cerchio colorato sul soffitto (figura 2, punto 1, 2).
   2. Illuminare il soffitto con una lente obiettivo (Figura 2, fase 3, 4). Spostare l'illuminated regione sulla posizione centrale (figura 2, punto 5). Mettere a fuoco il laser (figura 2, punto 6). Mettere a punto la posizione del laser focalizzato al centro (Figura 2, punto 7).
2. Impostare un preparato sul tavolino del microscopio e selezionare le celle di osservazione in illuminazione campo chiaro.
3. Verificare che la proteina fluorescente può essere osservato nelle cellule, e impostare la posizione z -axis sulla superficie cellulare mediante illuminazione epifluorescenza (Figura 3A).
4. Eseguire osservazioni VAEM.
   1. Inclinare l'angolo di ingresso del fascio laser gradualmente con la scatola del regolatore. Allo stesso tempo, controllare l'immagine inquadrata accuratamente. Inizialmente, l'immagine sarà offuscata (Figura 3B).
   2. Quando l'angolo laser aumenta, l'immagine VAEM diventerà meno offuscata, fino a produrre una chiara immagine (Figura 3C e D). A questo punto, interrompere Increacantare l'angolo del laser. Se il segnale di fluorescenza viene perso, ridurre ad un angolo poco profondo.
   3. Ottimizzare l'angolo di ingresso del laser per ottenere una migliore immagine. Messa a punto della posizione z -axis può anche migliorare l'immagine. Se necessario, regolare i parametri ottici (potenza del laser, lunghezza d'onda e filtro scelto) e parametri del sensore immagine [dimensioni dell'immagine, tempo di esposizione, guadagno, digitizer e-elettroni moltiplicando (EM) di guadagno].
      NOTA: Nel caso delle apparecchiature microscopio TIRF descritto sopra, i parametri rappresentativi sono i seguenti. Ingrandimento dell'obiettivo proprio di fronte alla macchina da presa: 2X; Uscita laser: 1,0 mW; Dimensione immagine: 512 × 512 pixel; Tempo di esposizione: 100 msec; Guadagno: 5 ×; Digitizer: 11 MHz; e EM guadagno: 100.
5. Acquisire un filmato come file TIFF immagine di più pagine tramite il software del microscopio commerciale. Qui, il film è di punti GFP-etichettata lampeggianti sulla superficie delle cellule stomatici.
   NOTA: Le condizioni di acquisizione di immagini rappresentative sono come folbassi. Modalità acquisizione: Flusso di RAM; Numero di fotogrammi: 600; e la dimensione del file TIFF multi-page: ~ 302 MB.

4. Analisi chimografo per la quantificazione di GFP-etichettata Dot Residence tempo usando Fiji Software

1. Installare Fiji ('Fiji è solo ImageJ') software ^{10 utilizzando} le istruzioni degli autori (http://fiji.sc/Fiji).
2. Eseguire Fiji e aprire il file TIFF a più pagine acquisite tramite il menu Fiji "File-Open".
3. Posizionare una linea sul sito di interesse, utilizzando il menu barra degli strumenti Fiji "Straight Line Selection Tool". Facoltativamente, utilizzare la funzione "segmentato Linea Selection Tool" o "a mano libera linea strumento di selezione". Nei risultati presentati qui, una linea retta di 100 pixel (corrispondenti a 8,0 micron) è stato posto su una cella controllata (Figura 4A).
4. Fare una immagine chimografo usando il menu Fiji "Immagine-Stack-Dynamic reslice "(http://fiji.sc/Dynamic_Reslice) (Figura 4B). Opzionalmente, "Rifletti verticalmente" e "ruotare di 90 gradi" in una finestra di casella di controllo sono disponibili (non utilizzato nei risultati presentati qui). La x e y l'immagine chimografo nella indicano la posizione della linea (100 pixel corrispondenti a anche 8.0 micron) e tempo di osservazione (600 pixel corrispondenti a 60 sec), rispettivamente. Se l'immagine chimografo non è soddisfacente, la posizione e il tipo (dritto, segmentati e mano libera) della linea sull'immagine più pagine possono essere modificate. Per quanto i cambiamenti di linea, l'immagine cambia in modo dinamico chimografo. Salvare una immagine chimografo come file TIFF utilizzando il menu Fiji "File-Salva con nome-Tiff".
5. Misurare la lunghezza del blob nell'orientamento dell'asse tempo.
   1. Per eseguire la riduzione del rumore, applicare un filtro gaussiano alle immagini chimografo utilizzando il menu Fiji "Process-Filtri-Controllo sfocatura". La "Sigma (Radius) "parametro è regolabile (1 raggio pixel viene utilizzato per i risultati presentati).
   2. Segmento le regioni del segnale di soglia, utilizzando il menu Fiji "Immagine-Adjust-soglia".
      NOTA: Ci sono diversi algoritmi di thresholding tra cui scegliere. Nei risultati presentati, l'algoritmo "Yen" è stato scelto (Figura 4C).
   3. Preparatevi a misurare il tempo (y) -axis lunghezza del blob utilizzando il menu "Analizza-Set misure". Controllare il "rettangolo di delimitazione" nella finestra "Imposta misure". Idealmente il set area dovrebbe essere il più piccolo possibile, escludere rumore. Qui, la superficie minima è stata fissata a 50 pixel. Misurare il tempo (y) -axis lunghezza del blob utilizzando il menu "Analizza Analizza-particelle". Per ottenere i valori dei risultati e dimostrare la credibilità delle regioni di misura, controllare i "Risultati" e "Aggiungi a Gestione </ em> "scatole.
   4. Valori nella colonna "Altezza" sono il tempo (y) -axis lunghezze per il blob misurato (Figura 4D). Salvare i valori utilizzando il menu tabella dei risultati "File-Salva con nome" e calcolare ed elaborare il set di dati di durate immagine blob utilizzando un pacchetto statistico e / o software foglio di calcolo (Figura 4E).

Results

In questo articolo il video, i protocolli per l'osservazione VAEM di GFP-PATROL1 in A. sono forniti cellule complesse thaliana cotyledon stomatiche. Montaggio Sky goccia è un semplice metodo di preparazione che può aiutare a ridurre la comparsa di bolle d'aria in preparazioni VAEM di A. cotiledoni thaliana (Figura 1). Un'inclinazione eccessiva del laser ingresso e / o Z-posizionamento di campioni per VAEM fornirà un'immagine chiara. Se ciò accade, si consiglia di ripa...

Discussion

In questo articolo video, protocolli sono dati per monitorare e misurare il comportamento dinamico di punti GFP-PATROL1 sul complesso stomatico di Arabidopsis thaliana. Come mostrato qui, l'osservazione VAEM è uno strumento potente per l'imaging dal vivo di superficie delle cellule delle piante. Nelle condizioni sperimentali utilizzate qui per il monitoraggio GFP-PATROL1, c'era molto poco photobleaching fluorescenza nel campione utilizzato per 1 min di cattura video, perché altamente sensibile EM-CC...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopio invertito	Olympus	IX-73
Unità TIRF	Olympus	IX3-RFAEVAW
Obiettivo TIRF	Olympus	UAPON 100 & tempi; OTIRF	NA = 1,49
Scatola di controllo dell'angolo laser	Chuo Seiki	QT-AK
Laser a semiconduttore pompato otticamente		Zaffiro coerenteTM LP USB 488-20 CDRH Laser
510... Filtro passa-banda da 550 nm	Olympus	U-FBNA
EM	Hamamatsu Photonics	ImagEM C9100-13
Unità di modifica dell'ingrandimento della fotocamera con attacco C	Software Olympus	U-TVCAC
MetaMorph	Molecular Devices	MetaMorph versione 7.7.11.0
Manuale di microscopia TIRF	Olympus	AX7385	Istruzioni: Sistema di illuminazione a riflessione interna totale (stampato in Giappone il 24 agosto 2012)
Olio da immersione	Olympus	Typr-F	ne = 1.518 (23 gradi)