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Articolo metodologico

A Novel microchirurgica modello per eterotopica, in blocco parete toracica, Timo, e trapianto cardiaco nei topi

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DOI:

10.3791/53442

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23 gennaio 2016

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1Johns Hopkins University School of Medicine, 2Burn and Complex Wound Center, 3Section of Plastic and Reconstructive Surgery, University of Chicago Medical Center, 4Division of Plastic, Reconstructive, and Maxillofacial Surgery, R Adams Cowley Shock Trauma Center, 5Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Lab, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Per studiare l'allotrapianto combinato di organi solidi e composito vascolarizzato, descriviamo un nuovo modello eterotopico di trapianto di parete toracica, timo e cuore nei topi utilizzando una tecnica di cuffia cervicale senza sutura.

Abstract

Deve essere perseguita l'esplorazione di nuove strategie nel trapianto di organi per prolungare la sopravvivenza dell'allotrapianto e ridurre al minimo la necessità di immunosoppressione di mantenimento a lungo termine. L'impiego del trapianto di midollo osseo vascolarizzato e del co-trapianto di timo si è dimostrato promettente in questo senso in vari modelli animali. 1-11 Il trapianto di midollo osseo vascolarizzato consente il trasferimento ininterrotto delle cellule del midollo osseo del donatore all'interno del microambiente del donatore preservato e l'incorporazione del tessuto del timo con il trapianto di midollo osseo vascolarizzato ha dimostrato di aumentare il chimerismo delle cellule T, svolgendo in ultima analisi un ruolo di supporto nell'induzione della regolazione immunitaria. La combinazione di allotrapianto di organi solidi e composito vascolarizzato può combinare in modo univoco queste strategie sotto forma di un nuovo modello di trapianto. I modelli murini fungono da eccellente paradigma per esplorare i meccanismi del rigetto acuto e cronico, del chimerismo e dell'induzione della tolleranza, fornendo così le basi per propagare strategie di sopravvivenza superiori allotrapianto per modelli animali più grandi e future applicazioni cliniche. In questo articolo, abbiamo sviluppato un nuovo modello eterotopico di trapianto di parete toracica, timo e cuore nei topi utilizzando una tecnica di cuffia cervicale senza sutura. L'esperienza in contesti di trapianto singeneico e allogenico è descritta per future indagini immunologiche più ampie attraverso un manoscritto didattico e un supplemento video.

Introduzione

Il trapianto cardiaco è il trattamento di scelta per l'insufficienza cardiaca allo stadio terminale. Sia i progressi tecnici che le innovazioni farmacologiche hanno spinto il settore a tassi di accettazione precoce del trapianto superiori al 90%. 12,13 Nonostante ciò, il 60-80% della sopravvivenza del trapianto a 5 anni è a un punto morto e il rigetto cronico, caratterizzato da vasculopatia da trapianto, rimane inevitabile. 14-16 Inoltre, i pazienti sono sottoposti a molteplici procedure chirurgiche e immunosoppressione per tutta la vita, che sono associate rispettivamente a deformità della parete toracica e sequele mediche e tossicità. La necessità di approcci innovativi per prolungare la sopravvivenza dell'allotrapianto, ridurre al minimo i requisiti immunosoppressivi e offrire opzioni ricostruttive per le deformità anatomiche è pressante.

L'allotrapianto composito vascolarizzato offre una strategia unica per migliorare i risultati del trapianto di cuore sia da un punto di vista immunologico che da una prospettiva ricostruttiva. 17 Gli allotrapianti compositi vascolarizzati sono anche unici in quanto hanno una fonte intrinseca di cellule staminali ematopoietiche derivate da donatori che ha mostrato una capacità favorevole di ridurre l'immunosoppressione e indurre e sostenere il chimerismo misto. 1-8 Inoltre, il co-trapianto del timo ha dimostrato di prolungare la sopravvivenza sia dei trapianti di organi solidi che degli allotrapianti compositi vascolarizzati. 2,9-11 La combinazione di queste strategie con il trapianto di cuore offre una nuova soluzione alle suddette sfide che il trapianto di cuore deve affrontare. 18

I modelli murini servono come piattaforme eccellenti per la ricerca meccanicistica in vivo grazie alla disponibilità di anticorpi e ceppi inbred e knockout ben definiti. 19-21 Sebbene il trapianto di cuore nei topi sia comunemente studiato utilizzando un modello eterotopico di trapianto di sutura microchirurgica intraaddominale22-25, un modello eterotopico, di tecnica cervicale, senza cuffia di sutura ha dimostrato di essere estremamente replicabile, affidabile e con meno tassi di trombosi. 19,26,27 L'obiettivo di questo studio è sviluppare una tecnica eterotopica en bloc di trapianto di parete toracica osteomiocutanea, timo e cuore nei topi per studiare i meccanismi immunologici dell'allotrapianto combinato di organi solidi e compositi vascolarizzati utilizzando una tecnica di cuffia cervicale non sutura. Questo allotrapianto a grappolo viene perfuso attraverso l'anastomosi dell'aorta discendente del donatore all'arteria carotide comune destra e dell'arteria polmonare del donatore alla vena giugulare esterna destra. La conservazione dei vasi toracici interni e dei rami del timo associati è fondamentale per perfondere la parete toracica (sterno, costole, muscoli e pelle) e il timo.

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Protocollo

Tutte le procedure operative sono state completate in conformità con la Johns Hopkins University e il Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti e le esigenze di servizio di sanità pubblica. Questo protocollo segue il Hopkins University cura e l'uso degli animali Comitato Johns, comitato istituzionale di revisione approvato le linee guida (numero di protocollo M013M490). Dati di sopravvivenza finale è stato registrato per le procedure chirurgiche descritte di seguito. Entrambi gli animali donatori e beneficiari ricevono l'anestesia di prelazione con buprenorfina a 0.1 mg / kg sc un'ora prima di un intervento chirurgico e la buprenorfina destinatario animale è ri-somministrato alla stessa dose dopo il trapianto e ri-dosato come necessario nelle prime 48 ore dopo l'intervento chirurgico.

1. donatori Allograft recupero

Nota: Inizia la parte del donatore del trapianto 40 minuti prima del trapianto destinatario di minimizzare il tempo di anestesia destinatario e per facilitare un tempo di fine simultaneo o leggermente orecchioora di fine lier contro la preparazione destinatario.

  1. Utilizzare strumenti di microchirurgia sterili standard e guanti sterili per la procedura. Il nostro laboratorio utilizza la sterilizzazione in autoclave di strumenti di microchirurgia.
  2. Anestetizzare il mouse donatore (maschio) con isoflurano vaporizzatore induzione al 4%. Uso Clippers meccanici atraumatica rimuovere i capelli dalla cervicale, toracica, addominale e della regione. Posto l'animale in posizione supina e mantenere isoflurane sul 1-2% attraverso un cono naso. Garantire un'adeguata anestesia durante tutta la procedura, valutando periodicamente il riflesso di punta di ritiro pizzico.
  3. Prima l'incisione cutanea, ampiamente preparare il dispositivo applicando iodopovidone antisettico seguito da alcol isopropilico utilizzando un tampone di cotone sterile.
  4. Inizia con una incisione cutanea superficiale trasversale con le forbici in tutta la pelle cervicale e addominale. Collegare i due incisioni bilateralmente lungo le linee ascellare media.
  5. Utilizzando pinze microchirurgichesezionare la regione cervicale bilaterale per identificare, legare e dividere le vene giugulari esterne con 6-0 sutura di seta e forbici. Quindi, utilizzando elettrocauterizzazione dividere i muscoli sternocleidomastoideo per esporre le vene giugulari interne e le arterie carotidi comuni, a livello bilaterale. Passare una sutura 6-0 di seta sotto il lato sinistro e il lato destro carotide comune e le vene giugulari interne in modo sfuso.
    NOTA: Saranno legate e divise in seguito al passaggio 1.9.
  6. Acutamente dividere i muscoli cinghia e associati tessuto areolare sciolto, che si trova anteriori alla trachea, con le forbici per liberare i restanti allegati della regione cervicale.
  7. Utilizzando elettrocauterizzazione bipolare e la dissezione tagliente, dividere i pettorale muscoli principali e le clavicole per esporre i vasi succlavi e legare (6-0 sutura di seta) e dividere prossimale.
  8. Poi, delicatamente, afferrare ed estrarre il pene dell'animale. Lungo il dorso del pene visualizzare la vena dorsale del pene, e disinfettare laregione con alcol isopropilico. Utilizzando un ago 30 G, iniettare 30.000 unità di eparina per via endovenosa attraverso la vena dorsale e permettono al pene di rinculo indietro alla sua posizione originale. Può verificarsi perdite parziale della soluzione di eparina nel tessuto circostante.
  9. Utilizzando i legami di massa precedentemente posizionati intorno carotide comune e la vena giugulare interna, legare e dividere le strutture, bilateralmente.
  10. Successivo utilizzo forbici per rendere una incisione intraddominale trasversale. Sviscerare l'intestino per esporre la infraepatica vena cava inferiore e iniettare 2 ml di soluzione di cardioplegia fredda Euro-Collins nel infraepatica vena cava inferiore. Garantire la corretta iniezione visualizzando scolorimento del fegato e la cessazione del battito cardiaco prima di passare al passo successivo.
    NOTA: la soluzione Euro-Collins è preparato nel nostro laboratorio, vedi tabella di reagenti e strumenti specifici.
  11. Utilizzando le forbici accedono cavità intratoracica tramite un DIAFRAMMA bilateraleincisione ragmatic dall'addome esposta. Estendere l'incisione cefalica attraverso i muscoli intercostali e le costole. Riflettere parete toracica esponendo il cuore, il timo, e grandi vasi assicurando allo stesso tempo la conservazione dei vasi toracici interni lungo la parete toracica.
  12. Iniettare la sovraepatica vena cava inferiore con 4 ml di soluzione di cardioplegia fredda Euro-Collins.
  13. Identificare la radice dell'aorta e tracciare distalmente alla aorta discendente. Acutamente tagliare l'aorta discendente (conservando lunghezza massima).
  14. Identificare il tronco polmonare e dividere appena prossimale al suo punto di filiale (conservando lunghezza massima). Quindi, utilizzando 2 ml di soluzione di cardioplegia fredda Euro-Collins, lavare il tronco polmonare e il cuore mettendo un morbido punta del catetere di plastica nel lume del tronco polmonare.
  15. Utilizzando una sutura di seta 6-0, legare e sezionare la vena cava inferiore, confluenza delle vene polmonari, e rami accessorie del cava bilaterale cava superiore. Poi elevaree sezionare la cefalica cuore dagli attaccamenti lungo bronchi fusto principale e la trachea con attenzione a non inserire le vie respiratorie. Utilizzando elettrocauterio bipolare acuto e sezionare la parete toracica, il timo, e il cuore completamente liberandolo dal mouse donatore.
  16. Infine, tagliare la parete toracica allogenico ex vivo a una dimensione inferiore, con le forbici, che attraversa lo sterno e costae laterali, con attenzione a non interrompere i vasi toracici interni (Figura 1A). Per ridurre al minimo emorragia dopo rivascolarizzazione, utilizzare electrocauterization bipolare lungo i confini dello sterno osteomusculocutaneous.
  17. Posizionare il allogenico in 10 ml di freddo (4 o Celsius) soluzione Euro-Collins se il destinatario non è preparato per incasso. Tuttavia, se il destinatario è pronto per inserto, trasferire l'alloinnesto direttamente al campo operatorio destinatario.

2. Destinatario Preparazione

Nota: Per ridurre al minimo il tempo di anestesia destinatario,iniziare la preparazione destinatario in una stazione operativa separata circa 40 minuti prima del completamento del raccolto allograft donatore.

  1. Utilizzare un insieme separato di strumenti di microchirurgia sterili standard e guanti sterili per la procedura.
  2. Anestetizzare il mouse destinatario (maschio o femmina) con isoflurano vaporizzatore induzione al 4%. Utilizzando Clippers meccanici atraumatica rimuovere i capelli dalla regione cervicale e toracica destra.
  3. Posizionare il mouse in posizione supina e l'angolo l'arto superiore destro leggermente inferiormente formando un angolo di 110 gradi tra la testa e arto superiore destro. Mantenere l'anestesia sul 1-2% isoflurano attraverso un cono naso.
  4. Posizionare petrolio pomata oftalmica sugli occhi del mouse utilizzando un cotton-fioc. Prima l'incisione cutanea, ampiamente preparare il sito operatorio utilizzando iodopovidone antisettico seguito da alcol isopropilico.
  5. Utilizzando le forbici, fare una incisione cutanea dalla linea mediana lungo la destra bor inferioreder della mandibola e prolungare l'incisione infero lateralmente alla regione toracica destra. Utilizzando smussa con pinze microvascolari, mobilitare la vena giugulare esterna circonferenziale libero nave da tessuti molli e avventizia. Dividere tutti i rami con elettrocauterizzazione, e rimuovere il lobo destro della ghiandola sottomandibolare utilizzando dissezione tagliente e elettrocauterizzazione di spazio libero per il trapianto allogenico.
  6. Assicurare una lunghezza sufficiente della vena giugulare esterna per rovesciare su un bracciale, e legare la vena giugulare esterna usando una sutura 6-0 seta. Inserire la vena attraverso il lume di un bracciale pretagliati poliimmide e utilizzare un morsetto microvascolare bulldog per risolvere il complesso nave-polsino in posto. Poi con le forbici, prossimale dividere la vena giugulare esterna, Evert sopra il polsino, e fissare con una sutura in nylon 10-0. (Figura 1B)
  7. Dividere il muscolo sternocleidomastoideo destro con elettrocauterizzazione bipolare per esporre l'arteria carotide comune. Mob circonferenzialeilize l'arteria cefalica al distale punto più all'interno della regione cervicale. Questa operazione viene eseguita utilizzando scollamento della nave con una pinza per rimuovere tessuti molli e avventizia circostante.
  8. Utilizzando sutura di seta 6-0, legare e sezionare l'arteria carotide comune. Passare l'arteria attraverso il lume di un bracciale pretagliati poliimmide e fissarlo con un bulldog microvascolare morsetto più vicino possibile al toracico possibile. Dividete il vaso distale, dilatare delicatamente il recipiente con un dilatatore microchirurgico, Evert sopra il polsino, e fissare con una sutura in nylon 10-0. (Figura 1B)
    NOTA: Il dilatatore microchirurgica specifico è descritto nella tabella di reagenti e strumenti specifici.

3. Allograft dell'inserzione

  1. Mantenere la strumentazione sterili standard guanti sterili per posizionare il allotrapianto all'interno della regione cervicale destinatario in un testa in giù e posizione obliqua.
  2. Quindi, posizionare il aor donatore discendentelumen tic sul costrutto bracciale arteriosa del destinatario e fissarlo con una sutura di nylon 10-0 (Figura 1C e 1D).
  3. Moda la stessa anastomosi come al punto 3.2 tra l'arteria polmonare donatore e il estroflesso esterna giugulare vena-polsino costrutto del mouse destinatario (Figura 1C e 1D).
  4. Innanzitutto rimuovere morsetto microvascolare venoso (morsetto vena giugulare esterna) e poi allentare il blocco arterioso (arteria carotide comune morsetto). Durante la riperfusione arteriosa, controllare la totalità del allogenico di affrontare qualsiasi emorragia. Se emorragia viene visualizzato, riapplicare la pinza arteriosa per ridurre al minimo la perdita di sangue e ridurre la fonte di sanguinamento con elettrocauterizzazione bipolare.
  5. Controllare l'innesto e di garantire l'emostasi. Rilasciare e rimuovere completamente il morsetto microvascolare arteriosa. Osservare il cuore a mostrare segni di riperfusione, che saranno istantaneamente apparente con l'espansione del volume rapida delle camere cardiache, e attendere bmangiare per iniziare entro 0,5-1 min. Utilizzare salina calda (35 ° C) per inumidire il cuore.
  6. Telo parete toracica in posizione anatomica in modo da non indurre alcuna attorcigliamento o tensioni sui anastomosi. Chiudere la pelle della ferita chirurgica sta usando 6-0 punti di sutura in nylon continui (Figura 1E).

4. Cura postoperatoria

  1. Somministrare un 0,3 ml di soluzione salina normale bolo fluido intraperitoneale immediatamente dopo l'intervento per la sostituzione del fluido.
  2. Poi via sottocutanea iniettare buprenorfina (0,1 mg / kg) e enrofloxacina (5mg / kg) per la profilassi del dolore e infezione, rispettivamente.
  3. Posto l'animale sotto una lampada di calore fino risveglio dall'anestesia e tornare al decubito sternale. Durante il recupero, ispezionare il collo per visualizzare il battito cardiaco fibrillazione del allotrapianto garantire un'adeguata perfusione allogenico.
  4. Una volta sveglio e in posizione supina, restituire il mouse in una gabbia separata (senza la compagnia di altri topi) Dove riceva cibo e acqua ad libitum. A causa di qualsiasi movimento restrittiva minore temporanea del arto superiore destro, lasciare una fonte di cibo gelatina sul pavimento della gabbia.
  5. Osservare il mouse destinatario per 1 ora dopo l'intervento e poi tornare alla struttura gabbia dove possa ricevere cibo e acqua ad libitum e viene ispezionato tre volte al giorno per le prime 24 ore di attività e di apporto nutrizionale. Monitorare i topi per i segni di dolore e di angoscia e ri-dosaggio con buprenorfina (0.1mg / kg) per via sottocutanea due volte al giorno come necessario per la prima 72 ore. Esaminare gli animali ogni giorno da allora in poi e pesare ogni settimana.
  6. Consultare un membro del personale veterinario, se eventuali topi mostrano segni di dolore, angoscia, o diminuito l'assunzione di cibo. Considerare presto l'eutanasia (nel nostro protocollo la tecnica eutanasia impiega CO 2 overdose per 7 minuti, seguita da dislocazione cervicale).
  7. Cessazione del battito cardiaco allogenico è definito come un endpoint specifico spingendo il mouse per essere sacrificed.

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Risultati

Singenico C57BL / 6 trapianti raggiunto sopravvivenza a lungo termine. Il disegno del eterologo (Figura 1) si sono dimostrati efficaci da una prospettiva di sopravvivenza degli animali e la capacità di valutare la sopravvivenza allograft corso. Questo è stato dimostrato attraverso la pelle sovrastante rimanente praticabile, crescita attiva dei capelli allogenico in corso, e battiti cardiaci sono stati in grado di valutare con la visualizzazione e il dito palpazione. Dati di sopravvivenza è rappresentata...

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Discussione

Ci sono una moltitudine di fenomeni che fattore nella ricerca immunologica di allotrapianto, che includono ma non sono limitati a meccanismi di rigetto acuto e cronico, la presentazione diretta e indiretta dell'antigene, destinatario di sensibilizzazione o l'induzione di chimerismo misto. 19 modelli animali sono diventati il gold standard per lo studio di Immunologia dei Trapianti, e modelli di topo sono comunemente implementate a causa del loro basso costo, la disponibilità di transgenici e gene topi...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse o divulgazioni finanziarie da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dall'American Association of Plastic Surgeons 2014 Academic Scholar Award.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Euro-CollinsLa soluzione non viene acquistata in commercio, ma preparata in laboratorio. Per ottenere una soluzione da 500 ml, aggiungere gli ingredienti elencati di seguito a 330 ml di acqua distillata doppia. Mescolare bene, quindi versare il resto dei 170 ml di acqua distillata doppia nella soluzione fino ad un volume finale di 500 ml.
Ingredienti: 1,02 g KH2PO4, 3,66 g K2HPO4, 0,56 g di KCl, 0,42 g di NaHCO3 e 17,52 g di glucosio.
SuturaEthilonMWI 726676-0 Ethilon https://www.mwivet.com (MWI - Forniture veterinarie)
Vena della cuffia in poliimmide (21G)Vention Medical141-0043http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/
Arteria della cuffia in poliimmide (24G)Vention Medical141-0027http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/
Catetere con punta in plastica morbidaTerumoSR*OX2419CA24G x 3/4" 
dilatatore microchirurgicoS& Dilatatore TD-5a.1, 11 cm, FH, 0,1 mm AT10d
Soluzione

Riferimenti

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