Filtro Analisi aria-campionato per endotossine e contenuto di DNA

Sommario

Qui sono descritte due analisi complementari di particelle biologiche atmosferiche provenienti da filtri campionati in aria: l'estrazione e la rilevazione di endotossine e di DNA.

Abstract

la ricerca di aerosol all'aperto comunemente utilizza il particolato di campionamento su filtri. Questa procedura permette diverse caratterizzazioni di particelle raccolte da eseguire in parallelo. Lo scopo del metodo qui presentato è quello di ottenere un'analisi molto accurata e affidabile della endotossina e DNA contenuto di bio-aerosol estratte dai filtri. L'estrazione di alto peso molecolare molecole organiche, come lipopolisaccaridi, da filtri campione comporta agitando il campione in un mezzo a base di acqua apirogena. La successiva analisi si basa su una reazione enzimatica che può essere rivelato utilizzando una misurazione turbidimetrico. Come risultato di elevato contenuto organico sui filtri campione, l'estrazione del DNA da campioni viene effettuata usando un kit di estrazione del DNA commerciale che è stato originariamente progettato per suoli e modificato per migliorare la resa DNA. L'individuazione e la quantificazione delle specie microbiche specifici utilizzando riatti a catena della polimerasi quantitativaon (q-PCR) sono descritti e confrontati con altri metodi disponibili.

Introduzione

Campionamento dell'aria sui filtri è uno strumento fondamentale nella ricerca aerosol atmosferico. ¹ I filtri campionati sono il punto di partenza per varie chimiche, fisiche, e caratterizzazioni biologiche delle particelle ambientali raccolti. ^2-11 Il vantaggio di questo approccio è che varie analisi possono essere eseguito off-line sullo stesso campione. Compilare i dati provenienti da tutte le diverse analisi permette al ricercatore di ottenere una buona comprensione delle caratteristiche delle particelle raccolte e aiuti a risolvere questioni complesse nel campo delle scienze atmosferiche. ^12,13 Per esempio, marine ed interne aria-campioni prelevati durante la stessa periodo può essere confrontata rispetto alla tossicità particelle campionata e composizione biologica. ¹⁴ per questo studio, lipopolisaccaridi (LPS), componenti batteriche pareti cellulari gram-negativi, noto anche come endotossine, sono stati estratti dai filtri campionata on-shore ea un sito interno, e sono stati valutati utilizzando ilLimulus lisato di amebociti (LAL). In parallelo, una valutazione genomica della carica batterica (batteri totali, gram negativi, e cianobatteri) è stata eseguita sullo stesso campione usando la reazione a catena della polimerasi quantitativa (q-PCR). Il test LAL si basa su misure di torbidità formate in seguito all'aggiunta di un estratto acquoso di amebociti dal limulo, Limulus polyphemus, ad una soluzione acquosa contenente le endotossine. Maggiore è la concentrazione di endotossina nel campione, la torbidità veloce sviluppa. ¹⁵ L'analisi q-PCR si basa su un segnale di fluorescenza emessa da uno specifico frammento di DNA amplificato. ¹⁶ Con il monitoraggio in tempo reale del segnale durante la fase esponenziale della PCR reazione e calibrazione con una curva standard, l'importo iniziale di DNA possono essere quantificati. La combinazione di queste due analisi insieme ad altri, come descritto altrove, ¹⁴ possono fornire una buona stima dei livelli di endotossina equantità di batteri di origine nei campioni.

Lo scopo del metodo qui presentato è quello di ottenere un'analisi molto accurata e affidabile della endotossina e DNA contenuto di bio-aerosol estratte dai filtri. Mentre i metodi per il campionamento delle caratteristiche chimico fisiche ed inorganici aerosol sono ben noti e, più recentemente, sono stati sviluppati metodi per indagare sua componente materia organica, ¹⁷ vi è stata la ricerca scarsa sulla componente biologica di aerosol. ¹⁸ Il razionale per la corrente il metodo è quello di affrontare questa lacuna presentando in dettaglio un metodo robusto per l'estrazione, l'analisi e l'identificazione la frazione biologica di aerosol nell'aria. ¹⁴

Il metodo descritto qui è prevista per trovare impiego diffuso in progetti di ricerca biologica per interni ed esterni di aerosol che coinvolgono l'analisi del filtro. ^20-24

Protocollo

Nota: Un elenco dettagliato di tutti i materiali e gli strumenti utilizzati in questo protocollo è mostrato nella sezione Materiali.

1. Aria di campionamento su filtri

1. Preparazione di filtri
   1. Per il campionamento ad alto volume, utilizzare 20,3 x 25,4 centimetri ² filtri. Scegliere il tipo specifico di filtro che meglio si adatta alle esigenze di ricerca, così come le dimensioni del filtro cut-off, se applicabile. ¹ Qui, filtri in microfibra uso di quarzo.
   2. filtri pre-cuocere per il prelievo del composto organico e biologico per distruggere residui organici. Per pre-cuocere i filtri, avvolgerli singolarmente in foglio di alluminio e poi cuocere in forno laboratorio a 450 ° C per almeno 5 ore.
   3. Conservare i filtri forno a -20 ° C fino al campionamento.
2. Manipolazione strumento e campionamento dell'aria
   1. Pulire polvere residua dalla testa del campionatore ad alto volume. Pulire le parti con salviette di carta puliti e consentire loro di befo asciugarere ricollegarli al campionatore.
   2. Disinfettare la cassetta del filtro con etanolo, e lavorare con i guanti e un camice da laboratorio in ogni momento.
   3. Mettere un filtro pre-cotto all'interno della cassetta filtro pulito, e procedere secondo il manuale campionatore ad alto volume.
   4. Segnare la data e le eventuali condizioni atmosferiche particolari, se del caso (ad esempio pioggia, polvere tempesta) sulla avvolgere in alluminio, e salvarlo in un luogo pulito fino al completamento del campionamento.
   5. Raccogliere il filtro campionato e piegarlo a metà, con il lato rivolto verso l'interno campionato.
   6. Avvolgere il filtro nel sacchetto originale e conservare a -20 ° C fino all'analisi.
      Nota: Se l'intervallo di tempo tra il campionamento e analisi è più di 2 mesi, conservare il campione a -80 ° C per evitare la degradazione del materiale organico e biologico.

Analisi 2. Endotossina

Nota: Disinfettare il piano di lavoro con il 70% di etanolo unlavoro d con apirogeni tubi, consigli e reagenti solo. Se si utilizzano oggetti di vetro, è necessario pre-riscaldamento a 250 ° C per 30 minuti, o 200 ° C per 60 min. ²⁵ preparare tutti i reagenti in una classe II armadietto biosicurezza e lavorare con i guanti e un camice da laboratorio in ogni momento.

1. Preparazione dei reagenti
   1. Seguire il protocollo del produttore kit di LAL per reidratare il lisato poco prima dell'uso. ²⁶ Toccare delicatamente il flacone per rimuovere LAL rimanendo sulle pareti della bottiglia. Sollevare delicatamente il tappo per rompere il vuoto. Utilizzando una siringa agugliato, aggiungere 5 ml di acqua priva di pirogeni (PFW) al flaconcino per reidratare tutti i contenuti lisato e mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma.
   2. Sigillare la fiala con il film di paraffina plastica quando non in uso e conservare a 4 ° C per un massimo di due giorni. Conservare la lisato rimanendo a -20 ° C per un massimo di tre mesi.
      Nota: Questo reagente può essere congelato una sola volta.
   3. Reidratare il controllo di endotossina standard (CSE), che contiene 0,5 μ; g E. coli, in accordo con il protocollo del produttore. ²⁷ determinare la quantità specifica di acqua da aggiungere al flaconcino CSE dal sito del produttore ²⁸ inserendo il numero di lotto per il kit dove specificato sul sito. La concentrazione finale di E. coli nel flaconcino, viene misurata in unità di endotossine (UE, dove 10 EU = 1 ng). Etichettare questo flacone ED0.
   4. Sigillare la fiala CSE con il film di paraffina plastica quando non in uso e conservare a 4 ° C per un massimo di 4 settimane.
2. Curva standard e preparazione spillo-filtro
   1. In un armadio biosicurezza di classe II, preparare 22 2 ml provette da centrifuga apirogena, contenenti decreasing quantità di CSE (tubi Ed1-ED11) o nessuna CSE (il tubo bianco contenente solo PFW) per produrre una serie di diluizioni di endotossina duplicato, come mostrato nella Tabella 1.
   2. In un armadio biologica con flusso circolare, tagliare 22 pezzi circolari di filtro pulito, pre-cotta utilizzando una disinfettata 1.1 2 centimetri di diametro sughero piralide.
   3. Mettere le coppie di filtro in piastre Petri sterili.
   4. Spike 50 ml da ciascun membro della serie di diluizioni endotossine Ed2-ED11 e dal tubo vuoto su una corrispondente coppia di filtri.
   5. Lasciare le piastre Petri contenenti filtri a spillo aperte sotto il cofano asciugare per 30 min.
   6. Mettere ogni pezzo di filtro in un tubo apirogena 2 ml.

Tubo	Concentrazione di endotossina finale (UE ml -1)	Volume di endotossine standard (ml)	Pyrogen volume di acqua libera (ml)	volume totale (ml)
eD0	2.500	soluzione madre*		5
ED1	1.000	80 (da ED0)	120	200
ED2	100	20 (da Ed1)	180	200
ED3	50	10 (da Ed1)	190	200
ED4	25	5 (da Ed1)	195	200
ED5	12.5	2,5 (da Ed1)	197,5	200
ED6	6.25	1.25 (da Ed1)	198.75	200
ED7	3.125	6.25 (da Ed2)	193,75	200
ED8	1.563	6.25 (da Ed3)	193,75	200
ED9	0,781	6.25 (da ED4)	193,75	200
ED10	0,391	6.25 (da ED5)	193,75	200
ED11	0,195	6.25 (da ED6)	193,75	200
vuoto	0	0	200	200
* Preparare la soluzione di riserva come da istruzioni del produttore.

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Tabella 1:. Endotossina standard Curve concentrazione di endotossina, il volume di endotossina standard e di acqua apirogena da aggiungere, e il volume totale ottenuto è dettagliato per ogni provetta di diluizione nella curva di calibrazione.

3. L'endotossina estrazione dalla Sperimentale e Filtri Spiked
   1. In un armadio biologica con flusso circolare, tagliare i filtri campione (dal punto 1.2) in pezzi circolari utilizzando un disinfettato 1,12 centimetri di diametro sughero piralide, e metterli, insieme con i filtri standard spillo (dal punto 2.2), in 2 apirogeno tubi ml (ad esempio, i tubi campione).
   2. Aggiungere 1 ml PFW ai tubi e agitare per 60 min a temperatura ambiente, utilizzando un agitatore di laboratorio.
   3. Centrifugare le provette per campioni in una microcentrifuga a 375 xg per 10 min. ²⁹
   4. esimo di trasferimentoe surnatante, che contiene le endotossine, in una nuova provetta apirogena 2 ml.
4. Limulus lisato di amebociti (LAL)
   1. Determinare la concentrazione di endotossina nei campioni eseguendo il test LAL in apirogena micropiastra a 96 pozzetti a fondo piatto e un coperchio.
   2. Pianificare la matrice piatto in anticipo, come mostrato in Figura 1. Include una curva standard preparata direttamente da soluzioni standard endotossine Ed2-ED11 (e quindi che coprono l'intervallo di concentrazione di 100-0.195 UE / ml (vedi sezione 2.2)) in ogni piatto in esecuzione . La curva standard dovrebbe occupare pozzetti 1-10 di righe A e B della piastra. Annullare pozzi 11-12 in queste righe per campioni bianchi (per un totale di quattro spazi).
   3. Accendere il lettore di micropiastre e programmare una reazione cinetica coinvolge incubazione della micropiastra a 37 ° C e agitando ogni 5 minuti, seguito da misure di assorbimento a 405 nm. Ripetere 18 volte per 1,5 ore.
   4. Determinare il efficienzecy con cui le endotossine sono estratti dai filtri campione (cioè., i campioni ottenuti dai filtri standard spillo) tramite divisione dell'importo endotossina calcolato in base al valore originale spillo.
   5. Avviare il test mettendo 50 ml di soluzioni di endotossina standard (dal punto 2.4.2), o dell'estratto del filtro a spillo e dei suoi spazi (da sezione 2.3), o dei campioni sperimentali e dei suoi spazi (anche da sezione 2.3), come da previsto plate-array (figura 1) e chiudere il coperchio.
   6. Per ogni bene, aggiungere rapidamente 50 ml di soluzione di LAL, e agitare delicatamente la piastra orizzontale mentre è posta sul tavolo prima di sollevare nel lettore.
   7. Posizionare la piastra nel lettore di piastre e iniziare la corsa sperimentale.

Figura 1:. Piastra serie Endotossina Un exampia di un array analisi endotossina in una micropiastra a 96 pozzetti.

3. analisi genomica

Nota: per l'estrazione del DNA, disinfettare la superficie di lavoro con il 70% di etanolo e lavorare con provette sterili, consigli e reagenti solo. Per l'analisi q-PCR del DNA, disinfettare la superficie di lavoro con la superficie del DNA-decontaminante. Preparare tutti i reagenti in un armadio biosicurezza di classe II e lavorare con i guanti e un camice da laboratorio in ogni momento.

1. Preparazione dei primer DNA e Sonde
   1. Prima di estrazione del DNA, sia fine un insieme disponibile in commercio di primer e una sonda (se viene applicato il metodo di sondaggio idrolisi), progettare un nuovo set di primer ed una sonda con innesco progettazione di strumenti computazionali. ³⁰
   2. Reidratare il primer secondo il protocollo del produttore utilizzando 10 mM Tris-0,1 acido mM etilendiamminotetraacetico (EDTA) (tampone TE) o acqua PCR-grade.
      Nota: Si consiglia di sciogliere il PCR Primer iniziale stock in tampone TE con bassa EDTA (0,1%) in quanto impedisce la degradazione Primer, conservato per tempi più lunghi. Utilizzare acqua PCR-grade per diluizioni successive per ridurre quantità EDTA che potrebbero inibire le reazioni PCR.
   3. Preparare aliquote di 50 ml o 100 ml di primer e sonda in sterili da 0,5 ml tubi e conservare a -20 ° C fino al momento dell'analisi.
2. La valutazione delle cellule concentrazione standard Prima di DNA Extraction
   1. In una provetta da centrifuga di dimensioni adeguate, preparare una soluzione cella standard delle specie microbiche di interesse (tubo Od0, Ping-2A). Mescolare la sospensione cellulare pipettando su e giù nel tubo 7-10 volte con una pipetta con un piccolo foro.
   2. Se le cellule sono di colore (ad esempio alcuni spore fungine), non eseguire una procedura di colorazione. Se è richiesta colorazione della cellula, diluire la sospensione cellulare in un colorante adatto rilevazione microscopica delle cellule di interesse. ³¹
   3. Pulire il vetrino e hemocytometer con etanolo. Inumidire e apporre la polizza di copertura al emocitometro.
   4. Caricare circa 8 ml di sospensione cellulare in entrambe le camere emocitometro toccando con cura il bordo del vetrino con la punta della pipetta e riempiendo la camera per capillarità. Non sopra / sotto riempire la camera.
   5. Determinare il numero di cellule da loro la visualizzazione al microscopio a 400X ingrandimento (40X in oggettiva e 10X in oculare). Nove piazze misura 1 x 1 mm ² e disposte in una griglia 3 x 3 dovrebbero essere visti. Primo il microscopio su una delle quattro caselle d'angolo della griglia (un ingrandimento maggiore può essere utilizzato). Il ² mm quadrato 1 x 1 deve contenere 16 quadrati più piccoli.
   6. Contare le cellule nelle quattro 1 x 1 mm ² piazze angolari, nonché nel quadrato centrale della griglia 3 x 3. Se ci sono troppi o troppo poche cellule per contare, ripetere la procedura, sia di concentrazione o diluire la sospensione cellulare originale a seconda dei casi (15-50 cellule devono sovrapporre una zona individuando 1 millimetro ^2).
   7. Calcolare la concentrazione delle cellule (cellule ml ^-1) nella sospensione cellulare standard Od0 dalla cella conteggio media di tutti i cinque quadrati contati come segue: Cell count ml ^-1 = cella medio conteggio quadrato ^-1 Fattore di diluizione 10 ^4.
3. Valutazione del DNA Extraction efficienza
   1. Preparare nove sterili da 0,5 ml tubi in base alla tabella 2A.
   2. Diluire la soluzione cella standard (Od0) per contenere circa 10 ⁷ cellule ml ^-1 in un volume totale di 20 microlitri (OD1).
   3. Aggiungere 18 ml di acqua sterile PCR-grade priva di nucleasi (NFW) ai tubi OD2-OD8 e 20 l per il tubo vuoto, Od9.
   4. Trasferimento 2 ml di soluzione di cellule da OD1 in OD2. Pipetta delicatamente per mescolare e trasferire 2 ml di tubo di OD2 a OD3. Continuare diluendo le celle nello stesso modo lungo i tubi fino al tubo OD8 di obtain una diluizione seriale di 10 ⁷ -10 ⁰ cellule ml ^-1.
   5. In un armadio biologica con flusso circolare, tagliare 18 pezzi circolari di filtro pulito, pre-cotta, utilizzando una disinfettata 1,12 centimetri di diametro sughero piralide. Mettere i filtri in coppie in piastre Petri sterili.
   6. Spike 10 microlitri da diluizioni OD1 a OD8 e dal vuoto tubo Od9 su ciascuno dei filtri accoppiati, in modo tale che vi è una coppia di filtri corrispondente a ciascuna concentrazione cellulare standard.
   7. Lasciare le piastre di Petri aperti sotto il cofano e lasciarli asciugare per 30 minuti.
   8. Mettere ogni pezzo filtro in un tappo a vite 2 ml provetta sterile ed estrarre il DNA secondo la procedura descritta nella sezione 3.4.
4. Estrazione del DNA dal Sperimentale e Filtri Spiked
   Nota: per l'estrazione del DNA da filtri, utilizzare kit commerciali progettati per l'estrazione del DNA dal suolo secondo il protocollo del produttore con le seguenti modifiche.
   1. Per ogni filter del campione (OD1-OD8), preparare una miscela di perle di vetro lavata con acido in una provetta sterile 0,5 ml. Utilizzare 0,1 g perline aventi un diametro di 425-600 micron e 0,3 g perline di diametro ≤106 micron.
   2. In un armadio biologica con flusso circolare, tagliare tre pezzi circolari da luoghi selezionati casualmente per ogni campione filtro con un disinfettata 1,12 centimetri di diametro sughero piralide, e metterli in tappo a vite 2 ml tubi.
   3. Aggiungere il composto perle di vetro ai tubi.
   4. Aggiungere la memoria di cella-lisi fornito con il kit di estrazione a ciascun tubo nel mobile biologica, con l'importo indicato nel protocollo del produttore.
   5. Preparare un secchio di ghiaccio e distruggere le cellule meccanicamente con un battitore tallone.
   6. Battere le perline per 1 minuto e poi metterli in ghiaccio per 1 min. Ripeti cinque volte.
   7. Procedere con il protocollo del fornitore corredo dalla fase di post-lisi.
   8. Dopo l'eluizione con tampone di eluizione in dotazione (contiene 10 mM Tris bUffer) o NFW, ricaricare il campione eluito attraverso la colonna di nuovo per migliorare la resa del DNA.
      Nota: Se non analizzato lo stesso giorno come l'estrazione del DNA, i campioni possono essere conservati a -20 ° C fino all'analisi.

A- Preparazione di standard Serie cellulare diluizione
Tubo	Concentrazione cellulare finale (ml -1 cellulare)	il volume delle cellule standard (ml)	volume di acqua priva di nucleasi (ml)	Volume totale (ml)
Od0	determinare con orloocytometer camera di conteggio
OD1	dovrebbe essere eluito alla gamma di 10 7 cellule ml -1			20
OD2	10 -1 OD1	2 di OD1	18	20
OD3	10 -2 OD1	2 di OD2	18	20
OD4	10 -3 OD1	2 di OD3	18	20
OD5	10 -4 OD1	2 di OD4	18	20
OD6	10 -5 OD1	2 di OD5	18	20
Od7	10 -6 OD1	2 di OD6	18	20
OD8	10 -7 OD1	2 di Od7	18	20
vuoto	0	0	20	20
B- Preparazione del DNA Curva Standard
Tubo	Concentrazione di DNA finale (mg ml -1)	Volume DNA standard (ml)	volume di acqua priva di nucleasi (ml)	Volume totale (ml)
determinare con NanoDrop
DD1	dovrebbe essere eluito alla gamma di 10 mg 1 ml -1			20
DD2	10 -1 DD1	2 di DD1	18	20
DD3	10 -2 DD1	2 di DD2	18	20
DD4	10 -3 DD1	2 di DD3	18	20
DD5	10 -4 DD1	2 di DD4	18	20
DD6	10 -5 DD1	2 di DD5	18	20
DD7	10 -6 DD1	2 di DD6	18	20
DD8	10 -7 DD1	2 di DD7	18	20
vuoto	0	0	20	20

1 "style =" height: 21px; "> DD0

Tabella 2:. DNA standard Curve serie di diluizioni cella microorganismo standard (A) dettagliato del volume standard di cellule, il volume NFW, e il volume totale in ogni provetta di diluizione. DNA preparato standard curva (B), dettagliato del volume standard DNA, il volume NFW, e il volume totale in ogni provetta di diluizione.

5. DNA Curva standard Preparazione
   1. Estrarre DNA direttamente da un campione standard del microrganismo di interesse (DD0) usando la stessa procedura descritta per i filtri sperimentali nel passaggio 3.4.
   2. Utilizzare uno spettrofotometro per determinare la concentrazione di DNA del campione di DNA standard (DD0) a 260 nm.
   3. Preparare nove sterile 0,5 ml tubi che per preparare una curva standard DNA, come mostrato nella Tabella 2B.
   4. Se necessario, diluire la soluzione standard di DNA DD0 entro un intervallo di concentrazione di 1-10 mg ml ^-1 nel primo tubo (DD1) in un volume totale di 20 microlitri.
   5. Aggiungere 18 ml di NFW ai tubi DD2-DD8 e 20 ml al tubo vuoto.
   6. Trasferimento 2 ml di soluzione di DNA standard dal dd1 in DD2. Pipettare delicatamente per mescolare e poi trasferire 2 ml da DD2 a DD3. Continuare diluire il DNA nello stesso modo lungo i tubi per ottenere una diluizione seriale di 10 ⁰ -10 ^-7 in tubi DD2-DD8 insieme ad un tubo vuoto containing solo NFW.
      Nota: se non analizzato lo stesso giorno dell'estrazione, conservare i campioni a -20 ° C fino al momento dell'analisi.
6. Analisi quantitativa-PCR
   1. Accendere lo strumento q-PCR in anticipo per riscaldarsi.
   2. In un nuovo file di programma, inserire i dettagli per il q-PCR familiare nel software dello strumento operativo come indicato nella tabella 3.
      Nota: gli strumenti differenti hanno tempistica ottimale diverso per ogni fase del ciclo termico. Questo ingresso è specificato nel manuale dello strumento.
   3. Disinfettare la superficie di lavoro con la superficie del DNA-decontaminante e funziona solo con provette sterili, consigli e reagenti.
   4. Preparare un secchio di ghiaccio accanto al banco di lavoro. Conservare mix Taq-polimerasi sul ghiaccio.
   5. Calcolare il numero totale di pozzetti di reazione che sarà occupato nella piastra. Tenere conto teorica di reazioni supplementari (5%) e moltiplicare il numero di reazioni allargata per il volume per reazione per calcolare il totale reactioil volume n.
   6. Preparare la piscina reazione mista, a partire dal NFW, primer, sonde, e infine il mix di Taq polimerasi. Vedere l'esempio per i calcoli di volume per la piscina mista nella tabella 4.
   7. Conservare la miscela di reazione al buio e in ghiaccio fino al momento dell'uso.
   8. Mettere 1 ml di DNA di serie, campione di DNA, o NFW (come controllo negativo) all'interno dei pozzetti nella micropiastra q-PCR in triplicato.
   9. Assicurarsi che il piatto è in un portatarga per impedirne il contatto con la superficie di lavoro e per mantenere pulito.
   10. Aggiungere 9 ml di piscina misto (Tabella 4) in ogni pozzetto di reazione.
   11. Coprire la piastra con pellicola adesiva ottica e sigillarla ermeticamente da tutti i lati.
   12. Spin la piastra in una centrifuga con secchi piastra per 1 min a 1000 xg prima di inserirlo nel dispositivo q-PCR.
   13. Posizionare la piastra nello strumento e attivare il programma in esecuzione.

Parametro	Dettagli	Commenti
metodo di rilevazione	Sonda idrolisi Quantitative
condizioni di cicli termici
denaturazione iniziale e attivazione di enzimi	95 ° C per 10 min
Denaturazione	95 ° C per 15 sec	ripetere 45 volte
Ricottura e l'estensione	60 ° C per 60 sec
serie piastra
curva standard	DD1 - DD8	3 ripetizioni per diluizione in 1-8 pozzi ai primi 3 righe
controllo non-template (NTC)	acqua priva di nucleasi (NFW)	3 ripetizioni in 9 ° e in cima3 file.
campioni analizzati	DNA estratto dai filtri	3 ripetizioni per campione ai pozzetti rimanenti.
primer	per ogni bene
volume del campione	10 ml

Tabella 3:. Dettagli per il software operativo q-PCR dettagli dei parametri di analisi da inserire nel file di programma q-PCR.

Reagente	Volume per reazione (ml)	Numero di reazioni	Margini di errore(5%)	Mix Volume totale (ml)
mix Taq polimerasi	5	50	52,5	262.5
F Primer (10 mm)	0.5	50	52,5	26.25
R Primer (10 mm)	0.5	50	52,5	26.25
acqua priva di nucleasi	3	50	52,5	157.5
DNA - 1 ml sarà aggiunto direttamente nei pozzetti di destinazione nella piastra 96.

Tabella 4:. quantitativa-PCR miscela di reazione calcolo del volume per reazione, il numero di reazioni, margini di errore, e il volume totale calcolato da aggiungere nel mix di reazione per reagente sono dettagliate.

Risultati

È comune per studiare aerosol atmosferici usando "off-line" analisi di filtri campione (vedere Figura 2). Analisi ³² chimica del contenuto campionato sostanza includere organica (ad esempio proteine, molecole di idrocarburi, saccaridi) ed inorganici (ad esempio metalli, sali) . analisi biologiche includono contenuti vitali e non vitali microorganismo, identificazione delle specie utilizzando un approccio DNA o la microscopia, nonché...

Discussione

Questo lavoro descrive i metodi di estrazione e di rilevazione per quantificare sia endotossine e DNA presente in campioni di aerosol raccolti su filtri. I metodi richiedono routine accurati e possono essere eseguiti facilmente finché sperimentatore aderisce ad alcuni punti essenziali ed importanti discussi qui.

Per la fase di rilevazione endotossine, si noti che la soluzione lisato è molto viscoso e tende a produrre bolle su pipettaggio. E 'difficile da rimuovere te bolle, e si portano ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Campionamento filtri
HiVol 3000 - Campionatore d'aria ad alto volume	Filtri
Whatman		1851-865	203 mm x 254 mm
ELF - Forni a camera da laboratorio	Carbolite	ELF 11series
Foglio di alluminio	Opale
< strong>Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Endotoxin
Ethanol	Sigma Aldrich	16368	Reagente di laboratorio, 96%
Cabina di sicurezza biologica Airstream Classe II AC-4E1	ESCO	10011712
Pyrotell -T	Associates di Cape Cod, Inc.	T0051
Standard di controllo Endotossina	Associates di Cape Cod, Inc.	E0005-1	Escherichia coli  O113:H10, 0,5 & micro; g/fiala 1 confezione di
reagente LAL Water	Associates di Cape Cod, Inc.	W0051
Siringa sterile da 10 ml con punta Luer-Lok	Becton-Dickinson & Co.
BD Precisionglide ago per siringa	Becton-Dickinson & Co.	305129	Sterile
Nastro sigillante Parafilm-M	Parafilm	P7543	Sigma numero di catalogo
Microtubi	Axigen	MCT-200-C	2 ml, apirogeno
1,12 cm di diametro Alesatore per sughero	Boekel Scientific	1601 Serie BD - Acciaio	Parte di un set di alesatori per sughero contenente alesatrici con vari diametri.
Piastra di Petri da 50 mm	Miniplast Ein-Shemer	72050-01	Vortice asettico
Genie 2	Industrie scientifiche, inc.	SI-0297
Microcentrifuga 5415 D	Eppendorf	22621408
TC MicroWell 96 F SI c/coperchio	Nunc	167008	Pozzetti a fondo piatto (con coperchio (confezionato singolarmente)), sterili, apirogeni
Lettore di micropiastre a rilevamento multiplo Synergy HT Biotek		7091000
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
DNA
DNA away	Sigma Aldrich	7010
DNA standard delle specie microbiche di interesse	ATCC o altra collezione		O il ceppo microbico appropriato per l'estrazione del DNA o il DNA estratto
Emocitometro Neubauer	Marienfeld	640030
tampone TE, Low EDTA	Life Technologies	12090-015	10 mM Tris-HCl (pH 8,0)  0,1 mM EDTA
Acqua PCR priva di nucleasi	Primer per PCR Sigma Aldrich	3315959001
	Sigma Aldrich		Prende di mira le specie microbiche di interesse
Sonde a doppia marcatura	Sigma Aldrich		Prende di mira le specie microbiche di interesse
Provette con tappo a vite	Axigen	ST-200-SS	2 ml
Kit di estrazione del DNA PowerSoil	Mo Bio Laboratories	12888-100
Perle di vetro, lavate con acido 425-600 & micro; m	Sigma Aldrich	G8772-100G
Perle di vetro, lavate con acido < 106 µ m	Sigma Aldrich	G4649-100G
PowerSoil Solution C1	Mo Bio Laboratories	12888-100-1	Tampone di lisi cellulare, Power soil Kit
Magic Touch secchiello per il ghiaccio	Bel-Art	18848-4001
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	607EUR
StepOnePlus Sistema PCR in tempo reale	Biosistemi applicati	4376600
Veloce SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	4385612
TaqMan Gene Expression Master Mix	Applied Biosystems	4370048
Piastra di reazione ottica rapida a 96 pozzetti MicroAmp con codice a barre, 0,1 ml	Applied Biosystems	4346906
MicroAmp Base a 96 pozzetti senza spruzzi	Applied Biosystems	4312063
pellicola	adesiva ottica MicroAmpApplied Biosystems	4311971
Centrifuga 5810 R	Eppendorf	5811 000.010	Rotore A-4-62 con secchi MTP