Efficiente Espressione cellulari di mammifero e Passo singolo Purificazione di extracellulare glicoproteine ​​per cristallizzazione

La comprensione della struttura delle proteine ​​a livello atomico è la chiave per scoprire le basi molecolari dei percorsi e delle malattie biologiche. X-ray cristallografia di proteine ​​è il / metodo applicabile più ampiamente usato per determinare le strutture macromolecolari. La sfida principale di questo metodo è l'ottenimento di una quantità sufficiente di propriamente piegato, proteina pura. Questo diventa un problema particolare quando si lavora con le proteine ​​secrete di mammifero, che subiscono specifiche modificazioni post-traduzionali.

Proteine ​​batteri-espresse sono la fonte primaria di proteine ​​cristallizzate depositate nel Protein Data Bank ^1. Sistemi di espressione batterici sono largamente preferibili perché sono veloci, poco costosi e producono tipicamente alte rese di proteine. Tuttavia, i domini extracellulari di proteine ​​di mammifero espresse in batteri sono spesso non correttamente ripiegate, in cui sono richiesti caso refolding ed estesa purificazione passi per ottenere omogeneamente foproteine ​​lded. Inoltre, molte proteine ​​di mammiferi necessitano di glicosilazione post-traslazionale per ottenere una corretta piegatura ^2. Anche se l'espressione e glicosilazione in cellule di lievito o di insetto in grado di superare il problema ripiegamento, modificazioni post-traslazionali, tra cui glicosilazione, differiscono significativamente da quelle delle cellule di mammifero ^3, producendo proteine ​​con modifiche non corrette o non omogenei.

Le cellule di mammiferi esprimono tutta la macchinario molecolare necessario per garantire un'adeguata modificazioni post-traslazionale e pieghevoli; Tuttavia, questi sistemi di espressione non sono tipicamente preferiti dalla maggior parte laboratori, a causa di rendimenti limitati e costi elevati di reagenti e materiali di consumo. Polietilenimmina (PEI), un reagente di trasfezione standard è relativamente a buon mercato, ma impone una notevole citotossicità e la bassa efficienza di trasfezione, con conseguente aumento dei costi a supporto delle cellule, il DNA, e attrezzature coltura. Molte alternative al PEI sono proibitivi. Ci rivolgiamoquesti problemi descrivendo una combinazione di migliori strumenti di coltura cellulare e chimicamente modificati PEI per il metodo rapido e relativamente poco costoso per l'espressione di proteine ​​secrete mammifero, seguita da purificazione passo singolo. Questo metodo robusto fornisce rendimenti sufficienti per studi funzionali e biochimici ^4, e in alcuni casi, si traduce in proteine ​​suscettibili di cristallizzazione senza ulteriore purificazione.

Questo protocollo descrive diverse tecniche per massimizzare l'espressione e la resa per le proteine ​​di mammiferi secrete nel rene embrionali umane (HEK) 293F cellule coltivate in sospensione. Efficienza di trasfezione (e costo), la produzione di proteine ​​e purificazione sono tutti sempre maggiore seguendo questo protocollo. PEI modificato con l'aggiunta di carbammati per reazione apertura d'anello singolo step (PEI-TMC-25, sintesi e proprietà descritte in dettaglio ref ⁵⁾ migliora notevolmente l'efficienza di trasfezione, riduce la citotossicità da cationicorottura della membrana e di conseguenza riduce i costi di sperimentazione. Inoltre, la vitalità cellulare e l'espressione della proteina sono notevolmente migliorate con l'aggiunta di supplementi di coltura per la fornitura di glucosio e vitamine. È importante sottolineare che per la produzione di proteine ​​glicosilate, il trattamento con kifunensine, un inibitore chimico non tossico di Mannosidase I, produce proteine ​​con definite, glycans immaturi, che possono essere rimossi dal EndoHf endoglicosidasi per produrre proteine ​​con un singolo N-acetilglucosamina al posto di un full-length glicano ⁶ N-linked. Infine, la secrezione di proteine ​​in un mezzo chimicamente definito privo di siero consente purificazione rapida e facile per studi strutturali e biochimici. Single-step acido nitrilotriacetico nichel (Ni-NTA) purificazione resina rimuove la maggior parte dei contaminanti specie nel surnatante e, in alcuni casi, può produrre proteine ​​di purezza sufficiente per cristallizzazione.

1. Produzione di milligrammo quantità di DNA plasmidi per larga scala trasfezione transiente

1. Clonare la proteina di interesse in un alto numero di copie di mammifero vettore di espressione mediante clonazione sito di restrizione, o altra tecnica appropriata.
   1. Per ottenere risultati ottimali, utilizzare pHLsec ⁷ vettore, che ha un built-in C-terminale 6His-tag, un promotore forte sequenza di Kozak e un segnale di secrezione ottimizzato.
2. Trasforma il plasmide sulle cellule competenti.
   1. Aggiungere 20 ml di cellule competenti di E. coli su 1 pg di DNA plasmidico e incubare in ghiaccio per 30 min.
   2. Cellule shock termico a 42 ° C per 35 secondi, poi incubare in ghiaccio per 2 minuti.
   3. Aggiungere 300 ml di mezzo di crescita microbica (SOC) e incubare a 37 ° C per 45 minuti, agitando a 220 rpm.
   4. Cellule piastra sulla piastra di agar con un'appropriata selezione antibiotica.
      1. Utilizzare 100 mg / ml carbenicillina se il plasmide è nel vettore pHLsec.
3. Colonie culturali in 250 ml di Luria Broth (LB) Supporto integrato con 100 mg / ml antibiotico (carbenicillina) O / N a 37 ° C, agitando a 220 giri al minuto.
4. Purificare il DNA dalla cultura con Hi-Speed ​​plasmidi Maxi Kit secondo il protocollo del produttore.
   1. Eluire DNA in tampone EB (10 mM Tris-Cl, pH 8,5), invece di tampone TE.
   2. Aliquota il plasmide purificato in quantità necessaria per la trasfezione e conservare a -20 ° C.

2. Su larga scala, Cultura e transitoria Transfection di 293F Cells

1. Supplemento 1 L 293F media con 10 ml di glutammina e 5 ml Pen / Strep (entrambi 100x). Conservare a 4 ° C. 5 ml Pen / Strep è una forza sufficiente in condizioni di libero-siero e la concentrazione di antibiotico ridotto migliora la vitalità delle cellule durante la trasfezione, che migliora le rese di proteine.
2. Cultura cellule 293F in 300 ml media in 1 L policarbonato sconcertato beute con tappo ventilatos a 37 ° C con 8% di CO _2, agitando in uno standard di coltura tissutale incubatore.
3. Diluire le cellule per 5 x 10 ⁵ / ml densità un giorno prima trasfezione.
4. Il giorno della trasfezione, supplemento mezzo di coltura aggiungendo 10% del volume di 2% w / v Boost cellulare in 293F media.
   1. Misurare la concentrazione di glucosio usando un monitor di glucosio in base alle istruzioni del produttore e utilizzare integratori come necessario per ottenere una concentrazione di glucosio di 500 mg / dL.
5. Aggiungere kifunensine (1 mg / ml concentrazione finale) in questa fase per controllare glicosilazione delle proteine.
6. Calcolare il volume di DNA richiesto per 1 ug plasmide per 1 x 10 ⁶ cellule. In condizioni sterili, diluire DNA in mezzo privo di siero 5 ml.
7. Calcolare il volume di reagente trasfezione richiesto per 1 mg plasmide per 2 ml reagente di trasfezione. In condizioni sterili, diluire il reagente trasfezione (PEI-TMC-25) in mezzo privo di siero 5 ml.
8. Aggiungerereagente di trasfezione in soluzione di DNA con incrementi di 1 ml, mescolando delicatamente. Incubare per 30 minuti a RT per complessi DNA-reagente per formare. Quindi aggiungere la soluzione sulle celle in maniera goccia a goccia.
9. Consentono alle cellule trasfettate di esprimere proteine ​​per 72-96 ore. Supplemento con ~ media il 10% del volume Boost cellulare al giorno o, se necessario, per mantenere il glucosio lettura 400-600 mg / dl.

3. Purificazione

1. Decantare cultura in un pallone centrifuga, centrifugare per 20 minuti a 1300 xg per pellet cellule e quindi raccogliere il surnatante. Se necessario, girare una seconda volta e / o l'uso del filtro 0,22 micron per chiarire surnatante.
2. Aggiungere 10% del volume 10x Ni-NTA tampone di legame (1,5 M NaCl, 0,5 MK ₂ HPO _4, 0,1 M Tris pH 8,5, 50 mM imidazolo).
3. Preparare una colonna gravità aggiungendo 2 ml di Ni-NTA slurry in una colonna e equilibrante con 10 volumi di colonna (CV) di 1x tampone di legame. Se possibile, fare tutti i passi di colonna in una camera a 4 ° C. Alternatively, proteine ​​freddo e tutti i buffer sul ghiaccio prima del passaggio della colonna, e mantenere proteine ​​e raccolti a flusso continuo su ghiaccio.
   Nota: Ni-NTA slurry è del 50% in volume di resina e indicato capacità legante della produzione è di 50 mg / ml. Ni-NTA sfere possono essere ricaricate per molteplici usi
4. Flusso surnatante sulla resina e raccogliere flow-through. Ripetere questo passaggio.
5. Lavare con 10 CV di tampone di lavaggio (300 mM NaCl, 50 mM K ₂ HPO _4, 20 mM imidazolo pH 8).
6. Eluire la proteina in 5 CV di tampone di eluizione (NaCl 300 mM, 50 mM K ₂ HPO _4, 250 mM imidazolo pH 8).
7. Se è richiesta deglycosylation:
   1. Per un volume finale di 0,5 ml, concentrato eluato a 0,43 ml utilizzando un concentratore centrifugazione. Se precipita modulo, sedimentare i detriti per centrifugazione a 16.000 xg e 4 ° C.
   2. Aggiungere 50 ml di 500 mM Na-citrato pH 5,5.
   3. Aggiungere 20 ml di EndoHf (1 x 10 ⁶ U / ml). Incubare a temperatura ambiente per 2 ore.
      None: L'enzima funziona in modo ottimale a 37 ° C, che può causare la proteina concentrata per aggregare. Estendere l'incubazione RT, se deglicosilazione, valutata mediante SDS-PAGE o immunoblotting, è incompleta. L'enzima non ha attività a 4 ° C.
   4. Per rimuovere EndoHf: Lavare amilosio resina 3x in tampone fosfato (PBS) o tampone di stoccaggio definitivo. Incubare proteine ​​con resina per 1 ora a 4 ° C. Spin 5 min a 1000 xg per far sedimentare perline e raccogliere il surnatante.
   5. Concentrato di proteine ​​utilizzando appropriato filtro centrifugazione peso molecolare cutoff e buffer di scambio nel buffer di memoria (150 mM NaCl e 20 mM HEPES pH 7.5).

Qui di seguito i risultati di questo sistema di espressione applicata ad un dominio secreto 13 kDa immunoglobuline (Ig) dalla proteina di attivazione del recettore umano espresso sulle cellule mieloidi (2 hTREM2, residui 19-132). TREM2 è una proteina transmembrana di tipo I che contiene un singolo dominio extracellulare Ig che ha due ponti disolfuro e due siti di glicosilazione N-linked. A differenza di molte altre proteine ​​dominio Ig 8, TREM2 non era suscettibile di ripiegamento da corpi di inclusione batterici 9. Mutagenesi successiva confermati glicani N-linked sono necessari per una corretta espressione e piegatura. Per facilitare gli studi strutturali e funzionali, TREM2 è stato introdotto nel vettore pHLsec con un C-terminale 6His-tag 7 utilizzando tecniche di biologia molecolare standard. Espressione transiente in cellule trattate con kifunensine HEK293F prodotto proteina che viene purificato mediante cromatografia Ni-NTA (Figura 1B, corsia 2) ed il campione è stato poi deglicosilata produrre nativamente piegato, proteine ​​omogenea (Figura 1B, corsia 3). 293F espressione di TREM2 prodotto 5-10 mg / L (5-10μg / milione di cellule trasfettate). Dopo buffer di scambio nel buffer di memorizzazione, questa proteina è stato cristallizzato (Figura 1C). Nonostante la purezza finale di circa 80%, questi cristalli affidabile riprodotti, diffratta, e sono stati mostrati da argento-macchia contenere solo proteine ​​TREM2 (Figura 1D). Questa osservazione suggerisce l'omogeneità biochimica della proteina (cioè, piegatura e modificazioni post-traduzionali) possono, in alcuni casi, essere più critico di purezza globale per il successo di cristallizzazione.

Oltre a cristallizzazione, questo sistema offre uno strumento robusto per studi strutturali e funzionali. Si è sfruttata per la produzione di proteine ​​nativamente glicosilata e realizzare> purezza 95% in cromatografia di esclusione molecolare (Figura 1E, F). Questa fase di purificazione ulteriore, che mostra la solutiocomportamento n della proteina, è anche un modo ideale per monitorare la qualità delle proteine. La proteina purificata dovrebbe eluisce al volume corrispondente al suo peso molecolare e dovrebbe essere la specie più abbondante nel campione. Anormalmente grandi quantità di proteine ​​aggregate possono indicare proteina instabile e fornire indizi per ottimizzare la produzione di proteine ​​e purificazione. Inoltre, questa proteina purificata finale è superiore per esperimenti biofisici quantitativi quali spettroscopia di dicroismo circolare, stabilità termica, e in relazione alle interazioni proteina-ligando. Infine, controllo della entità del glicosilazione fornisce uno strumento robusto per studiare funzioni glycan-dipendente.

Figura 1. Mammalian Expression System: (A) Schema per l'espressione di proteine ​​di mammifero con glicosilazione controllata o nativo in cellule HEK 293F. ( B) SDS-PAGE di NiNTA-purificata hTREM2 espresso sotto kifunensine mostrato prima (corsia 2) e dopo (corsia 3) deglicosilazione con EndoHf. (C) cristalli prodotti da proteine ​​NiNTA-purificata e deglicosilata. (D) macchia d'argento di ingresso cristallizzazione (corsia 1) e cristalli raccolti (corsie 2 e 3) rivela cristalli contengono solo TREM2. (E) Un'ulteriore depurazione di TREM2 è stata ottenuta utilizzando cromatografia di esclusione molecolare di TREM2 NiNTA-purificata prodotta in 293F cellule senza Kifunensine. Asterischi (*) indicano volumi di eluizione di standard di peso molecolare. Le proteine ​​eluite in TBS usando una colonna analitica S200 (GE). (F) SDS-PAGE analisi di dimensioni dell'esclusione-purificata TREM2: proteine ​​ingresso (corsia 2) e il picco ripiegato (corsia 3). Si noti come, glycans eterogenee eseguire ad un più alto peso molecolare apparente con un ampio striscio da SDS-PAGE pieno.nk "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.