Efficiente Espressione cellulari di mammifero e Passo singolo Purificazione di extracellulare glicoproteine ​​per cristallizzazione

Daniel L. Kober; Zeynep Yurtsever; Thomas J. Brett

doi:10.3791/53445

È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Efficiente Espressione cellulari di mammifero e Passo singolo Purificazione di extracellulare glicoproteine per cristallizzazione

12.6K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/53445

⸱

23 dicembre 2015

Daniel L. Kober^*¹^,²^,³ , Zeynep Yurtsever^*²^,³^,⁴^,⁵ , Thomas J. Brett²^,³^,⁵^,⁶^,⁷

¹Molecular Microbiology and Microbial Pathogenesis Program, Washington University School of Medicine, ²Department of Internal Medicine, Washington University School of Medicine, ³Drug Discovery Program in Pulmonary and Critical Care Medicine, Washington University School of Medicine, ⁴Biochemistry Program, Washington University School of Medicine, ⁵Center for the Investigation of Membrane Excitability Diseases, Washington University School of Medicine, ⁶Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine, ⁷Department of Cell Biology and Physiology, Washington University School of Medicine

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo è un protocollo rapido ed economico per la produzione di proteine di mammifero glicosilate secrete e la successiva purificazione in un solo passaggio con rese sufficienti di proteine omogenee per la cristallografia a raggi X e altri studi biofisici.

Abstract

La produzione di proteine secrete nei mammiferi per studi strutturali e biofisici può essere impegnativa, dispendiosa in termini di tempo e costosa. Qui descritto è un protocollo efficiente in termini di tempo e costi per l'espressione di proteine secrete in cellule di mammifero e la purificazione in un'unica fase utilizzando la cromatografia di affinità con nichel. Il sistema si basa sulla trasfezione transitoria su larga scala di cellule di mammifero in sospensione, che riduce notevolmente il tempo di produzione delle proteine, in quanto elimina passaggi come lo sviluppo di virus di espressione o la generazione di linee cellulari ad espressione stabile. Questo protocollo utilizza agenti di trasfezione economici, che possono essere facilmente prodotti con una semplice modifica chimica, o agenti di trasfezione a prezzo moderato, che aumentano la resa grazie a una maggiore efficienza di trasfezione e a una minore citotossicità. Un attento monitoraggio e mantenimento dei livelli di glucosio nei terreni aumenta la resa proteica. Il controllo della maturazione dei glicani nativi nella fase di espressione aumenta la resa finale di proteine di mammifero correttamente ripiegate e funzionali, che sono proprietà ideali per perseguire la cristallografia a raggi X. In alcuni casi, la purificazione in un singolo passaggio produce proteine di purezza sufficiente per la cristallizzazione, che è dimostrato qui come caso di esempio.

Introduzione

La comprensione della struttura delle proteine a livello atomico è la chiave per scoprire le basi molecolari dei percorsi e delle malattie biologiche. X-ray cristallografia di proteine è il / metodo applicabile più ampiamente usato per determinare le strutture macromolecolari. La sfida principale di questo metodo è l'ottenimento di una quantità sufficiente di propriamente piegato, proteina pura. Questo diventa un problema particolare quando si lavora con le proteine secrete di mammifero, che subiscono specifiche modificazioni post-traduzionali.

Proteine batteri-espresse sono la fonte primaria di proteine cristallizzate depos....