Presentato qui è una descrizione unificata di tecniche che possono essere utilizzati per sviluppare, trasformare, amministrare e verificare l'espressione della proteina eterologa dei probiotici lievito Saccharomyces boulardii.
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Articolo metodologico
Trasformazione di lievito probiotico e il loro recupero da gastrointestinali immunitario tessuti dopo sonda gastrica nei topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo sviluppo di una terapia orale ricombinante consentirebbe un targeting più diretto del sistema immunitario della mucosa e migliorerebbe la capacità di combattere i disturbi gastrointestinali. L'adattamento del lievito probiotico in particolare per questo approccio comporta diversi vantaggi. Questi ceppi non solo hanno il potenziale per sintetizzare un'ampia varietà di proteine eterologhe complesse, ma sono anche in grado di sopravvivere e proteggere tali proteine durante il transito attraverso l'intestino. Tuttavia, questo approccio richiede competenze in molte tecniche di laboratorio diverse non tipicamente utilizzate in tandem. Inoltre, sebbene i singoli protocolli per la trasformazione del lievito siano ben caratterizzati per i ceppi di laboratorio comunemente usati, l'accento è posto qui su approcci alternativi e sull'importanza di ottimizzare la trasformazione per i ceppi probiotici meno ben caratterizzati. Dettagliare questi metodi aiuterà a facilitare la discussione sui migliori approcci per testare il lievito probiotico come veicoli di somministrazione orale di farmaci e servirà a far progredire lo sviluppo di questa nuova strategia per la terapia gastrointestinale.
Introduzione
microrganismi probiotici sono un intrigante potenziali mezzi di fornire in modo efficiente ed economicamente proteine eterologhe al tratto gastrointestinale. Questi organismi sono in grado di sopravvivere passaggio attraverso il tratto gastrointestinale ancora non colonizzare 1 che, consentendo dosaggio controllato e limitando l'esposizione al farmaco espresso. Inoltre, la possibilità di progettare facilmente questi organismi per produrre proteine eterologhe su larga scala li rende un'alternativa economica alle particelle di consegna sintetici. Tuttavia, lo sviluppo di un tale approccio, come recentemente dimostrato mediante un ceppo auxotrophi....
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Protocollo
1. mutagenesi UV per generare auxotrophic ceppi di lievito
- Generare curve di sopravvivenza per determinare dosi necessarie di irradiazione UV
- Preparare YPD (estratto di lievito peptone destrosio) i media e altri reagenti elencati nella tabella 1 secondo le procedure standard 26 e inoculare singole colonie in 5-10 ml di YPD media. Incubare culture su un tamburo a rulli a 30 ° CO / N alla saturazione per almeno 8 ore.
- Determinare la concentrazione cellulare di O / N coltura usando uno spettrofotometro diluendo cellule 1:10 in acqua in una cuvetta di plastica. Diluire le cellule ad una concentrazione di 10 7....
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Risultati
Generazione di una curva di sopravvivenza dopo irradiazione UV richiede la placcatura di cellule di lievito diluito in modo tale che le unità distinte formanti colonie (CFU) sono in grado di formare. Ogni campione 500 microlitri raccolto come sopra descritto contiene circa 5 x 10 6 cellule; Tuttavia, più di 100 colonie per piastra sono difficili da distinguere accuratamente. Placcatura campione diluito e seriali 1:10 diluizioni di cellule irradiate garantisce così che CFU poss.......
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Discussione
Insieme, i protocolli qui descrivono le fasi essenziali necessarie per lo sviluppo e la sperimentazione di ceppi di lievito probiotici auxotrofi per la consegna della proteina terapeutica eterologa per l'intestino. Questa manipolazione e la sperimentazione di ricombinante lievito probiotico richiede tecniche e le risorse con cui ogni singolo laboratorio non può attualmente essere a conoscenza. Quindi, anche se numerosi studi precedenti hanno descritto i protocolli di cui sopra per più di lievito e mouse ceppi, quest.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono il finanziamento attraverso il centro della bambini per Immunologia e vaccini e di un nuovo premio Innovator NIH (1DP2AI112242-01) assegnato a Tracey J. Lamb. Gli autori ringraziano anche Natalya P. Degtyareva per il generoso contributo di RAD1 S. cerevisiae.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Spettrofotometro SmartSpec 3000 | BioRad | 170-2501 | Esempio di spettrofotometro per la determinazione della concentrazione cellulare e OD600 di colture di lievito |
| New Brunswick Roller Drum | Eppendorf | M1053-4004 | Esempio di tamburo a rulli per l'incubazione di colture di lievito |
| UV Stratalinker 2400 | Stratagene | 400075-03 | Esempio di stratalinker |
| Contatore di colonie Stuart SC6PLUS | 11983044 | Fisher Scientific | Plate stand con record di ingrandimento conteggio delle colonie dopo aver rilevato la pressione dalla penna |
| Scienceware Colony Counter | F378620002 | Bel-Art Scienceware | Penna contante colonia portatile |
| Dispositivo di placcatura replica | Fisherbrand | 09-718-1 | Esempio di supporto e pastiglie di placcatura replica |
| Quadrati in velluto | Fisherbrand | 09-718-2 | |
| Spandiconcime per celle sterili a forma di L | Fisherbrand | 14665230 | |
| Acido desossiribonucleico, a filamento singolo da testicoli di salmone | Sigma-Aldrich | D7656-1ML | Esempio di DNA vettore per la trasformazione del lievito LiOAc |
| Aghi di gavage | Braintree Scientific | N-PK 002 | Per i topi da 15-20 g, l'ago suggerito è un ago da 22 gauge (palla da 1,25 mm), lungo 1 pollame, dritto e riutilizzabile. Per topi di peso superiore a 20 g, possono essere utilizzati aghi per sonda magnetica dritti o curvi calibro 20 o più grandi |
| siringa sterile per tubercolina monouso con punta a slitta da 1 ml | Becton Dickinson | BD 309659 | |
| Pinze smussate come Electron Microscopy Sciences Punta seghettata da 7" (178 mm), pinze a presa larga | Electron Microscopy Sciences | 77937-28 | Esempio di pinze smussate necessarie per la dissezione |
| Forbici da dissezione diritte e curve | Microscopia elettronica Scienze | 72966-02 e 72966-03 | Esempi di forbici necessarie per la dissezione |
| Tecnologie IMDM | Life | 12440053 |
Riferimenti
- Edwards-Ingram, L., Gitsham, P., et al. Genotypic and physiological characterization of Saccharomyces boulardii, the probiotic strain of Saccharomyces cerevisiae. Applied and environmental microbiology. 73 (8), 2458-2467 (2007).
- Hudson, L. E., Fasken, M. B., et al.
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Ristampe e permessi
