È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Monitoraggio e quantificazione processi di sviluppo in

8.5K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/53469

⸱

16 dicembre 2015

 ,  ,  ,  , 
1Buchmann Institute for Molecular Life Sciences and Institute of Biochemistry II, School of Medicine, Goethe University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui viene mostrato come tracciare e quantificare i processi di sviluppo in C. elegans. I metodi presentati si basano su strumenti open source che possono essere facilmente implementati. Viene dimostrato come ricostruire modelli 3D di forma cellulare, come tracciare manualmente le strutture subcellulari e come analizzare il flusso contrattile corticale.

Abstract

Quantitativamente cattura processi di sviluppo è fondamentale per ricavare modelli meccanicistici e la chiave per identificare e descrivere fenotipi mutanti. Qui protocolli sono presentati per la preparazione di embrioni e adulti C. elegans animali per breve e lungo termine microscopia time-lapse e metodi per il monitoraggio e la quantificazione dei processi di sviluppo. I metodi presentati sono tutti basati su C. ceppi disponibili nel Caenorhabditis Genetics Center e sul software open-source elegans che possono essere facilmente implementate in qualsiasi laboratorio indipendentemente dal sistema di microscopia utilizzato. Una ricostruzione di un modello cellulare-forma 3D utilizzando il IMOD software di modellazione, il monitoraggio manuale delle strutture subcellulari fluorescenza marcata con il programma di analisi di immagine multi-purpose Endrov, e un'analisi dei flussi contrattile corticale mediante PIVlab (-Time Risolto Image Velocimetry Particle digitale sono mostrati strumento per MATLAB). Si è discusso di come questi metodi possono anche essere distribuiti to quantitativamente catturare altri processi di sviluppo in diversi modelli, per esempio, di monitoraggio delle cellule e lineage tracing, il monitoraggio del flusso di vescicole.

Introduzione

Con i miglioramenti costanti di proteine ​​fluorescenti, ingegneria del genoma, la microscopia ottica, e software e all'hardware, è ora possibile registrare sviluppo di molti organismi modello a risoluzione senza precedenti spazio-temporale. Questo permette ai ricercatori di fare domande che non possono essere affrontate in precedenza o per rivisitare i processi di sviluppo noti per la ricerca di aspetti trascurati. Questo progresso ha scatenato campo della biologia dello sviluppo quantitativo, che mira a trasformare qualitativi, modelli informali in modelli quantitativi da misurazioni approfondite e analisi statistiche.

Tracking cellule e strutture subcellulari ha permesso di ricavare modelli quantitativi dello sviluppo embrionale, l'attività del sistema nervoso, o divisione cellulare 1-12. Tracciando resti divisione cellulare durante lo sviluppo iniziale del C. elegans embrione, potremmo recentemente rivelare che seguono un impianto stereodigitato il percorso e costituiscono importanti fattori di polarizzazione 13,14.

Qui, i protocolli vengono presentate che rendono la biologia dello sviluppo quantitativo approcci accessibili per i non esperti. L'attenzione si concentra su tre straight-forward, strumenti liberamente disponibili che sono implementabili in qualsiasi laboratorio che ha accesso a microscopia confocale standard ed i computer. Tra questi, un protocollo per generare forme di cellule 3D, un protocollo per monitorare resti divisione cellulare, e un protocollo per descrivere quantitativamente le dinamiche actomyosin corticali. Il nematode C. elegans è usato come un caso esemplare, tuttavia, i metodi e gli strumenti qui descritti adatti per una serie di domande in altri modelli biologici, per esempio, cellule coltivate, espianti di tessuto, organoidi o sferoidi, altri embrioni, etc.

In generale, alcune delle analisi indicati qui possono essere eseguite anche con il popolare strumento di ImageJ open source (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html; o FIJI, le "batterie incluse 'versione di ImageJ, http://fiji.sc/Fiji) per i quali sono disponibili molti plugin per diversi analisi quantitative. Tuttavia, i programmi qui discussi sono progettati per affrontare i problemi specifici.

In primo luogo, MDI, l'elaborazione delle immagini, la modellazione e le suite display può essere utilizzato per le ricostruzioni 3D di sezioni seriali di elettrone o microscopia ottica 15. IMOD contiene anche strumenti per la visualizzazione dei dati 3D da qualsiasi orientamento. In secondo luogo, Endrov, un programma Java progettato per eseguire l'analisi delle immagini, l'elaborazione dei dati, e l'annotazione di reti o brani (tra gli altri), sulla base di una architettura a plugin esteso, con ImageJ compatibilità plug-16. Esso contiene più di 140 operazioni di elaborazione delle immagini e un'interfaccia utente estendibile, in cui il modello ei dati grezzi vengono visualizzati separatamente. Il suo codice sorgente può essere trovato alla https://github.com/mahogny/Endrov. In terzo luogo, PIVlab, un MStrumento Atlab per particella digitale immagine velocimetria, che permette all'utente di analizzare quantitativamente e qualitativamente i campi di flusso di particelle 17. L'utilizzo di questo programma richiede una licenza MATLAB che include l'Image Processing Toolbox (http://mathworks.com). PIVlab è un programma progettato per descrivere quantitativamente il flusso. Calcola la distribuzione di velocità, ampiezza, vorticità, divergenza, o tranciare in coppie di immagini o serie. Per questo, cross-correla piccole aree di immagini (chiamati 'pass' nella sezione protocollo) di una coppia di immagini per ricavare lo spostamento delle particelle più probabile. Questa correlazione incrociata produce una matrice di correlazione che può essere analizzato nel dominio spaziale o la frequenza utilizzando cross-correlazione diretta o una trasformazione rapida di Fourier (FFT), rispettivamente.

L'apparecchiatura utilizzata è un microscopio rovesciato dotato di Nipkow ('spinning') del disco, un EMCCD, 488 e 561 nm solido-serielaser a stato, e 20x o 40x o aria 60x piano / apochromat obiettivi di petrolio o di acqua-immersion. Tuttavia, è anche possibile effettuare l'imaging time-lapse con altre modalità di imaging, ad esempio, point, LINE o laser-based microscopia foglio di scansione, microscopia multi-fotoni, così come la microscopia fluorescenza combinata con deconvoluzione o strutturato illuminazione. Il vantaggio di utilizzare un sistema a disco Nipkow è l'acquisizione immagine estremamente veloce, specialmente se una modalità di streaming (movimento continuo e scansione dell'oggetto nella dimensione z) è disponibile. Inoltre, per migliorare la risoluzione, un ingrandimento di 1,5 volte extender davanti alla EMCCD può essere utilizzato.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. Preparazione di C. elegans embrioni per time-lapse Microscopia utilizzando microsfere

  1. Trasferire vermi adulti gravide utilizzando un pick verme (filo di platino) in una goccia di tampone M9 e pulire i batteri prima vigorosamente agitando e poi trasferire ogni verme a un calo adiacente di M9 utilizzando una sferza occhio montato su un dente di prelievo / puntale o utilizzare un capillare di vetro appuntito.
  2. Diluire la dispersione contenente 20 micron perline diametro polistirene 10 volte in tampone M9 (1 tampone L M9 contiene 3 g KH 2 PO 4, 6 g di Na 2 HPO 4, 5 g di NaCl, e, dopo autoclavaggio (20 min, 120 ° C), aggiungere un ulteriore 1 ml di una soluzione di 4 1 M MgSO).
  3. Effettuare una pipetta a bocca da qualsiasi tipo di sottile capillare di vetro (ad esempio, la fusione capillari puntiformi o capillari utilizzati per tirare aghi per iniezione), a circa 0,5 m di lunghezza pezzo di gomma, silicone o materiale simile tubo (meglio se trasparente), a 200 microlitripuntale, il coperchio di un tubo 200 microlitri PCR, un filtro idrofobico per piccole siringhe (ad es., un 0,2-0,45 micron dimensione dei pori e 15-50 mm di diametro nylon, PTFE o materiale simile filtro) punta, e una pipetta 1.000 ml . Questo tipo di bocca pipetta assicura che nessun materiale biologico può entrare in contatto con lo sperimentatore.
  4. Assemblare la pipetta inserendo la punta della pipetta 200 microlitri con la punta prima nel tubo e collegarlo con il coperchio di un tubo di PCR che ha una foratura centrale che corrisponde al diametro del capillare utilizzato. Un ago punteruolo o preparazione molto rilevato può essere utilizzato per generare la perforazione.
  5. Disegnare una capillare sottile e inserirla nella perforazione. Inserire il filtro nell'altra estremità del tubo e inserire 1000 microlitri pipetta punta come boccaglio (Figura 1).
  6. Sezionare adulti gravido tagliando vermi trasversalmente alla vulva con una lama di rasoio pulita o bisturi.
    NOTA: In genere, molti embrioni saranno postaxpulsed dopo il taglio. Tuttavia, se sono necessarie primi embrioni, a volte devono essere rilasciate dalla carcassa con un occhio sferza o un ago appuntito.
  7. Pipettare una goccia della dispersione diluita in polistirolo (~ 4 microlitri) su un vetro di copertura 24x60 mm e di trasferimento embrioni in questo calo usando la pipetta bocca.
  8. Posizionare con cura un piccolo (ad esempio, 18x18 o 20x20 mm) copertura di vetro sulla parte superiore della goccia e assicurarsi che il calo si è completamente estesa.
    NOTA: Il calo dovrebbe essere abbastanza piccolo da non toccare i bordi del piccolo vetro di copertura.
  9. Sigillare il monte con vaselina liquefatto. Aggiungere una goccia di olio di immersione in copertina mm 24x60 lato antiscivolo e passare alla sezione 'Time-lapse Microscopia'.

2. Preparazione di adulti C. elegans animali per time-lapse Microscopia utilizzando Nanobeads

NOTA: In generale, il protocollo per il montaggio animali adulti è un adattamento del protocollo da rif. 18.Con questo protocollo, è possibile effettuare lungo termine microscopia time-lapse confocale di animali adulti.

  1. Preparare un 1,5% (w / v) di agarosio in tampone M9, bollire (1 min, 100 ° C a bagnomaria o microonde). L'uso di elevate concentrazioni di agarosio non è raccomandato poiché questo può portare a estrusione del intestino e / o parti di gonade.
  2. Stick giù 2-3 strati di nastro su due vetrini da microscopio ciascuno. Posizionare un vetrino senza nastro tra le due diapositive con nastro adesivo.
  3. Utilizzare un puntale e mettere una goccia della soluzione di agarosio caldo al centro della slitta centrale. Introdurre rapidamente un'altra vetrino sul goccia così che sia supportato dagli strati di nastro su ogni lato. Questo creerà un giro e pad agar piatta di circa 10 mm di diametro.
  4. Mettere una goccia di soluzione di 100 nm tallone (non diluito, che è 2,6% (w / v)) sul pad. Trasferimento 1-10 vermi adulti puliti nel menu a tendina con un pick verme. Sigillare con 18x18 millimetri di vetro di copertura e di vaselina come spiegato in ProtOcol 1.

3. microscopia time-lapse

  1. Mettere una goccia di olio di immersione sul vetrino da microscopio o il panino vetro di copertura. Utilizzare campo chiaro a basso ingrandimento (5x o 10x lenti) per individuare il campione.
    NOTA: limitare l'esposizione alla luce blu il più possibile (in particolare per C. elegans embrioni), ad esempio, non utilizzare la microscopia fluorescenza per trovare / focalizzare il provino ma utilizzare campo chiaro invece.
  2. Passare alla maggiore ingrandimento (40x o 60x obiettivi), portare il campione a fuoco (o piano centrale o superiore / inferiore piani del campione, a seconda del software di acquisizione).
  3. Impostare gli intervalli di campionamento a 30 aerei a 1 micron spaziatura registrato ogni 1min. Nel caso in cui un xy o xyz stadi automatica è disponibile, più punti possono essere registrati in un'unica sessione. Passare a imaging di fluorescenza e controllare di nuovo la messa a fuoco.
    NOTA: cercare di evitare l'uso di poteri alta del laser, piuttosto utilizzare tempi di esposizione leggermente più lungoa bassissime intensità. Misura immagini acquisite subito, sia nel programma di acquisizione immagini o in ImageJ per evitare la saturazione, che colture variano le dinamiche e significa anche un'eccessiva esposizione alle radiazioni.
  4. Avviare la registrazione della serie time-lapse.
    NOTA: Per escludere l'analisi artefatti, iniziare con lunghi intervalli (3-10 min) tempo tra la scansione del campione e aumentare gradualmente campionamento temporale agli intervalli desiderati. Tempi di sviluppo così come i punti finali in entrambi i casi dovrebbero essere simili quando si effettua una analisi statistica. Inoltre, è spesso necessario valutare i tassi di sopravvivenza e fototossicità. Pertanto, recuperare campione dal monte dopo-lungo termine microscopia time-lapse e controllare se continuano a sviluppare / live.

4. Ricostruire un modello delle cellule di figura 3D con IMOD

NOTA: Il software IMOD è disponibile dalla pagina web IMOD: http://bio3d.colorado.edu/imod/. L'installazione del software è descrittod lì. Quando si utilizza il sistema operativo Windows, un toolkit Unix deve essere installata, che può anche essere trovato come un pacchetto sul sito IMOD. Inoltre, vi è un'introduzione 3dmod ottimamente compilato disponibili sulla pagina web IMOD (http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html).

  1. Aprire la shell Unix e digitare "imod". La finestra MDI si aprirà. Selezionare il file con i dati grezzi (idealmente un tif impilati o simili) da cui generare un modello 3D.
  2. Individuare la parte inferiore e superiore degli oggetti nella finestra zap utilizzando la finestra delle informazioni (su e giù strumento scorrimento).
  3. Avviare l'analisi i contorni delle cellule. È importante sottolineare che, in modo che ogni cella è un oggetto. Inizia con il piano superiore di ogni cella e creare il primo contorno si utilizza la finestra delle informazioni. Scorrere verso il basso in z e creare un nuovo profilo per ogni piano z.
  4. Fare lo stesso per tutte le celle come necessario per modellare in 3D. Non dimenticare di creare un nuovo oggetto quando si inizia con una nuova cellula.
    NOTA: Ci sono molti modi diversi per contorno tracciamento e diversi plugin utile. Si prega di visitare la pagina web IMOD e tutorial online per i dettagli. Nel caso qui illustrato, è stata usata l'impostazione predefinita.
  5. Aprire la finestra "Modello View" per ispezionare gli oggetti e le loro contorni.
  6. Nella barra degli strumenti "Model View" scegliere "Modifica" - "Oggetti". La rispettiva finestra di modifica si aprirà.
  7. Per modellare cellule come oggetti pieni e chiusi, scegliere "Mesh" come "Draw tipo di dati" e "Fill" come "stile di disegno". Clicca su "mesh" nella selezione scorrimento in basso a sinistra della finestra. Controllare l'opzione "Cap" nella selezione in basso a destra. Controllare il numero di oggetti come necessario e fare clic su "Mesh All". Il programma genererà oggetti solidi dalle pile di contorni. Il fattore-z campionamento può essere regolata cambiando "Z-scale" nella finestra "View".
  8. Sposta / ruotare l'obiet 3Dt ("Edit" - "Vista") e salvare le istantanee o filmati ("File" - "Snap Tiff con nome ..." o "Movie / Montaggio").

5. Monitoraggio fluorescente Strutture etichettati con Endrov

NOTA: Al fine di tenere traccia di resti divisione cellulare, utilizzare un ceppo con un pennarello membrana nucleare o al plasma per l'identificazione delle cellule (ad esempio, H2B, PH-PLC-d1) e una divisione cellulare marcatore residuo (ad esempio, NMY-2, ZEN-4 ). Il marcatore membrana nucleare o del plasma è importante per determinare quale cella eredita il rimanente divisione cellulare.

  1. Per caricamento veloce e facilità d'uso, i dati grezzi deve essere convertito in un file TIFF (ad esempio, in ImageJ). Avanti, aperto Endrov e caricare il file da analizzare, scegliendo l'opzione "Carica file" dal menu file. Fare clic sull'icona "Visualizzatore 2D" nella barra degli strumenti.
  2. Regolare l'istogramma facendo clic sull'icona "gamma Fit" (l'icona blu nell'angolo in basso a destradello schermo Endrov). Impostare la XYZ risoluzione andando su "dati" - "nomefile" - "ImageSet" - "Canale" - "Set XYZ-risoluzione". Digitare valori X, Y, e Z, per esempio, 5, 5, 1 se la risoluzione X e Y è di 0.2 micron e campionare ogni 1 micron di Z.
  3. Per annotare i nuclei, passare al piano di interesse e cliccare su "visore 2D". Selezionare "Lineage" dal menu a discesa e scegliere "Nuovo stirpe".
  4. Cliccando e trascinando sul nucleo, può essere marcato. Per assegnare un nome al nucleo, fare clic destro e scegliere "Rinomina particella" dal menu a discesa. Per aumentare o diminuire il diametro del cerchio, trascinare la freccia che appare sulla sinistra del cerchio marcato. Per celebrare il piano centrale del nucleo, fare clic sull'icona a destra. Quando si utilizza un marcatore membrana plasmatica, una grande sfera può trarre che coprirà la maggior parte della cellula.
  5. Per continuare nel tempo e piano, scegliere il "Frame" e "Z"i pasti presso la barra degli strumenti in basso. Dopo essere andato al successivo punto di tempo, regolare la posizione o la dimensione del cerchio che segna il nucleo di conseguenza. Ripetere questa operazione fino a quando la cellula si divide cingolati.
  6. Quando c'è una divisione cellulare, segnare i nuclei figli e passare a "spettatore Lineage". Questo può essere selezionata facendo clic sull'icona "Windows" sulla barra degli strumenti superiore. Segna tutti e tre i nuclei contemporaneamente, passare all'opzione "Lineage" nella barra degli strumenti in alto e selezionare "genitore Associate".
  7. Quando il monitoraggio delle cellule è terminata, passare alla marcatura il resto della divisione cellulare per il monitoraggio dei canali. Per cambiare canale, fare clic sul nome del file nell'angolo in basso a sinistra della barra degli strumenti. Il residuo divisione cellulare (o qualsiasi altra struttura) possono essere monitorati come descritto sopra per il nucleo.
  8. Quando si ritorna al software dopo la chiusura, è necessario andare a "2D Viewer" - "Lineage" - "Modifica" e cliccare sul numero di stirpe che verrà modificato.

6. Analizzando corticale actomiosina flusso con PIVlab

NOTA: PIVlab è un software disponibile gratuitamente da: http://pivlab.blogspot.de/; esso può essere richiamato all'interno dell'ambiente riga di comando Matlab digitando PIVlab_GUI. Quando si lavora con PIVlab, si raccomanda di salvare la serie di immagini in una cartella separata.

  1. Avviare una nuova sessione dal menu "File". Caricare i file di immagine, fare clic sul pulsante "Carica immagini".
  2. Selezionare lo stile sequenza 1-2, 2-3, ... e passare alla directory che contiene la sequenza delle immagini desiderate. Selezionare le immagini e fare clic sul pulsante "Aggiungi" e di importazione.
  3. Vai su "Impostazioni" Analisi e selezionare "Esclusioni (ROI, Maschera)". In alternativa, premere il tasto "Ctrl + E". Utilizzare il pulsante "Disegna maschera (s) per fotogramma corrente" per disattivare la parte indesiderata delle immagini / s (cioè, al di fuori dell'area embrione).
  4. Selezionare "Impostazioni PIV" from il menu "Impostazioni Analisi". In alternativa, premere il tasto "Ctrl + S". Scegliere "finestra deformazione FFT", come l'algoritmo di PIV desiderato.
    NOTA: trasformazione rapida di Fourier (FFT) riduce il costo computazionale ma è consigliata solo il segnale è ben al di sopra del rumore e se lo spostamento delle particelle studiati non supera la metà della superficie passaggio analizzato (vedi 6.5).
  5. Inserire i seguenti valori per le tre passaggi, che sono la zona di interrogazione per incrociata intensità correlazione tra immagini successive: Passo 1: interrogazione un'area di 64 pixel con un passo di 32. Passo 2: interrogazione superficie di 32 pixel con un passo di 16 . Selezionare "lineare" dalla deformazione finestra menu a discesa. Scegli il metodo 2 * 3 punti di Gauss per lo spostamento stima sub-pixel.
  6. Selezionare "Analyze!" dal menu Analysis e utilizzare il pulsante "Analizza tutti i frame" per iniziare un'analisi.
  7. Per la post-elaborazione selezionare "convalida Vector" da "; Menù post trattamento "e impostare la deviazione standard (Stdev) Soglia di filtro a 7 e si applicano a tutti i fotogrammi.
  8. Scegliere "Derivare parametri / modificare i dati" dal menu "Plot". Selezionare "vettori [px / telaio]" dal menu a discesa. Regolare la scorrevolezza dei vettori e filtro passa alto e si applicano a tutti i fotogrammi.
  9. Per calcolare i vettori medi di tutti i fotogrammi, impostare i "fotogrammi usati" a 1: fine e fare clic sul pulsante "Calcola i vettori medi".

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Utilizzando i protocolli 2, 3, e 4, time-lapse di imaging di gonadi a selvaggio tipo C. elegans adulti viene eseguita (ceppo OD58 (unc-119 (ED3) III; ltIs38 [pAA1, pie-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + unc-119 (+)]), che esprime un marcatore di membrana da un promotore della linea germinale ). Concentrandosi sulla volta della gonade, un modello 3D delle cellule germinali è generato dai dati microscopia (Figura 2). Questo modello permette di analizzare variazioni di dimensione della cella, mentre il...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Attraverso oggetto inseguimento in sviluppo, in particolare inseguimento nucleare, è stato possibile per chiarire i meccanismi centrali di patterning C. elegans embriogenesi 1,23,24. Espansione questa strategia per un throughput più elevato, è stato recentemente possibile scoprire regole patterning complementari e di proporre un metodo come dedurre patterning regole de novo 10. Per molti mutanti, tuttavia, l'esatto difetto patterning sono ancora sconosciute. I metodi qui descr...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

La ricerca nel laboratorio di CP è finanziata dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (EXC 115; FOR 1756) e il cluster di ricerca LOEWE Ubiquitin Networks. CP è inoltre supportato dal Programma Quadro 7 dell'Unione Europea (Progetto Azioni Marie Curie 326632).

Ringraziamenti

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
StereomicroscopioMotic/VWROT4005SStereomicroscopio per la dissezione e il montaggio
di microsfere di polistirene Polybeads, Polysciences18329Montaggio embrionale
20 &; micro; m
Microsfere di polistirene Polybead, Polysciences876Montaggio animale adulto
0.1 µ m
Vetrini per microscopioVWR631-0902Montaggio su animale adulto
Vetro di copertura 18x18 mmVWR631-1331Montaggio su embrione/adulto
Vetro di copertura 24x60 mmVWR631-1339Montaggio su embrione
BisturiVWR233-5455Dissezione di embrioni
Tubo in siliconeVWR228-1501Tubo per pipetta orale
Filtro a membrana in PTFE da 30 mmNeoLabJul-01Filtro per pipetta orale
Tubi capillariVWR621-0003Puntale per pipetta orale
VaselinaRothE746.1Montaggio embrione/adulto
AgarRoth5210.5Montaggio animale adulto
Potassio-di-idrogenofosfatoRothP018.2Tampone M9
Di-sodio-idrogenofosfatoRothP030.2Tampone M9
Cloruro di sodioRoth3957.1Tampone
M9 VisiScope Disco rotante Sistema confocaleVisitron Systemsn/aMicroscopia confocale

Riferimenti

  1. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).
  2. Kimmel, C. B., Warga, R. M. Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish. Science. 231 (4736), 365-368 (1986).
  3. Nishida, H. Cell lineage analysis in ascidian embryos by intracellular injection of a tracer enzyme. III. Up to the tissue restricted stage. Dev. Biol. 121 (2), 526-541 (1987).
  4. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
  5. Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  6. Fernandez, R., Das, P., Mirabet, V., Moscardi, E., Traas, J., Verdeil, J. L., Malandain, G., Godin, C. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. 7 (7), 547-553 (2010).
  7. Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
  8. Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
  9. Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat. Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
  10. Du, Z., Santella, A., He, F., Tiongson, M., Bao, Z. De novo inference of systems-level mechanistic models of development from live-imaging-based phenotype analysis. Cell. 156 (1-2), 359-372 (2014).
  11. Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11 (9), 951-958 (2014).
  12. He, B., Doubrovinski, K., Polyakov, O., Wieschaus, E. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508 (7496), 392-396 (2014).
  13. Singh, D., Pohl, C. Coupling of rotational cortical flow, asymmetric midbody positioning, and spindle rotation mediates dorsoventral axis formation in C. elegans. Dev. Cell. 28 (3), 253-267 (2014).
  14. Singh, D., Pohl, C. A function for the midbody remnant in embryonic patterning. Commun. Integr. Biol. 7, e28533(2014).
  15. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
  16. Henriksson, J., Hench, J., Tong, Y. G., Johansson, A., Johansson, D., Bürglin, T. R. Endrov: an integrated platform for image analysis. Nat. Methods. 10 (6), 454-456 (2013).
  17. Thielicke, W., Stamhuis, E. J. PIVlab - Towards User-friendly, Affordable and Accurate Digital Particle Image Velocimetry in MATLAB. Journal of Open Research Software. 2 (1), e30(2014).
  18. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), e53419(2013).
  19. Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
  20. Schonegg, S., Constantinescu, A. T., Hoege, C., Hyman, A. A. The Rho GTPase-activating proteins RGA-3 and RGA-4 are required to set the initial size of PAR domains in Caenorhabditis elegans one-cell embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (38), 14976-14981 (2007).
  21. Schmutz, C., Stevens, J., Spang, A. Functions of the novel RhoGAP proteins RGA-3 and RGA-4 in the germ line and in the early embryo of C. elegans. Development. 134 (19), 3495-3505 (2007).
  22. Naganathan, S. R., Fürthauer, S., Nishikawa, M., Jülicher, F., Grill, S. W. Active torque generation by the actomyosin cell cortex drives left-right symmetry breaking. Elife. 3, e04165(2014).
  23. Kaletta, T., Schnabel, H., Schnabel, R. Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans. Nature. 390 (6657), 294-298 (1997).
  24. Schnabel, R., et al. Global cell sorting in the C. elegans embryo defines a new mechanism for pattern formation. Dev. Biol. 294 (2), 418-431 (2006).
  25. Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree. Nat. Protoc. 1 (3), 1468-1476 (2006).
  26. Giurumescu, C. A., et al. Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos. Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).
  27. Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans. Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).
  28. Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification. Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Biologia dello sviluppo di C elegansMicroscopia time lapseSoftware open sourceModellazione 3D della forma cellulareTracciamento fluorescenteVelocimetria laser Doppler per immaginiFlusso contrattile corticaleTracciamento della linea cellulareTracciamento del flusso vescicolareAnalisi quantitativa delle immagini
Monitoraggio e quantificazione processi di sviluppo in
Contattaci
Raccomanda alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.