Monitoraggio e quantificazione processi di sviluppo in C. elegans Utilizzo strumenti open-source

Summary

Qui viene mostrato come tracciare e quantificare i processi di sviluppo in C. elegans. I metodi presentati si basano su strumenti open source che possono essere facilmente implementati. Viene dimostrato come ricostruire modelli 3D di forma cellulare, come tracciare manualmente le strutture subcellulari e come analizzare il flusso contrattile corticale.

Abstract

Quantitativamente cattura processi di sviluppo è fondamentale per ricavare modelli meccanicistici e la chiave per identificare e descrivere fenotipi mutanti. Qui protocolli sono presentati per la preparazione di embrioni e adulti C. elegans animali per breve e lungo termine microscopia time-lapse e metodi per il monitoraggio e la quantificazione dei processi di sviluppo. I metodi presentati sono tutti basati su C. ceppi disponibili nel Caenorhabditis Genetics Center e sul software open-source elegans che possono essere facilmente implementate in qualsiasi laboratorio indipendentemente dal sistema di microscopia utilizzato. Una ricostruzione di un modello cellulare-forma 3D utilizzando il IMOD software di modellazione, il monitoraggio manuale delle strutture subcellulari fluorescenza marcata con il programma di analisi di immagine multi-purpose Endrov, e un'analisi dei flussi contrattile corticale mediante PIVlab (-Time Risolto Image Velocimetry Particle digitale sono mostrati strumento per MATLAB). Si è discusso di come questi metodi possono anche essere distribuiti to quantitativamente catturare altri processi di sviluppo in diversi modelli, per esempio, di monitoraggio delle cellule e lineage tracing, il monitoraggio del flusso di vescicole.

Introduction

Con i miglioramenti costanti di proteine ​​fluorescenti, ingegneria del genoma, la microscopia ottica, e software e all'hardware, è ora possibile registrare sviluppo di molti organismi modello a risoluzione senza precedenti spazio-temporale. Questo permette ai ricercatori di fare domande che non possono essere affrontate in precedenza o per rivisitare i processi di sviluppo noti per la ricerca di aspetti trascurati. Questo progresso ha scatenato campo della biologia dello sviluppo quantitativo, che mira a trasformare qualitativi, modelli informali in modelli quantitativi da misurazioni approfondite e analisi statistiche.

Tracking cell....

Protocol

1. Preparazione di C. elegans embrioni per time-lapse Microscopia utilizzando microsfere

1. Trasferire vermi adulti gravide utilizzando un pick verme (filo di platino) in una goccia di tampone M9 e pulire i batteri prima vigorosamente agitando e poi trasferire ogni verme a un calo adiacente di M9 utilizzando una sferza occhio montato su un dente di prelievo / puntale o utilizzare un capillare di vetro appuntito.
2. Diluire la dispersione contenente 20 micron perline diametro polistirene 10 volte in tampone M9 (1 tampone L M9 contiene 3 g KH ₂ PO _4, 6 g di Na ₂ HPO _4, 5 g di NaCl, e, dopo autoclavaggi....

Results

Utilizzando i protocolli 2, 3, e 4, time-lapse di imaging di gonadi a selvaggio tipo C. elegans adulti viene eseguita (ceppo OD58 (unc-119 (ED3) III; ltIs38 [pAA1, pie-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + unc-119 (+)]), che esprime un marcatore di membrana da un promotore della linea germinale ). Concentrandosi sulla volta della gonade, un modello 3D delle cellule germinali è generato dai dati microscopia (Figura 2). Questo modello permette di analizzare variazioni di dimensione della cella, mentre il.......

Discussion

Attraverso oggetto inseguimento in sviluppo, in particolare inseguimento nucleare, è stato possibile per chiarire i meccanismi centrali di patterning C. elegans embriogenesi ^1,23,24. Espansione questa strategia per un throughput più elevato, è stato recentemente possibile scoprire regole patterning complementari e di proporre un metodo come dedurre patterning regole de novo ^10. Per molti mutanti, tuttavia, l'esatto difetto patterning sono ancora sconosciute. I metodi qui descr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscopio	Motic/VWR	OT4005S	Stereomicroscopio per la dissezione e il montaggio
di microsfere di polistirene Polybeads,	Polysciences	18329	Montaggio embrionale
20 &; micro; m
Microsfere di polistirene Polybead,	Polysciences	876	Montaggio animale adulto
0.1 µ m
Vetrini per microscopio	VWR	631-0902	Montaggio su animale adulto
Vetro di copertura 18x18 mm	VWR	631-1331	Montaggio su embrione/adulto
Vetro di copertura 24x60 mm	VWR	631-1339	Montaggio su embrione
Bisturi	VWR	233-5455	Dissezione di embrioni
Tubo in silicone	VWR	228-1501	Tubo per pipetta orale
Filtro a membrana in PTFE da 30 mm	NeoLab	Jul-01	Filtro per pipetta orale
Tubi capillari	VWR	621-0003	Puntale per pipetta orale
Vaselina	Roth	E746.1	Montaggio embrione/adulto
Agar	Roth	5210.5	Montaggio animale adulto
Potassio-di-idrogenofosfato	Roth	P018.2	Tampone M9
Di-sodio-idrogenofosfato	Roth	P030.2	Tampone M9
Cloruro di sodio	Roth	3957.1	Tampone
M9 VisiScope Disco rotante Sistema confocale	Visitron Systems	n/a	Microscopia confocale