Articolo metodologico

Milk Collection nella Rat Utilizzando tubi capillari e stima di tenore di materia grassa per Creamatocrit

DOI:

10.3791/53476

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16 dicembre 2015

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Cumming School of Medicine, University of Calgary, 2Faculty of Kinesiology, University of Calgary

In questo articolo

Sommario

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Il latte è una fonte primaria di nutrimento per il neonato. L'analisi dei componenti del latte può fornire informazioni sui fattori materni che influenzano la salute della prole. Questo protocollo descrive un metodo manuale per raccogliere campioni di latte dal ratto in allattamento, che possono quindi essere utilizzati per ulteriori analisi a valle.

Abstract

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Il latte, come unica fonte di nutrimento per il mammifero appena nato, fornisce i nutrienti e l'energia necessari per la crescita e lo sviluppo della prole. Contiene anche un vasto numero di composti bioattivi che influenzano notevolmente lo sviluppo del neonato. L'analisi dei componenti del latte aiuterà a chiarire i fattori chiave che collegano il metabolismo e la salute materna con la crescita e lo sviluppo della prole. Il ratto da laboratorio rappresenta un popolare organismo modello per gli studi materni e il latte di ratto può essere utilizzato per esaminare l'effetto di vari interventi fisiologici, nutrizionali e farmacologici materni sui componenti del latte, che possono quindi avere un impatto sulla salute della prole. Qui viene descritto un semplice metodo di raccolta manuale del latte dal ratto in lattazione, che può essere eseguito da un singolo investigatore, non richiede attrezzature specializzate per il vuoto o l'aspirazione e fornisce latte sufficiente per la successiva analisi a valle. Viene inoltre presentato un metodo per stimare il contenuto di grassi del latte misurando la percentuale di panna all'interno del campione di latte, noto come creamatocrito. Questi metodi possono essere utilizzati per aumentare la comprensione della salute materno-infantile e per chiarire i fattori materni che sono coinvolti nella corretta crescita e sviluppo della prole.

Introduzione

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Il latte è l'unica fonte di nutrimento per i mammiferi neonati, fornendo energia e nutrienti per la crescita infantile e lo sviluppo 1,2. Mentre il latte è composto principalmente da cellule, lipidi e proteine ​​1, contiene anche una pletora di composti bioattivi che modulano lo sviluppo primi anni di vita della prole compresi gli enzimi, carboidrati, ormoni, anticorpi, fattori di crescita, citochine, esosomi, microvescicole, e piccoli RNA tali come microRNA 1,2. Il ruolo fondamentale del latte materno nello stabilimento della prole immunitario e la salute intestinale 3, insieme con la prova che allattati al seno i neonati sono meno suscettibili alle malattie 2, sottolinea l'importanza di identificare i componenti del latte associati ai processi di malattia nella prima infanzia ed i meccanismi molecolari coinvolti nelle loro azioni. Il ratto di sviluppo è un modello popolare per studiare l'effetto di vari nutrizionale, fisiologico, e interventi chimici sulle precocesviluppo -life 4. L'analisi del latte di ratto può quindi fornire romanzo spaccato la salute materna e prole.

Progressi scientifici attuali forniscono ora aumentare le opportunità per le approfondite indagini sugli effetti di specifici componenti del latte sulla salute e la malattia. Ad esempio, il sequenziamento di latte profili batterici ha chiarito il loro ruolo nella prima colonizzazione intestinale dell'intestino infantile 5, analisi di spettrometria di massa di oligosaccaridi del latte hanno fornito spaccato l'alterazione dei profili latte oligosaccaridi via dieta materna 6, e sequenziamento profondo di microRNA secreto in i globuli di grasso del latte materno evidenzia possibili ruoli nella trascrizione genica, il metabolismo, e la funzione immunitaria 7.

Modelli di ratto rappresentano uno dei più popolari organismi modello usati in studi materni 8,9. Un vantaggio è la loro gestazione e allattamento periodi brevi, che durano solo approximately 21 giorni ciascuno; il tempo totale dall'inizio della gravidanza per allattamento rappresenta un breve periodo di tempo in cui i dati importanti possono essere generati. Le maggiori dimensioni dei ratti rispetto ai topi, nel contesto di raccolta del latte, può fornire un vantaggio significativo rispetto al volume di latte e facilità di raccolta del latte; produzione di latte nel topo, per esempio, sembra essere dipende dal peso corporeo totale con topi pesanti producono più latte 10.

Qui, è fornita una descrizione generale per la raccolta manuale del latte di ratti che allattano. Questo protocollo richiede attrezzatura minima, non è invasiva, poco costoso, e può essere utilizzato per raccogliere adeguati volumi di latte per ulteriori analisi a valle. In breve, la diga è anestetizzato con isoflurano, latte letdown è stimolata da ossitocina, e latte viene raccolto in provette capillari tramite spremitura manuale del latte. Infine, come due componenti principali di latte sono grassi e proteine, una breve description di stimare latte tenore di materia grassa utilizzando misurazioni creamatocrit 11 e la quantificazione della concentrazione proteica totale usando un test standard di proteine ​​è presentato.

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Protocollo

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Questo protocollo è stato approvato dalla University of Calgary Comitato cura degli animali e conforme alla Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

1. Diga separato da Offspring

  1. Separare la diga dalla sua prole per un minimo di 5 minuti prima mungitura 12.
    NOTA: La diga può essere munta fino a 5-6 ore dopo la separazione 1,6,13, ma periodi di separazione più lunghi di 4 ore possono alterare la composizione del latte 14. Mentre tempo di separazione non sembra impattare latte volume di raccolta 12, è consigliabile che un tempo di separazione coerente essere mantenuta per tutto lo studio. Composizione del latte può cambiare tutta la lattazione 15, quindi i tentativi dovrebbe essere fatto per mantenere il giorno di raccolta del latte coerente. La produzione massima di latte si consiglia di verificare in lattazione giorno 14 12.
  2. Usando una camera di riscaldamento, verificare i cuccioli sono in grado di mantenere la corretta tempera corpori senza la presenza della madre per la durata della procedura di mungitura.
    NOTA: Nello studio presentato di seguito, la mungitura è stata eseguita allo svezzamento, quando le dighe erano circa 22 settimane di età e le prole 21 giorni di età, quindi nessuna camera di riscaldamento è stato utilizzato.

2. Set-up e preparazione

  1. Raccogliere tutti i materiali necessari per la procedura di mungitura.
    NOTA: Tutti i materiali possono essere trovati nella tabella materiali ed apparecchiature.
  2. Posizionare una piastra elettrica sulla panca dove la mungitura avrà luogo e coprire il pad con un banco assorbenti sotto-pad.
  3. Impostare il sistema anestetico. Assicurarsi che il sistema ha ossigeno e isoflurano prima dell'inizio sufficiente. Fissare la maschera anestetico che verrà utilizzato per l'induzione di anestesia iniziale alla macchina. Posizionare la maschera che verrà utilizzata per l'anestesia di mantenimento vicino se diversa dalla maschera anestetico iniziale.
  4. Collegare un ago da 25 G per una siringa da 1 ml per ossitocinainiezione con tecnica asettica.
  5. Accendere il rilievo di riscaldamento in modo che la temperatura del corpo della madre è mantenuta durante la procedura di mungitura. NOTA: Monitorare la temperatura della piastra elettrica per assicurare il pad non diventi troppo calda e causare ustioni. In alternativa, utilizzare una fonte di calore, ad esempio un tavolo operatorio riscaldato, che può essere impostato ad una temperatura specifica.

3. Anestetizzare la diga di Utilizzo Isoflurane

  1. Aprire il serbatoio di ossigeno e ruotare il flusso a 1 L (1.000 cc) per min. Accendere il flusso di isoflurano e impostare al 5%. ATTENZIONE: Evitare l'inalazione diretta di anestetico e prevenire l'accumulo di vapori anestetici.
  2. Anestetizzare la diga.
  3. Passare alla maschera di manutenzione, se necessario, ponendo la supina diga sul tampone assorbente panca. Confermare anestesia dalla mancanza di pedale reflex.
  4. Ridurre il flusso di isoflurano al 2-3% per il mantenimento dell'anestesia. Monitorare continuamente diga durante tutta la procedura per garantire la depressione di respirazione non si verifica. NOTA: Una volta sotto anestesia, gli occhi della diga devono essere protetti con un lubrificante occhio sterile per evitare che gli occhi si secchi o di diventare graffiato.

4. L'ossitocina Iniezione

  1. Assicurarsi che il ossitocina (20 USP Unità / ml) non ha superato la data di scadenza. Disinfettare la fiala di ossitocina con un alcool sterile wipe / alcol detergente pad.
  2. Utilizzando una tecnica asettica, elaborare 2 UI (0,1 ml) di ossitocina nella siringa. Usare un nuovo ago e la siringa per ogni diga che verranno munte.
    NOTA: L'ossitocina dosi variano generalmente da singole iniezioni di 1-5 UI 1,6,12,16. In alternativa, una dose di 4 UI / kg di peso corporeo può essere utilizzato 12. Una singola dose di 2 UI può essere ripetuta una volta se si incontra difficoltà di mungitura.
  3. Iniettare l'ossitocina per via intraperitoneale. Inserire l'ago nel quadrante in basso a destra dell'addome con l'ago rivolto verso la testa, con un angolodi 15-30 °, circa 0,5 cm di profondità.
  4. Tirare indietro lo stantuffo per garantire pressione negativa prima dell'iniezione. Se il liquido (sangue, urine, contenuto intestinale, ecc) è aspirato nella siringa, estragga l'ago e tentare l'iniezione con un nuovo ago e la siringa. Se nessun fluido viene aspirato iniettare l'ossitocina e scartare il ago e la siringa immediatamente in un contenitore a rischio biologico.
  5. Attendere circa 5-15 min per il ossitocina per stimolare il latte delusione.

5. Preparazione di siti mungitura

  1. Scegli i siti / mammelle da cui verrà raccolto il latte. Il latte può essere raccolto da ogni capezzolo 12.
  2. Rimuovere delicatamente il pelo intorno ai capezzoli da mungere con i trimmer, come la pelliccia può causare difficoltà nella raccolta dei campioni a causa dell'umidità del latte. Essere gentile - la pelle intorno i capezzoli è estremamente sensibile e può essere secco e come tale è soggetta a graffi e rotture.
  3. Sterilizzazione della tettarella iNon s necessario, ma opzionalmente, pulire il capezzolo con acqua tiepida dopo il pelo viene rimosso. Preparare almeno due siti come più di un sito può essere richiesta per la raccolta del latte.
    NOTA: Se l'analisi del latte comprende profiling microbica, la zona del capezzolo può richiedere la sterilizzazione con iodio 5.

6. Latte Collection

  1. Premere delicatamente la base del capezzolo, espellendo manualmente il latte per la raccolta.
    NOTA: Se l'analisi del latte comprende profiling microbica, le prime gocce di latte devono essere eliminate.
  2. Raccogliere le gocce di latte in un tubo capillare, riempiendo il tubo capillare. Tubi capillari che possono ospitare volumi maggiori (ad esempio, 50 microlitri) facilitare il processo.
    NOTA: Se si riscontra difficoltà nella raccolta del latte, una seconda dose di ossitocina può essere somministrata. Si raccomanda di non superare la dose di 4 UI totale.
  3. Erogare il latte dal tubo capillare in una provetta steriletoccare l'estremità del tubo che è stato utilizzato per disegnare il latte dal capezzolo al lato della provetta - osservare il latte viene estratto dal tubo capillare tramite azione capillare.
    NOTA: 'Soffiare' il latte che non aspirata nel tubo con un ago 18 G attaccato ad una siringa da 1 ml.
  4. Monitorare continuamente la diga per segni di dolore o di depressione respiratoria e regolare il flusso di isoflurano conseguenza.
  5. Continuare a raccogliere il latte, come descritto in questa sezione fino a quando il latte sufficiente sono stati raccolti per l'analisi del latte prescelto. Per la creamatocrit e proteine ​​determinazione della concentrazione descritto di seguito, raccogliere 0,25 ml di latte.
    NOTA: utilizzare un sito di mungitura diverso se il latte delusione rallenta o il sito scelto non espelle il latte a sufficienza. Un massimo di circa 2,5 ml di latte per animale può essere raccolto 17, o fino a 0,5 ml per tettarella. Gli autori raccomandano che il tempo totale in anestesia essere limitato a circa 45-60 minuti, or 45 min di mungitura.
  6. Raccogliere latte in una provetta per la misura creamatocrit microematocrito da campioni di latte fresco, e sigillare l'estremità del tubo con argilla sigillante. Etichettare la provetta microematocrito con l'ID diga e conservare il campione di latte in posizione verticale.
  7. Quando la mungitura è completata, spegnere il flusso di isoflurano e ossigeno. Rimuovere la maschera dalla diga e continuare a monitorare diga fino sveglio. Si raccomanda che se non pienamente cosciente, la diga deve essere collocato su un tampone assorbente panchina durante il periodo di recupero, anziché direttamente sulla biancheria gabbia, per evitare che la biancheria venga aspirato o graffiare gli occhi della diga durante il recupero.
    NOTA: Non lasciare incustodita la diga fino a che non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere recumbancy sternale.
  8. Se non sono necessarie ulteriori analisi, congelare il latte a -80 ° C. Altri hanno suggerito che il latte può essere conservato fino a 3 ore a 4 ° C o 5 mesi a -20 ° C 18.

7. Creamatocrit misura

  1. Stimare il contenuto di grasso nel latte calcolando la creamatocrit latte (la percentuale di crema nel campione di latte) 19.
    NOTA: Le misurazioni con latte umano hanno dimostrato che il latte fresco o congelato può essere utilizzato per una misurazione creamatocrit, tuttavia latte fresco è più strettamente correlata (r = 0,92 rispetto r = 0,90) con concentrazione di lipidi 11. L'uso di latte fresco o congelato per misurazioni creamatocrit deve essere mantenuto costante attraverso lo studio, come il latte scongelato è associato ad una piccola diminuzione creamatocrit valori 11.
  2. Per il latte fresco, raccogliere un campione di latte dal capezzolo in un tubo microematocrito; riempire almeno ¾ (circa 15-20 ml). In alternativa, disegnare il latte fresco dal campione raccolto nel tubo capillare dopo mescolando bene. Sigillare la fine con l'argilla sigillante.
  3. Posizionare il tubo capillare nella filatore ematocrito, con ilestremità sigillata orientate verso l'esterno, assicurando la centrifuga è equilibrata.
  4. Iniziare lo spin ematocrito (120 sec a 13.700 xg).
    NOTA: il tempo di rotazione o la velocità possono cambiare a seconda del modello di centrifuga utilizzata.
  5. Rimuovere il tubo dalla centrifuga dopo lo spin è completa ed eseguire le misurazioni per calcolare il creamatocrit. Osservare separazione del campione in uno strato di crema e uno strato trasparente.
  6. Misurare e registrare la lunghezza totale del fluido nel tubo e la lunghezza del grasso (crema) strato utilizzando pinze o un righello.
    NOTA: Il creamatocrit è espresso come percentuale dello strato di crema all'interno del campione del latte 19, calcolato come (lunghezza dello strato di crema / lunghezza totale della colonna latte) x 100 (Figura 1A). Calcolare valori di concentrazione e di energia grasso da valutazione creamatocrit come segue: concentrazione di grasso (g / L) = (creamatocrit (%) - 0,59) /0.146 (Figura 1B) 19; Valore energetico (kcal / L) = 290 + (66,8 * creamatocrit (%) (Figura 1C) 19.

8. Proteine ​​Concentrazione Determinazione

  1. Utilizzando Bovine Serum Albumin come standard proteine, determinare la concentrazione totale di proteine ​​del latte usando un test standard di proteine, come una proteina test Lowry 6.
    NOTA: La diluizione del latte può essere necessario per le misurazioni della proteina del latte a cadere all'interno della curva standard del dosaggio.

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Risultati

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Il latte è stato raccolto come descritto allo svezzamento da dighe Wistar (circa 22 settimane di età, peso 350 a 400 g) che consuma un controllo (AIN-93G, n = 5), ad alto contenuto proteico (40% di caseina peso / peso, n = 5) , o di fibre prebiotiche (21,6% peso / peso, rapporto 1: 1 di oligofruttosio e l'inulina, n = 4) dieta durante la gravidanza e l'allattamento. La dose di ossitocina era 2 UI. Il latte è stato raccolto in provette capillari, e un tubo è stato filato usando un filatore ematocrito per determinare crea...

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Discussione

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Le indagini sui componenti del latte materno sono aumentate con l'aumento dell'interesse per la ricerca sullo sviluppo delle prime fasi della vita. Essendo l'unica fonte di nutrimento durante il periodo neonatale, i composti bioattivi del latte sono essenziali per la crescita e lo sviluppo ideali, soprattutto nel contesto della salute intestinale e immunitaria3. Il metodo qui presentato è un metodo semplice e non invasivo per raccogliere il latte dal ratto in allattamento in quantità sufficienti per l'analisi ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo protocolli approvati CCAC.

Ringraziamenti

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Funziona questo è stato sostenuto attraverso sovvenzioni dal scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (RGPIN 238382-2011) e Canadian Institutes of Health Research (MOP115076). Heather Paul è stato sostenuto da una borsa di studio post-laurea scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada e una borsa di studio Alberta innova Health Solutions. Megan Hallam è stato sostenuto da un scienze naturali e ingegneria Research Council Postgraduate borse di studio, una borsa di studio Frederick Banting e Charles Best Canada laureato e premio un bambini Alberta Hospital Research Training Institute in Genetica, Child Development, e la salute.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Equipment - Mungitura
1 ml siringheBD-Canada309602
aghi da 25 gBD-Canada305122
aghi da 18 gBD-Canada305196
50 &; l Microdispenser Provette capillariFisher Scientific21-169D
Ossitocina (20 unità USP/ml)Bimeda-MTC1OXY015
PPC Vet Isoflurano Anestetico per inalazione, 250 mlFresenius KabiM60302Utilizzato su prescrizione di un veterinario
Tampone sterile per la preparazione dell'alcolDukal853
Sottobanco assorbenteVWR82020-845
Maxi-Therm Coperta per iper/ipotermiaCincinnati Sub-Zero274
Macchina per anestesia per roditori con vaporizzatoreBenson Medical Industries Inc.In base alle esigenze individuali del laboratorio
: Maschere per animaliBenson Medical Industries, Inc.50100/50102
Provette per microcentrifugaAxygenMCT-060-C
ChroMini Rifinitore professionaleWahl
Equipment - Creamatocrit
StatSpin SafeCrit Provette per microematocrito in plastica (non trattate)Fisher Scientific22-274-914
Critoseal Vassoio sigillante per tubi capillariVWR470161-478
Centrifuga per microematocrito StatSpin CritSpinBeckman Coulter, IncX00-004999-001

Riferimenti

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