L'isolamento di regioni genomiche specifici e l'identificazione di molecole da Associated enChIP

Sommario

L'identificazione di molecole associate a specifiche regioni genomiche di interesse è necessaria per comprendere i meccanismi di regolazione delle funzioni di queste regioni. Questo protocollo descrive le procedure per eseguire l'imunoprecipitazione ingegnerizzata della cromatina mediata da molecole leganti il DNA (enChIP) per l'identificazione di proteine e RNA associati a una specifica regione genomica.

Abstract

L'identificazione di molecole associate a specifiche regioni genomiche di interesse è necessaria per comprendere i meccanismi di regolazione delle funzioni di queste regioni. Per consentire l'identificazione non distorta di molecole che interagiscono con una specifica regione genomica di interesse, abbiamo recentemente sviluppato la tecnica ingegnerizzata di immunoprecipitazione della cromatina mediata da molecole leganti il DNA (enChIP). Qui, descriviamo come utilizzare enChIP per isolare specifiche regioni genomiche e identificare le proteine e gli RNA associati. In primo luogo, una regione genomica di interesse viene marcata con una proteina simile all'attivatore di trascrizione (TAL) o con un complesso di brevi ripetizioni palindromiche (CRISPR) raggruppate regolarmente interspaziate costituito da una forma cataliticamente inattiva di Cas9 e da un RNA guida. Successivamente, la cromatina viene reticolata e frammentata mediante sonicazione. Il locus marcato viene quindi immunoprecipitato e la reticolazione viene invertita. Infine, le proteine o gli RNA associati alla cromatina isolata vengono sottoposti rispettivamente ad analisi di spettrometria di massa o di sequenziamento dell'RNA. Questo approccio consente l'identificazione di proteine e RNA associati a una regione genomica di interesse.

Introduzione

È necessaria l'identificazione di molecole associate a specifiche regioni genomiche di interesse per comprendere i meccanismi di regolazione delle funzioni genomiche quali la trascrizione e la regolazione epigenetica. Sebbene siano state sviluppate diverse tecniche per l'analisi biochimica di specifiche regioni genomiche ^1-7, non sono ampiamente utilizzati in questa fase causa dei loro problemi intrinseci quali applicazione limitata (ad esempio, solo per numero alta copy loci o loci con ripetizioni) e troppo tempo e gli sforzi necessari.

Al fine di effettuare analisi biochimica di specifiche regioni genomiche facilmente, abbiamo sviluppato due tecnologie specifiche locus cromatina (chip), vale a dire inserzionale Chip (iChip) ^8-13 e ingegnerizzato DNA-binding ChIP molecola-mediata (enChIP) ^14-17 . In iChip, un luogo di interesse è contrassegnati con l'inserimento di sequenze di riconoscimento di una proteina di legame al DNA esogeno, come LexR. Il locus è quindi isolato da purificazione per affinità con la proteina DNA-binding tag. In enChIP, ingegnerizzati molecole che legano il DNA, come le proteine ​​zinc-finger, (TAL) proteine ​​attivatore-come trascrizione, e cluster brevi ripetizioni palindromiche regolarmente intervallati (CRISPR) complessi, vengono utilizzate per contrassegnare un luogo di interesse (Figura 1). Successivamente, la regione genomica è isolato dalla purificazione per affinità delle molecole DNA-binding targhetta.

Uno dei vantaggi di enChIP sopra iChip è che l'inserimento di sequenze di riconoscimento di una proteina legante il DNA esogeno-non è necessario. Targeting di loci usando complessi CRISPR costituiti da una forma cataliticamente inattiva di Cas9 (dCas9) e una guida RNA (gRNA) è molto più facile che prendere di mira di queste regioni a iChip o enChIP utilizzando TAL e zinco-finger proteine. Qui, descriviamo un protocollo step-by-step per enChIP combinata con spettrometria di massa e RNA sequencing (RNA-Seq) per identificare locus-Associaproteine ​​e RNA ted, rispettivamente.

Protocollo

1. Progettazione di Engineered molecole di DNA-binding Riconoscere il Target Locus

1. Per enChIP utilizzando complessi CRISPR, utilizzare lo strumento web CRISPRdirect (http://crispr.dbcls.jp) per identificare sequenze candidato bersaglio gRNA nella regione genomica di interesse descritto come precedentemente ^18. Questo strumento web riporta 23 bp siti genomici della forma 5'-N ₂₀ NGG-3 'all'interno della regione di destinazione.
2. Sintetizzare un gBlock compresa la sequenza del promotore U6 e la sequenza di 5'-N ₂₀ in 5'-N ₂₀ NGG-3 'utilizzando servizi commerciali (vedi Figura 2) ^19,20. Ai fini subcloning, includere preposti per enzimi di restrizione al di fuori del gBlock.
3. Inserire il gBlock in un vettore adeguato come descritto in precedenza ^16. Diversi vettori retrovirali per gBlocks sono disponibili (vedi Materiali).
4. Per enChIP utilizzando proteine ​​TAL, progettare proteine ​​TAL riconoscendo la target loci. Generare plasmidi che codificano per proteine ​​TAL che utilizzano i servizi commerciali. Genera vettori di espressione contenenti le proteine ​​TAL fusi con una o più variabili come 3 × FLAG come descritto in precedenza ^15.

2. Istituzione di cellule per l'analisi enChIP

1. Esprimere 3 × FLAG-dCas9 e il gRNA (procedura basata CRISPR-) oppure 3 × FLAG-TAL (TAL procedura a base di proteine) nelle cellule per essere analizzato come descritto in precedenza ^14-17.
   1. Utilizzare trasfezione transiente se l'efficienza di trasfezione è alta. Un vettore di espressione contenente 3 × FLAG-dCas9 e il promotore CMV è disponibile (vedi Materiali).
   2. Considerare l'istituzione di trasformanti stabili con metodi convenzionali se l'efficienza di trasfezione transiente è bassa. In aggiunta ai suddetti vettori retrovirali per gBlock, vettori retrovirali di 3 × FLAG-dCas9 sono disponibili (vedi Materiali).
2. Conferma l'espressione del 3xFLAG-dCas9 o proteine ​​3xFLAG-TAL nelle cellule trasfettate mediante analisi immunoblot usando un anticorpo anti-FLAG (Ab) come descritto in precedenza ^14-17.
   Nota: L'espressione di queste proteine ​​con tag può anche essere confermata mediante colorazione intracellulare con anticorpi anti-FLAG-FITC e una successiva analisi FACS. Un protocollo per la colorazione intracellulare può essere scaricato dal nostro sito internet (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html).
3. Conferma espressione del gRNA dalla tecnica standard RT-PCR.
4. Per l'identificazione quantitativa di proteine ​​che interagiscono con la regione genomica di interesse, prendere in considerazione l'uso di un sistema di etichettatura isotopo stabile da aminoacidi nelle cellule in coltura (SILAC) analisi combinata con enChIP (enChIP-SILAC).
   Nota: supporto per l'analisi SILAC possono essere acquistati da fornitori commerciali. SILAC è potente nel rilevare interazioni specifiche.
   1. Cellule di coltura in SILAC medio pesante. Preparare cellule culturosso in mezzo luce SILAC come controllo negativo. Utilizzare almeno 5 × 10 ⁷ cellule per mezzo SILAC (pesante o leggero). Per l'etichettatura efficiente, aggiungere sia L-lisina-2HCl, ¹³ C ₆ e L-Arginina-HCl, ¹³ C _6, ^{15 N} ₄ nei media SILAC pesanti. Nota: Almeno cinque divisioni cellulari sono necessari per le proteine ​​di etichette.
      1. Per esempio, la cultura umana cellule fibrosarcoma HT1080 esprimono stabilmente 3xFLAG-dCas9 e un gRNA a 37 ° C e 5% di CO ₂ in DMEM media per la SILAC e siero fetale bovino dializzato con lisina-2HCl più L-Arginina-HCl (medio chiaro) o ¹³ C ₆ L-lisina-2HCl ^più 13 C _{⁶ 15 N} 4 L-arginina-HCl (medio pesante) (vedi Materiali) ^16. Aggiungere 50 mg di leggera o pesante L-lisina-2HCl e L-arginina-HCl in 500 ml di terreno.
      2. Cellule trypsinize e replate prima che diventino confluenti modo che le cellule mantengono growt esponenzialeh.

3. La reticolazione di Celle con formaldeide

1. Per le cellule in coltura in sospensione, trasferimento 2 × 10 ⁷ cellule che esprimono proteine ​​3xFLAG-TAL o 3xFLAG-dCas9 più gRNA e sospendere in 30 ml di terreno di coltura normale in una provetta da centrifuga da 50 ml. Quando si utilizzano più celle, aumentare i volumi e le quantità di reagenti proporzionalmente. Per gli esperimenti SILAC, mescolare le cellule coltivate in terreno pesante o leggero medio (5 x 10 ⁷ cellule ciascuno) e dividere il totale di 1 x 10 ⁸ cellule in 5 provette contenenti 2 x 10 ⁷ cellule.
2. Aggiungere 810 ml di formaldeide al 37% a 30 ml di sospensione cellulare (concentrazione finale 1%) e incubare a 37 ° C per 5 min. Per le cellule aderenti, correggere direttamente le cellule in coltura con l'aggiunta di 810 ml di formaldeide al 37% a 30 ml di terreno di coltura.
3. Fermare la reticolazione con l'aggiunta di 3,1 ml di 1,25 M soluzione di glicina (concentrazione finale 127 mm), eincubare a temperatura ambiente per 10 min.
4. Raccogliere le cellule per centrifugazione (300 xg per 5 minuti a 4 ° C). Eliminare attentamente il surnatante compresi formaldeide e conservarla in un flacone di scarico adeguato.
   1. Per le cellule aderenti, staccare le cellule con un raschietto cellulare e raccolto in un tubo da 50 ml, e raccogliere le cellule, come descritto in questo passaggio.
   2. Per gli esperimenti SILAC, mescolare le cellule staccate coltivati ​​in terreno pesante o media luce (5 x 10 ⁷ cellule ciascuno), dividere il totale di 1 x 10 ⁸ cellule in 5 provette contenenti 2 x 10 ⁷ cellule e raccogliere le cellule come descritto in questo passo.
5. Lavare il pellet con 30 ml di PBS due volte per provetta. Eliminare attentamente il surnatante compresi formaldeide e conservarla in uno spreco appropriata bottle.Handle rifiuti formaldeide secondo le linee guida sulla sicurezza chimica. Le cellule fissate possono essere congelati e conservati a -80 ° C.

4. Preparazione di cromatina (per 2 x 10^{7 cellule)}

1. Sospendere le cellule fissate in 10 ml di tampone di lisi cellulare (Tris 10 mM (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5% IGEPAL CA-630, e 1 × inibitori della proteasi) e incubare in ghiaccio per 10 min.
2. Centrifugare il campione (830 × ga 4 ° C per 8 min) e scartare con attenzione il surnatante.
3. Sospendere il pellet in 10 ml di tampone di lisi nucleare (Tris 10 mM (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% sodio desossicolato, 0,5% lauroylsarcosine, e inibitori della proteasi 1x). Incubare in ghiaccio per 10 minuti e vortice ogni 2-3 minuti.
4. Centrifugare il campione (830 × ga 4 ° C per 8 min) e scartare con attenzione il surnatante.
5. Lavare il pellet in 10 ml di PBS. Il pellet (frazione cromatina) può essere conservato a -80 ° C dopo immediatamente congelati in azoto liquido.

5. Sonicazione di cromatina (a 2 x 10 ⁷ cellule)

1. Sospendere la frazione cromatina in 800 ml dimodificato tampone di lisi 3 (10 mM Tris (pH 8,0), EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, 0,1% sodio desossicolato, 0,1% SDS, e 1x inibitori delle proteasi) e trasferire in una provetta da 1,5 ml.
2. Sonicare la cromatina utilizzando un sonicatore (vedi Materiali) e le seguenti condizioni: Uscita: 3; dovere: 100% (continuo); e il tempo libero. Eseguire 10-18 cicli di sonicazione per 10 sec e raffreddamento in ghiaccio per 20 sec. Per evitare un eccessivo riscaldamento, incubare i campioni in ghiaccio per 2 minuti ogni 5-6 cicli. Per evitare la formazione di schiuma, mantenere la posizione della punta della sonda sonicazione 0,5 cm sopra il fondo della provetta.
3. Centrifugare il campione a (16.000 xg a 4 ° C per 10 min) e trasferire il surnatante in una provetta da 1,5 ml. La cromatina sonicato può essere conservato a -80 ° C dopo immediatamente congelati in azoto liquido.

6. Valutazione di cromatina frammentazione

1. Mescolare 10 ml di cromatina frammentata con 85 ml di acqua distillata.
2. Aggiungere 4 ml5 M di NaCl e incubare a 65 ° CO / N.
3. Aggiungere 1 ml di 10 mg / ml RNasi A e incubare a 37 ° C per 45 min.
4. Aggiungere 2 ml di 0,5 M EDTA (pH 8,0), 4 ml di 1 M Tris (pH 6,8), e 1 ml di 20 mg / ml proteinasi K, e incubare a 45 ° C per 1,5 ore.
5. Separati 10 microlitri del campione mediante elettroforesi in gel di agarosio all'1% che non contiene coloranti colorazione come SYBR Green.
6. Macchia il gel per valutare la distribuzione delle lunghezze della cromatina frammentata. Le condizioni che generano una lunghezza media di 0,5-2 kbp (range di 0,2-4 kb) sono raccomandati.
7. Purificare il DNA da campioni rimanenti mediante estrazione con fenolo-cloroformio o usando un kit di estrazione del DNA (vedi Materiali). Il DNA purificato può essere utilizzato come DNA di ingresso per stimare le rese di analisi enChIP (vedi 8.11).

7. Preparazione di Dynabeads Coniugato con anticorpi (per 2 x 10 ⁷ cellule)

1. Prepare due provette da 1,5 ml, uno per pre-compensazione utilizzando IgG normale mouse e l'altra per l'incubazione con l'anticorpo anti-FLAG Ab. Aggiungere 150 ml di proteine ​​sfere magnetiche G-coniugato (vedi Materiali) ad ogni provetta.
2. Porre i tubi su un supporto magnete e attendere 3 minuti. Scartare il surnatante pipettando.
3. Sospendere le perline in 1 ml di PBS contenente 0,01% Tween-20 (PBS-T). Porre i tubi su un supporto magnetico e attendere per 2 min. Eliminare il surnatante pipettando, e quindi ripetere il passaggio.
4. Sospendere le perline in 1 ml di PBS-T contenente 0,1% BSA.
5. Aggiungere 15 mg di IgG di topo normale o anti-FLAG Ab e ruotare a 4 ° CO / N.
6. Spin down brevemente, quindi posizionare i tubi su un supporto magnete e attendere 3 minuti. Scartare il surnatante pipettando.
7. Sospendere le perline in 1 ml di PBS-T. Invertire più volte campione e spin down brevemente. Porre i tubi su un supporto magnete e attendere per 3 minuti, poi scartare il surnatante pipettando. Ripetere il lavaggioaltre due volte con PBS-T (totale di tre fasi di lavaggio).

8. Immunoprecipitazione della cromatina (a 2 x 10 ⁷ cellule)

1. Mescolare la cromatina frammentata preparato in 5.3) (circa 800 ml) con un quinto del volume (circa 200 ml) di tampone di lisi 3 modificato contenente 5% Triton X-100 (concentrazione finale di 1% Triton X-100).
2. Aggiungere la soluzione cromatina al tubo in cui proteine ​​G-coniugati biglie magnetiche coniugate con IgG normale del mouse sono stati preparati. Ruotare a 4 ° C per 1 ora.
3. Posizionare il tubo su un supporto magnete e attendere per 3 min.
4. Trasferire il surnatante nel tubo in cui proteine ​​G-coniugati biglie magnetiche coniugati con anti-FLAG Ab sono stati preparati. Ruotare a 4 ° CO / N.
5. Posizionare il tubo su un supporto magnete e attendere per 3 min. Scartare il surnatante pipettando.
6. Sospendere le perline in 1 ml di tampone salino basso (20 mM Tris (pH 8,0), EDTA 2 mM, NaCl 150 mM, 1% Triton X-100, 0,1% SDS inibitori della proteasi, e 1x) e ruotare a 4 ° C per 5 min. Posizionare il tubo su un supporto magnete e attendere per 3 min. Scartare il surnatante pipettando e ripetere la fase di lavaggio.
7. Lavare le perline con tampone di sali (20 mM Tris (pH 8,0), EDTA 2 mM, NaCl 500 mM, 1% Triton X-100, 0,1% SDS inibitori della proteasi, e 1x) due volte.
8. Lavare le perline con tampone LiCl (Tris 10 mM (pH 8,0), 1 mM EDTA, 250 mM LiCl, 0,5% IGEPAL CA-630, 0,5% sodio desossicolato, e inibitori della proteasi 1x) due volte.
9. Lavare le perline con TBS-IGEPAL CA-630 (50 mM Tris (pH 7,5), NaCl 150 mM, 0,1% inibitori IGEPAL CA-630, e 1x proteasi) una volta.
10. Sospendere le perline in 200 ml di tampone di eluizione (Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, 0,1% IGEPAL CA-630, inibitori della proteasi 1x e 500 mcg / ml 3 × FLAG peptide) e incubare a 37 ° C per 20 min. Posizionare il tubo su un supporto magnete e attendere per 3 min. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml e ripetere il Elution passo.
11. Purificare DNA da piccola porzione (ad esempio, 5%) dell'eluato mediante estrazione con fenolo-cloroformio o usando un kit di estrazione del DNA (vedi Materiali). Il DNA purificato può essere utilizzato per PCR con primer specifici imposta per stimare le rese di enChIP analisi confrontando con DNA ingresso preparata al punto 6.7 come descritto in precedenza ^14,16.

9. SDS-PAGE, colorazione, e analisi spettrometrica di massa

1. Mescolare l'eluato (400 microlitri) con 1 ml di 2-propanolo, 50 ml di 3M acetato di sodio (pH 5,2), e 5 ml di 20 mg / ml di glicogeno. Precipitare la cromatina a -20 ° CO / N.
2. Centrifugare il campione (16.000 xg a 4 ° C per 30 min) e scartare il surnatante. Lavare il pellet con 1 ml di etanolo al 70% e centrifugare di nuovo (16.000 xg a 4 ° C per 10 min). Eliminare il surnatante completamente pipettando.
3. Sospendere il pellet in 40 ml di tampone 2x campione (125 mM Tris (pH 6,8), il 10% 2-mercaptoethanol, 4% SDS, 10% di saccarosio, e 0,004% blu di bromofenolo). Vortex per 5 minuti per sciogliere completamente il pellet, e poi incubare a 100 ° C per 30 minuti per denaturare le proteine ​​e invertire la reticolazione.
4. Per SDS-PAGE, eseguire 40 ml di campione sul gel finché il colorante raggiunge 1 cm sotto il pozzo. Nota: Usiamo solitamente 4-20 gel% di pendenza, ma altri gel% può essere utilizzato.
5. Colorare il gel con Coomassie Brilliant Blue o macchia d'argento.
6. Tagliare il gel in cinque pezzi (2 mm) di altezza.
7. Eseguire la digestione gel e spettrometria di massa come descritto in precedenza ^13-16.
8. Per gli esperimenti SILAC con 5 x 10 ⁷ cellule ciascuna (totale di 1 x 10 ⁸ cellule), sospendere pellet dagli iniziali cinque tubi in 40 ml di tampone 2x campione (non è necessario scalare).

10. Purificazione di RNA e l'RNA-Seq Analisi

1. Per purificare l'RNA dopo enChIP, aggiungere 5 U / ml di RNase Inhibitor (seMateriali e) a tutte le soluzioni tampone, tranne modificato lysis buffer 3 e il tampone di eluizione, a cui aggiungere 40 U / ml di RNasi Inhibitor.
2. Mescolare l'eluato (400 ml) con 16 ml di NaCl 5 M e incubare a 65 ° C per 2 ore.
3. Aggiungere 1 ml di reagente acido-guanidinio-base-fenolo (vedi Materiali) al campione. Vortex per 15 secondi e poi incubare a temperatura ambiente per 5-15 min. Centrifugare il campione per 15 minuti a 12.000 xg e RT.
4. Trasferire il surnatante in una nuova provetta 1,5 ml e aggiungere 5 ml di p-bromoanisole. Vortex per 15 secondi e poi incubare a temperatura ambiente per 3-5 minuti. Centrifugare il campione per 10 minuti a 12.000 xg e RT.
5. Trasferire il surnatante (circa 1 ml) in un nuovo tubo 2 ml e aggiungere 1 ml di 2-propanolo. Capovolgere la provetta e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Caricare il composto su una colonna in un kit di purificazione dell'RNA (vedi Materiali). Centrifugare colonna per 1 min a 12.000 × g e RT.
6. lavaggiola colonna con 400 ml di RNA tampone di lavaggio in un kit di purificazione di RNA (vedi Materiali).
7. Aggiungere 80 ml di DNasi I cocktail (miscela di 5 ml di DNasi I (1 U / ml), 8 ml di 10 × DNasi I tampone di reazione, 3 ml di acqua priva di RNasi DNase /, e 64 ml di RNA tampone di lavaggio in un kit di purificazione dell'RNA (vedi Materiali)) per la colonna. Incubare il campione a 37 ° C per 15 minuti, quindi si centrifuga per 30 sec a 12.000 xg e RT.
8. Lavare la colonna con 400 ml di RNA prelavaggio tampone in un kit di purificazione di RNA (vedi Materiali) due volte.
9. Eluire l'RNA con 50 ml di acqua / RNasi-free DNasi. L'RNA eluito può essere utilizzato per il sequenziamento RNA.

Risultati

Complessivamente, 1-30% del bersaglio regioni genomiche può essere purificato usando enChIP. Figura 3 include dati rappresentativi che mostrano le rese di enChIP le analisi di targeting telomeri e il promotore del interferone (IFN) regolamentazione factor-1 (IRF-1) gene. Come esempi di risultati tipici, tabella 1 elenca le proteine ​​associate al IRF-1 promotore in maniera IFNγ specifica identificata dai enChIP-SILAC, Tabella 2 elenca le proteine-telomeri legame individuati dalla enChIP combinata con la spettrometria di massa (enChIP-MS) , e Tabella 3 elenca le RNA associati a telomeri identificate da enChIP-RNA-Seq.

Figura 1. Panoramica enChIP. enChIP utilizzando CRISPR (A, B) e TAL (C, D, E Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Sequenza di gBlock. Il promotore U6 (in nero), il G nucleotide brima la sequenza di guida (in blu), viene mostrata la sequenza di guida (gRNA distanziatore) (in rosso), la sequenza di ponteggio (in verde), e la sequenza di terminazione (in arancione).

Figura 3. I rendimenti di analisi enChIP rappresentante. Ingressi (A) percentuale per l'obiettivo di IRF-1 locus e la non bersaglio Sox2 locus. Ingressi (B) percentuali per i telomeri bersaglio e non bersaglio gamma-satelliti. Le cifre sono state adattate e modificato da precedenti pubblicazioni ^15,16.

Categorie	Proteine
Trascrizione	DDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo omologo, PURβ, attivato RNA polimerasi II trascrizionale attivatore p15, BTF3, Myb vincolanteproteina 1A
Histone deacetilazione, componenti corepressor	RBBP4, PA2G4, TBL3
Acetiltrasferasi	Proteine ​​arginina N-metiltransferasi 1
DNA topoisomerasi	DNA topoisomerasi 2α
Istoni	Histone H2A.Z, istone H3.2

Tabella 1:. Esempi di proteine ​​associate con la IRF-1 promotore umano in modo IFNγ specifica identificata dai enChIP-SILAC La tavola è stato ricavato da una pubblicazione precedente ^16.

Categorie	Proteine
Proteine ​​telomeri legame mammiferi	PML, RPA, CDK1, PARP1, PCBP1
Telomere-biproteine ​​nding nel lievito o altri organismi	IMP4
Le proteine ​​che interagiscono con telomeri vincolante proteine ​​[proteina telomeri legame associato]	DNA polimerasi α (POLA1) [Cdc13p], ARMC6 [TRF2], CTBP1 [FoxP2-POT1], exportin-5 [TERT], GNL3L [TRF1], exportin-1 [TERT], 14-3-3 [TERT]
Le proteine ​​localizzando a heterochromatin	BEND3
Le proteine ​​che regolano segnali epigenetici	KDM5C
Le proteine ​​le cui mutazioni influenzare la funzione dei telomeri	Α DNA polimerasi (POLA1), hat1, Nup133, CDK7, DPOE1, PRDX1, TYSY, glutammato-cisteina ligasi, glutaredossina, SMRC1

Tabella 2:. Esempi di proteine ​​associate con telomeri del mouse identificate da enChIP-MS La tabella è stata adapted da una pubblicazione precedente ^15.

Categorie	RNA
Componenti della telomerasi	TERC, RMRP
Telomeric RNA	Terras
scaRNAs	Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2
H / ACA snoRNAs	Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a
C / D snoRNAs	Snord17, Snord15a, Snord118
lncRNA	Neat1

Tabella 3: Esempi di RNA associati a telomeri del mouse identificate da enChIP-RNA-Seq La tavola è stato ricavato da una pubblicazione precedente ^17..

Discussione

Qui, descriviamo la purificazione di specifiche regioni genomiche utilizzando molecole ingegnerizzate che legano il DNA come il sistema CRISPR e le proteine TAL, e l'identificazione di proteine e RNA legati a queste regioni genomiche. Il legame di molecole ingegnerizzate che legano il DNA al genoma può influenzare la struttura della cromatina, compreso il posizionamento dei nucleosomi, e può abrogare le funzioni genomiche, come descritto negli esperimenti di interferenza CRISPR²¹. Per evitare questi potenziali effetti aberranti, proponiamo linee guida specifiche per la scelta delle regioni genomiche target. In primo luogo, per evitare la potenziale inibizione del reclutamento delle RNA polimerasi e dei fattori di trascrizione, nonché l'interruzione del posizionamento dei nucleosomi attorno al sito di inizio della trascrizione, le regioni target per l'analisi delle regioni del promotore dovrebbero essere diverse centinaia di coppie di basi a monte di (5' a) il sito di inizio della trascrizione. Al contrario, quando si analizzano regioni genomiche con confini distinti, come enhancer e silenziatori, le regioni genomiche che sono direttamente giustapposte a queste regioni possono essere prese di mira perché è meno probabile che il legame di molecole che legano il DNA ingegnerizzate influenzi le loro funzioni. Inoltre, è meglio evitare di utilizzare regioni bersaglio che sono conservate tra specie diverse, perché importanti molecole leganti il DNA spesso si legano a regioni evolutivamente conservate e l'inibizione del loro legame potrebbe interrompere le funzioni delle regioni genomiche bersaglio. A questo proposito, è sempre necessario verificare che la funzione della regione genomica target sia mantenuta nelle cellule stabilite utilizzate per le analisi enChIP. Poiché è possibile testare facilmente più gRNA ed è noioso e costoso generare più versioni di proteine TAL o zinc-finger riconoscendo diverse regioni genomiche target, l'enChIP che utilizza CRISPR è più vantaggioso di enChIP che utilizza altre proteine.

È stato dimostrato che dCas9 si lega ai siti fuori bersaglio, sebbene l'affinità con tali siti possa essere più debole di quella con i siti target^22-25. Esistono diversi modi per gestire la contaminazione delle molecole legate a quei siti fuori bersaglio. In primo luogo, si raccomanda l'uso di diversi, almeno due, gRNA diversi. Quelle molecole comunemente osservate in enChIP che utilizzano gRNA distinti sarebbero veri positivi. In secondo luogo, il confronto di diverse condizioni per l'enChIP sarebbe efficace nell'annullare la contaminazione di molecole non specifiche e di molecole legate a siti fuori bersaglio. Esempi di questi set di confronto potrebbero essere (i) stimolazione (-) e (+), o (ii) diversi tipi di cellule come le cellule T rispetto alle cellule B. Infine, l'analisi quantitativa del legame delle molecole candidate dovrebbe essere eseguita per confermare il loro legame specifico ai siti bersaglio. È preferibile preparare cellule che esprimono solo dCas9 ma non gRNA come controllo negativo.

Utilizzando le analisi enChIP, siamo stati in grado di identificare con successo una serie di molecole note e nuove che interagiscono con specifiche regioni genomiche (Tabelle 1-3)^14-17. Tuttavia, questa tecnica non è riuscita a rilevare alcune altre proteine note che interagiscono con queste regioni. Ad esempio, STAT1 si associa con il promotore IRF-1 dopo la stimolazione con IFNγ⁸, ma la nostra analisi enChIP-SILAC non ha rilevato STAT1 come proteina indotta a interagire con questa regione genomica¹⁶. Inoltre, nell'analisi enChIP-MS dei telomeri, non abbiamo rilevato proteine shelterine costituite da TRF-1 e TRF-2¹⁵, che hanno dimostrato di interagire con i telomeri²⁶. Ci sono alcune potenziali ragioni per queste discrepanze. In primo luogo, la stechiometria di legame di Stat1 al promotore IRF-1 potrebbe essere molto bassa. È ragionevole che enChIP-MS, incluso enChIP-SILAC, rilevi proteine che sono più abbondantemente associate alle regioni genomiche bersaglio; Pertanto, l'analisi di più cellule potrebbe essere necessaria per rilevare queste proteine. L'aumento della sensibilità degli strumenti per la SM contribuirebbe anche all'individuazione efficiente di proteine con basso legame stechiometrico. In secondo luogo, alcune proteine, tra cui Stat1 e shelterine, potrebbero essere bersagli difficili per le analisi della SM. In terzo luogo, nella nostra analisi delle proteine leganti i telomeri¹⁵, le proteine 3×FLAG-TAL che riconoscono i telomeri (3×FN-Tel-TAL) potrebbero aver bloccato il legame delle shelterine ai telomeri in modo competitivo.

In contrasto con la relativa difficoltà di rilevare i fattori di trascrizione che si legano a specifiche regioni genomiche utilizzando enChIP, abbiamo identificato con successo regolatori epigenetici come gli enzimi di modificazione degli istoni utilizzando le analisi di enChIP. Il successo di questa tecnica può essere dovuto al fatto che i regolatori epigenetici si legano a un'ampia gamma di regioni genomiche; quindi, sono disponibili più proteine per regione genomica per la SM. Poiché i regolatori epigenetici sono sempre più riconosciuti come bersagli importanti per i farmaci contro malattie intrattabili come il cancro, enChIP sarebbe uno strumento utile per l'identificazione di bersagli farmacologici epigenetici.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Servizio di sintesi gBlock,	Technologies	Sintesi genica di GeneArt
servizio di sintesi gBlock,	IDT (Integrated DNA Technologies)	gBlocks, Frammenti Genici:
pSIR-neo	Addgene	51128
pSIR-GFP,	Addgene	51134
pSIR-DsRed-Express2	Addgene	51135
pSIR-hCD2	Addgene	51143
Servizio di sintesi TAL	Life Technologies	GeneArt Precision TALs
3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1	Addgene	47948
3&volte; FLAG-dCas9/pMXs-puro	Addgene	51240
3&volte; FLAG-dCas9/pMXs-IG	Addgene	51258
3&volte; FLAG-dCas9/pMXs-I2	Addgene	51259
3&volte; FLAG-dCas9/pMXs-neo	Addgene	51260
anti-FLAG M2 Ab	Sigma-Aldrich	F1804
FITC-coniugato anti-FLAG M2	Sigma-Aldrich	F4049
DMEM medium per SILAC	Life Technologies	89985	Altri medium possono essere acquistati da Life Technologies
Dialyzed FBS per SILAC	Life Technologies	89986
L-Lisina-2HCl per SILAC	Life Technologies	89987	Per Mezzo leggero
L-Arginina-HCl per SILAC	Life Technologies	89989	Per Mezzo leggero
L-Lisina-2HCl, 13C6 per SILAC	Life Technologies	89988	Per Mezzo pesante
L-Arginina-HCl, 13C6, 15N4 per SILAC	Life Technologies	89990	Per Mezzo pesante
Completo, mini, Senza EDTA	Roche Diagnostics	4693159
Disgregatore ad ultrasuoni UD-201	Tomy Seiko
ChIP DNA Clean & Concentratore	Zymo Research	D5205
Dynabeads-Protein G	Life Technologies	DB10004
RNasin Plus RNase Inibitore	Promega	N2611
Isogen II	Nippon Gene	311-07361
Direct-zol RNA Miniprep kit	Zymo Research	R2050
LTQ Orbitrap Velos	Thermo Fisher Scientific		Un componente di un sistema nanoLC-MS/MS per l'analisi
nanoLC	Advance, Michrom Bioresources		Un componente di un sistema nanoLC-MS/MS per l'analisi MS
Autocampionatore HTC-PAL	CTC Analytics		Un componente di un sistema nanoLC-MS/MS per l'analisi MS