Analisi basata su Citometria Imaging- e di flusso della posizione cellulare e ciclo cellulare in 3D Melanoma Spheroids

Summary

Descriviamo due metodi complementari utilizzando l'indicatore del ciclo cellulare di ubiquitinazione a fluorescenza (FUCCI) e l'analisi delle immagini o la citometria a flusso per identificare e isolare le cellule nelle regioni interne G1 arrestate e proliferanti esterne degli sferoidi 3D.

Abstract

Gli sferoidi tumorali tridimensionali (3D) sono utilizzati nella ricerca sul cancro come modello più accurato del microambiente tumorale in vivo, rispetto alla tradizionale coltura cellulare bidimensionale (2D). Il modello sferoidale è in grado di imitare gli effetti dell'interazione cellula-cellula, dell'ipossia e della privazione di nutrienti e della penetrazione dei farmaci. Una caratteristica di questo modello è lo sviluppo di un nucleo necrotico, circondato da un anello di cellule arrestate G1, con cellule proliferanti sugli strati esterni dello sferoide. Di interesse nel campo del cancro è il modo in cui diverse regioni dello sferoide rispondono alle terapie farmacologiche e alla manipolazione genetica o ambientale. Descriviamo qui l'uso del sistema FUCCI (Fluorescence Ubiquitination Cell cycle Indicator) insieme alla citometria e all'analisi delle immagini utilizzando software commerciali per caratterizzare lo stato del ciclo cellulare delle cellule rispetto alla loro posizione all'interno degli sferoidi del melanoma. Questi metodi possono essere utilizzati per monitorare i cambiamenti nello stato del ciclo cellulare, nell'espressione genica/proteica o nella vitalità cellulare in diverse sottoregioni degli sferoidi tumorali nel tempo e in diverse condizioni.

Introduction

Sferoidi multicellulare 3D sono stati conosciuti come un modello di tumore per decenni, ma è solo di recente che sono venuti in uso più comune come un modello in vitro per molti tumori solidi. Essi sono sempre più utilizzati in high-throughput schermi scoperta di nuovi farmaci come intermedio tra complessi, costosi e in modelli in vivo che richiede tempo e il semplice, il modello 2D monostrato basso costo ^1-6. Gli studi in coltura 2D sono spesso incapaci di replicare in vivo. Modelli sferoidali di molti tipi di cancro sono in grado di imitare le caratteristiche di crescita, la sensibilità ai farmaci, di penetrazione della droga, ....

Protocol

1. FUCCI trasduzione e colture cellulari

1. FUCCI trasduzione
   1. Creare linee cellulari che esprimono stabilmente la FUCCI costruisce mKO2-hCdt1 (30-120) e MAG-hGem (1-100) ^{15 usando} lentivirus co-trasduzione come descritto in precedenza ^7.
      Nota: il sistema FUCCI è ora disponibile in commercio.
   2. Generare sub-cloni con fluorescenza mediante selezione singola cellula. Ordina cellule singole positive sia per AG e KO (giallo) per la fluorescenza delle cellule attivate l'ordinamento in una piastra a 96 pozzetti come in precedenza descritto ^7,16.
2. Coltura cellulare Melanoma
   1. Cellu....

Results

Esistono diversi metodi per produrre sferoidi tumorali, questo protocollo utilizza il metodo di crescita non aderente, in cui le cellule sono coltivate su agar o ^3,7,9 agarosio. La Figura 1 mostra un esempio di uno sferoide C8161 melanoma dopo 3 giorni su agar. Sferoidi C8161 formano sferoidi di dimensioni regolari con un diametro di 500 - 600 micron (media = 565, DS = 19, n = 3) dopo 3 giorni. Altre linee di cellule di melanoma che formeranno sferoidi includono: WM793, WM983C, WM983B, WM164,.......

Discussion

Analisi delle immagini semi-automatica ha identificato la G1 arrestato regione interna sferoide, e proliferare strati esterni. Questo metodo può essere utilizzato su sferoidi vivi utilizzando una sezione ottica, o in sezioni sferoidali fissi, per identificare variazioni non solo il ciclo cellulare ma espressione marcatore (via immunofluorescenza), morte cellulare, o morfologia cellulare in queste regioni diverse. Motilità cellulare in diverse regioni sferoidali può anche essere quantificato - se si aggiunge dal vivo con.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
agarosio a basso punto di fusione	Life Technologies	16520-050	Per il sezionamento
di agar nobile	Sigma	A5431	Per la produzione di sferoidi
agarosio per sferoidi	Fisher Scientific	BP1356-100	Per la produzione di sferoidi
0,05% tripsina/EDTA	Life Technologies	25300-054
HBSS	Life Technologies	14175-103
10% formalina	Sigma	HT5014-1CS	ATTENZIONE: Nocivo, corrosivo. Utilizzare dispositivi di protezione individuale, fare non respirare i fumi (aprire in una cappa aspirante).
vivo/morto vicino a IR	Life Technologies	L10119
vibratomo	Technical Products International, Inc
coppa di coltura	Thermo-Fisher Scientific	SIE936	Stampo per il sezionamento di sferoidi
emocitometro	Sigma	Z359629
piastra per coltura tissutale a 96 pozzetti	FAL353072
collagenasi	Sigma	C5138
microscopio confocale	Leica	TCS SP5
Citometro a flusso analizzatore	Becton Dickinson	LSRFortessa
volocity	PerkinElmer		Software di imaging
flowjo	Tree Star		Software di citometria a flusso
Grasso al consumo	Sigma	Z273554
Mezzi di montaggio	Vector Laboratori	H1000
FUCCI (costrutti commerciali)	Life Technologies	P36238	Solo trasfezione transitoria
Filtro cellulare 70 μ m	In Vitro	FAL352350
Provette da 5 ml a fondo tondo (sterili)	In	Vitro FAL352003
Provette da 5 ml a fondo tondo (non sterili)	In	FAL352008