Controllo ottico di cellule viventi attività elettrica da coniugati Polimeri

Sommario

Viene descritto un metodo per la stimolazione dell'attività elettrica di colture cellulari in vitro con luce visibile, basato sull'uso di polimeri semiconduttori organici.

Abstract

Le interfacce ibride tra semiconduttori organici e tessuti viventi rappresentano un nuovo strumento per applicazioni in vitro e in vivo. In particolare, i polimeri coniugati mostrano diverse proprietà ottimali come substrati per sistemi biologici, come una buona biocompatibilità, eccellenti proprietà meccaniche, una tecnologia di lavorazione economica e facile e la possibilità di deposizione su substrati leggeri, sottili e flessibili. Questi materiali sono stati impiegati per interfacce cellulari come sonde neurali, transistor per l'eccitazione e la registrazione dell'attività neurale, biosensori e attuatori per il rilascio di farmaci. Recenti esperimenti hanno anche dimostrato la possibilità di utilizzare polimeri coniugati per la modulazione completamente ottica dell'attività elettrica delle cellule. Sono stati riportati diversi casi di studio in vitro, tra cui reti neuronali primarie, astrociti e cellule della linea secondaria. Inoltre, è stato dimostrato che la fototrasduzione del segnale mediata da polimeri organici ripristina la sensibilità alla luce nelle retine degenerate, suggerendo che questi dispositivi potrebbero essere utilizzati per protesi retiniche artificiali in futuro. Nel complesso, i polimeri coniugati sensibili alla luce rappresentano un nuovo approccio per la modulazione ottica dell'attività cellulare.

In questo lavoro, vengono descritti tutti i passaggi necessari per fabbricare un'interfaccia bio-polimero per l'eccitazione ottica delle cellule viventi. La funzione dell'interfaccia attiva è quella di trasdurre lo stimolo luminoso in una modulazione del potenziale di membrana cellulare. Come caso di studio, utile per gli studi in vitro, viene utilizzato un film sottile di politiofene come strato funzionale che assorbe la luce, e le cellule del rene embrionale umano (HEK-293) vengono impiegate come componente biologico dell'interfaccia. Vengono forniti esempi pratici di controllo efficace del potenziale di membrana cellulare dopo stimolazione con impulsi luminosi di diversa durata. In particolare, è dimostrato che sia gli effetti depolarizzanti che quelli iperpolarizzanti sulla membrana cellulare possono essere raggiunti a seconda della durata dello stimolo luminoso. Il protocollo riportato è di validità generale e può essere facilmente esteso ad altri preparati biologici.

Introduzione

La possibilità di manipolare l'attività cellulare con una risoluzione spaziale e temporale preciso rappresenta una strategia fondamentale nella ricerca neuroscientifica e nel trattamento di disturbi neurologici e psichiatrici. ¹ metodi tradizionali si basano sulla stimolazione elettrica delle cellule utilizzando elettrodi posizionati in prossimità o in contatto con il sistema mirato, ² che può essere di diversa complessità (singola cellula, rete cellulare, sezioni di cervello, in vivo tessuti cerebrali). Nel secolo scorso, l'uso di patch-clamp, metallo e elettrodi substrato integrato hanno fornito un quadro dettagliato della fisiologia e fisiopatologia dei singoli neuroni e dei meccanismi di funzionamento delle reti neurali. Tuttavia, la stimolazione elettrica soffre di importanti limitazioni. Il primo è legato a una risoluzione spaziale generalmente scarsa a causa delle dimensioni fisiche degli elettrodi e la loro geometria fissa, che non può essere facilmente adattatoa sistemi organizzati complessi come i tessuti biologici. Inoltre, i problemi relativi alla impedenza elettrodi e di cross-talk tra sistemi di stimolazione e di registrazione possono deteriorare il rapporto finale segnale-rumore delle misurazioni. ³ D'altra parte, l'uso di luce per stimolazione può contribuire a superare molte limitazioni dell'approccio elettrico. Prima di tutto, offre spaziale senza precedenti (<1 um) e risoluzione temporale (<1 msec), rendendo possibile bersaglio specifici tipi cellulari o anche compartimenti sub-cellulari. Inoltre è altamente non invasiva poiché evita qualsiasi contatto fisico con il tessuto di interesse e districa stimolazione da registrazione. Inoltre, sia l'intensità della luce e lunghezza d'onda può essere regolata con precisione e possono essere applicati protocolli di stimolazione così diverse. ^3,4

Tuttavia, la maggior parte delle cellule animali non presentano alcuna sensibilità specifica alla luce. Diverse strategie per stimulatio ottican sono stati quindi proposti, sia sfruttando mediatori molecolari fotosensibili nelle vicinanze o all'interno delle cellule, o utilizzando un dispositivo fotoattivi collocato esternamente, vicino alla cella. La prima categoria si riferisce a meccanismi endogeni come la stimolazione tramite (IR) di luce visibile o infrarossa, così come l'uso di composti photoisomerizable / photocleavable o l'espressione genetica di attuatori molecolari fotosensibili (optogenetics). Quest'ultima categoria comprende tecniche di stimolazione esogena ottenuta con l'uso di nano / micro-particelle inorganiche o substrati di silicio fotoconduttori. ⁵ Tuttavia, tutti questi sistemi hanno lati luminosi e svantaggi. In particolare, l'assorbimento endogena di cellule nel visibile è debole e non affidabile, e la generazione contemporanea di specie reattive dell'ossigeno può essere dannoso per la cella. In generale, IR viene utilizzato per indurre il riscaldamento termico locale dovuto all'assorbimento di acqua, ma il coefficiente di estinzione dell'acqua è piccola, richiedendo così strong luce infrarossa (da decine a centinaia di W / mm ²⁾ che è difficile da trasportare via ottica microscopio standard e può comportare problemi di sicurezza per le applicazioni in-vivo. D'altra parte, foto-commutabile ingabbiamento composti hanno un'azione limitata tempo e spesso richiedono la luce UV che è difficile da trasportare a causa della penetrazione tissutale limitata. Inoltre essi soffrono di problemi di diffusione dei composti attivati ​​su fotolisi fuori dell'area illuminata. Infine, gli strumenti optogenetic hanno permesso agli scienziati di indirizzare sottopopolazione cellulare specifico e sotto-scompartimenti e stanno rapidamente emergendo come una delle tecnologie chiave nella ricerca neuroscientifica. Tuttavia, l'inserimento di un segmento di DNA esogeno tramite un vettore virale solleva importanti problemi di sicurezza, soprattutto in vista di adozione su pazienti umani. ^5,6 Per queste ragioni, la ricerca di nuovi materiali e dispositivi in grado di cellula manipolazione ottica è un argomento estremamente caldo.

Recentemente, un romanzo, è stato proposto approccio basato sull'uso di polimeri coniugati fotosensibili, in grado di trasdurre efficientemente uno stimolo ottico in una modulazione di cellula attività elettrica. La stimolazione delle cellule da Polymer fotoeccitazione (CSPP) tecnica sfrutta molte caratteristiche chiave di abilitazione tipico di semiconduttori organici: sono intrinsecamente sensibili alla luce nel campo del ^visibile, 7 sono biocompatibili, morbida e adattabile e la loro flessibilità meccanica permette un'interfaccia intima con tessuti sia in vitro e in vivo ^8-10. Oltre a questo, possono essere facilmente funzionalizzati per meglio adattarsi all'interfaccia con cellule viventi, e per consentire l'eccitazione specifico, sondando e sentendo capacità. ^11,12 Inoltre, essi sostengono elettronica e trasporto ionico, che li rende ideali per la combinazione dell'elettronica annuncio biologia. ^13,14 interessante, possono lavorare in modalità fotovoltaico, evitando la necessità di applicare una polarizzazione esterna fo la stimolazione ottica cella efficiente. ¹⁵

L'affidabilità della tecnica CSPP è già stata dimostrata in diversi sistemi, compresi i neuroni primari, ^{15,16 astrociti,} 17 linee di cellule secondarie ^{18 e} tessuti retinici espiantati. ¹⁶ In questo lavoro, tutti i passi necessari per fabbricare un biopolimero sensibile alla luce interfaccia ¹⁹ per la stimolazione ottica di sistemi in vitro sono descritte in dettaglio. Come caso di studio, una miscela fotovoltaico organico prototipo di regione-regolare poli (3-hexylthiophene) (rr-P3HT), che funge da donatore di elettroni, e fenil estere-C61-butirrico acido-metile (PCBM), in qualità di accettore di elettroni è impiegato. Poiché il sistema biologico, sono utilizzati embrionali umane di rene (HEK-293) le cellule. Viene fornito un esempio di un protocollo fotostimolazione con la relativa registrazione dell'attività delle cellule tramite misurazioni elettrofisiologiche.

La piattaforma descrittaè tuttavia di validità generale, e può essere facilmente esteso per l'uso di altri polimeri coniugati (regolando correttamente il processo di soluzione preparazione ei parametri di deposizione), diversi tipi di cellule (modificando adeguatamente il protocollo coltura cellulare, placcatura procedura e il tempo richiesto per la semina e la proliferazione delle cellule), e diversi protocolli di stimolazione (lunghezza d'onda della luce, frequenza stimoli e durata, densità fotoeccitazione).

Protocollo

1. Preparazione di substrati fotoattivi

1. Preparare una P3HT: soluzione PCBM (1: 1 w / w) in clorobenzene ad una concentrazione di 20 g P3HT / L. Mescolare la soluzione con un agitatore magnetico per almeno 4 ore a 60 ° C. Consideriamo un volume di 150 ml di soluzione per ciascun substrato da preparare.
2. Pulire vetrini ITO rivestite (R _s = 10 Ω / sq, 18x18 mm ^2, spessore 170 micron), con bagni consecutivi di acqua deionizzata, acetone e isopropanolo in un sonicatore (10 min per ogni passo). Asciugare il coprioggetto con una pistola di azoto. Mettere i campioni in un pulitore di plasma a 100 W di potenza per 10 min.
3. Depositare un film sottile dello strato attivo sui substrati puliti tramite spin-coating.
   1. Con una punta di diamante, tagliare un vetrino da microscopio, (spessore ≈ 1 mm) per le stesse dimensioni laterali dei substrati rivestiti ITO-. Rimuovere il P3HT: soluzione PCBM dalla piastra e lasciate raffreddare a temperatura ambiente.
   2. Impostare un due steps programma di spin-coater: i) 30 sec a 800 rpm; ii) 30 sec a 1.600 giri al minuto. Posizionare il vetrino sul mandrino dello spin-verniciatore e avviare il vuoto per risolvere il problema. Mettere una goccia di acetone sul vetrino e quindi il substrato pulito, con il lato ITO rivestito rivolto verso l'alto. Avviare la rotazione di spin-coater per sbarazzarsi di acetone in eccesso.
   3. Mettere 150 ml di P3HT: soluzione PCBM sui substrati e riprendere lo spin-coater (usare lo stesso protocollo descritto in 1.3.2).
   4. Dopo lo spin-verniciatore ha finito, rimuovere il campione e staccare con cura il substrato rivestito dal vetrino. Pulire la parte posteriore del substrato con un tampone camera bianca immerso in acetone.
      Nota: I substrati fotoattivi possono essere conservati per alcuni giorni in una scatola buia fino all'uso. Per periodi più lunghi, tenerli in un cassetto portaoggetti con gas inerte.

2. Preparazione di coltura cellulare e Elettrofisiologia Solutions

1. Preparare il terreno di coltura completo (CGM) perCellule HEK-293: Dulbecco Modified Eagle (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) termicamente inattivati, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina. Sterilizzare il mezzo con un sistema di filtrazione 0,2 micron e conservare a 4 ° C.
2. Preparare la soluzione extracellulare in acqua ultrapura (concentrazioni in mm): 135 NaCl, KCl 5.4, 5 HEPES, 10 glucosio, 1.8 CaCl _2, 1 MgCl _2. Regolare il pH a 7,4 con NaOH. Sterilizzare la soluzione con un sistema di filtrazione 0,2 micron e conservare a 4 ° C.
3. Preparare la soluzione intracellulare in acqua ultrapura (concentrazioni in mm): 12 KCl, 125 K-gluconato, 1 MgCl _2, 0.1 CaCl _2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 ATP-Na _2. Si noti che l'ATP-Na _{2 è} sensibile al calore e aggiungerlo scorso. Regolare il pH a 7,4 con NaOH. Sterilizzare la soluzione con un sistema di filtrazione 0,2 micron, aliquota in 1 ml provette e conservare a -20 ° C.

3. placcatura cellule HEK-293sui substrati attivi

1. Posizionare il substrato fotoattivi in ​​un bicchiere di vetro rivestito con alluminio o una piastra di Petri chiusa e messo in stufa a 120 ° C per 2 ore per la sterilizzazione. Da questo momento in poi, eseguire tutte le operazioni in condizioni sterili. Mettere i campioni in una cappa sterile e lasciarli raffreddare.
2. Coat substrato fotoattivi con uno strato di adesione per ridurre l'idrofobicità superficiale e di promuovere l'adesione cellulare.
   1. Posizionare i substrati attivi in ​​una capsula di Petri P35 o un piatto pozzetti 6. Data l'idrofobicità dello strato polimero coniugato, fare un polidimetilsilossano (PDMS) e fissare il campione e confinare le soluzioni.
      1. Mescolare PDMS e catalizzatore in 10: 1 proporzione con una bacchetta di vetro per ottenere un impasto viscoso.
      2. Versare l'impasto in una piastra multipozzetto 6, erogazione quantità sufficiente a coprire la metà di ciascun pozzetto.
      3. Attendere PDMS polimerizzazione a temperatura ambiente.
      4. Tagliare il PDMS curati in mezzo per obtaining una forma quadrata della stessa dimensione del campione di polimero.
      5. Sterilizzare il PDMS pozzetti per immersione in una miscela etanolo-acqua 70% per almeno 30 min.
   2. Se si utilizza bene le PDMS, graffiare lo strato fotoattivo lungo tutto il bordo del pozzetto con pinzette a punta, in modo da evitare il distacco dello strato intero quando si rimuovono le PDMS bene dopo coltura cellulare.
   3. Coprire l'intera superficie di ciascun campione con una soluzione di fibronectina (2 mg / L in PBS). Un volume tra 500-750 microlitri per campione è di solito sufficiente se un PDMS pozzo viene utilizzato (chiaro superficie del pozzetto: 15x15 mm ^2). Senza le PDMS oltre, sono necessarie per immergere completamente il campione di circa 2 ml di soluzione di fibronectina; prestare attenzione che il substrato non galleggia durante l'aggiunta della soluzione. Incubare i campioni a 37 ° C per almeno 1 ora.
   4. Rimuovere la soluzione fibronectina con una pipetta di vetro e lavare una volta con 2 ml di PBS.
3. Plate cellule HEK-293 sui campioni fibronectina trattata ad una densità di 15.000 cellule / cm ² in terreno di coltura completo. Utilizzare un volume di 750-1,000 ml di CGM per ciascun campione se un PDMS bene è utilizzato, altrimenti 2-3 ml di CGM sono necessari. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO _{2 per} 24-48.

4. ottico Stimolazione protocollo e misurazioni elettrofisiologiche

1. Mettere la soluzione extracellulare in un bagno d'acqua a 37 ° C per thermalize; scongelare la soluzione intracellulare, metterlo in una siringa da 1 ml con un ago calibro 34 e tenerlo a contatto con il ghiaccio per evitare il degrado della ATP.
2. Prendete un substrato cellulare rivestito dal termostato, togliendo con cura il PDMS bene se presente. Rimuovere il terreno di coltura con una pipetta di vetro e risciacquare il campione con una soluzione extracellulare. Procedete lentamente per evitare il distacco delle cellule.
3. Mettere il dispositivo nel campione-titolare della stazione di elettrofisiologia con solutio extracellularen e l'elettrodo di riferimento. Preparare micropipette di vetro freschi per patch-clamp con un estrattore (resistenza ideale è nel range 2-4 MW). Riempire la metà della pipetta con la soluzione intracellulare e montarlo sul micromanipolatore.
4. Cercare una cellula sana di patch sul dispositivo. Per evitare eccitazione indesiderato del substrato fotoattivi, utilizzare illuminazione IR per l'imaging, ponendo un filtro passa-lunghezza d'onda (ad esempio, un taglio di lunghezza d'onda λ = 750 nm può essere utilizzato per i polimeri che assorbono nel visibile) davanti dell'illuminatore microscopio.
5. Patch la cella selezionata e applicare il protocollo desiderato per la stimolazione ottica fornendo luce per il campione attraverso il percorso di fluorescenza di eccitazione del microscopio (Figura 1). Una descrizione dettagliata del protocollo patch-clamp può essere trovato in riferimento 20.
   1. Posizionare la pipetta di patch in prossimità della membrana cellulare con un manipolatore micrometrica. Durante il posizionamento, applicare overpressure alla pipetta per evitare incollamenti sporcizia sulla punta. La pipetta deve essere pochi micron sopra la cella.
   2. Avviare abbassando la pipetta verso la membrana cellulare controllando la resistenza pipetta sul software di controllo patch. Quando la resistenza pipetta è aumentata di circa 1 MW, rimuovere la sovrapressione dalla pipetta durante l'applicazione di una aspirazione delicata, per formare la gigaseal fra la pipetta e la membrana cellulare (cioè, la resistenza misurata deve aumentare a valori superiori a 1 GΩ) .
   3. Applicare un potenziale negativo per la pipetta vicino alla cella di attesa potenziale di riposo (per HEK293 cella un potenziale di -40 mV possono essere utilizzati) per contribuire a stabilizzare la tenuta. Compensare i transitori capacitivi causa delle capacità di pipetta con i comandi relativi sull'amplificatore cerotto e / o il software di controllo patch.
   4. Rompere la membrana per consentire l'accesso elettrico al citoplasma cella applicando un impulso di breve e intensa aspirazionealla pipetta. Impostare l'amplificatore patch clamp modalità corrente (I = 0, cioè, senza corrente iniettata nella cellula) per monitorare il potenziale di membrana cellulare. Attendere pochi minuti per vedere se il potenziale cella è stabile.
   5. Applicare il protocollo illuminazione desiderata per la cella e registrare l'effetto sul potenziale di membrana.
      Nota: L'illuminazione può essere consegnato al campione sia dal basso o dall'alto, a seconda dell'architettura microscopio.
      1. Selezionare una lunghezza d'onda di eccitazione che viene ben assorbita dal materiale attivo; per il P3HT: PCBM miscela, una lunghezza d'onda nell'intervallo 450-600 nm può essere utilizzato. Densità photoexcitation adatti sono nell'intervallo 10-100 mW / mm ^2.
         Nota: impulsi brevi di luce (sotto 10-20 msec) risultato in una depolarizzazione transitoria della cellula, mentre con illuminazione prolungata (centinaia di millisecondi o impulsi più lunghi) una iperpolarizzazione sostenuta si osserva fino a quando la luce è spenta.

Risultati

Le cellule possono essere facilmente coltivate su P3HT: substrati PCBM, a condizione che uno strato di adesione è depositato adatto (come la fibronectina utilizzato nel passaggio 3.2 del protocollo descritto). P3HT: PCBM picchi di assorbimento ottico nella parte verde dello spettro visibile; tuttavia altri polimeri coniugati fotosensibili possono essere selezionati, secondo la gamma d'onda fotostimolazione preferita (figura 2). Biocompatibilità di questi substrati è stat...

Discussione

Passaggi critici del protocollo riportato in vitro per stimolazione ottica di cellule riguardano principalmente la scelta del polimero fotosensibile, i parametri di sterilizzazione termica, l'intensità e la durata di stimoli luminosi. A P3HT: film sottile PCBM stato selezionato qui, dal momento che garantisce una buona stabilità temporale e elettrochimica. Tuttavia, si dovrebbe notare che non tutti i polimeri fotosensibili in grado di offrire prestazioni analogici, ²² più specificamente su illumi...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
rr-P3HT	Sigma Aldrich	698989-5G
Substrati rivestiti ITO	Nano-CS	IT10300100
Fibronectina	Sigma Aldrich	F1141
clorobenzene	Sigma Aldrich	319996
PCBM	Nano-C	Nano-CPCBM-BF
acetone	Sigma Aldrich	270725
alcool isopropilico	Sigma Aldrich	563935
celle	HEK LGC standards srl	ATCC-CRL-1573
HEPES	Sigma Aldrich	H0887
PBS	Sigma Aldrich	P5244
E-MEM	LGC standards srl	ATCC-30-2003
EDTA	Sigma Aldrich	E8008-FBS
	LGC standards srl	ATCC-30-2020