Identificare gli obiettivi diretti di molecole-genoma di mira resta una sfida importante. Per capire come le molecole che legano il DNA impegnano il genoma, abbiamo sviluppato un metodo che si basa sulla reticolazione di piccole molecole per isolare cromatina (COSMIC).
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Articolo metodologico
Mappatura Genome-wide di Drug-DNA interazioni nelle celle con COSMIC (reticolazione di piccole molecole per isolare cromatina)
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il genoma è il bersaglio di alcuni dei chemioterapici più efficaci, ma la maggior parte di questi farmaci mancano DNA specificità di sequenza, che porta a dose-limitante tossicità e molti effetti collaterali negativi. Targeting il genoma con piccole molecole sequenza-specifiche può consentire molecole con maggiore indice terapeutico e minori effetti fuori bersaglio. N -methylpyrrole / N poliammidi -methylimidazole sono molecole che possono essere razionalmente progettati per indirizzare specifiche sequenze di DNA con squisita precisione. E a differenza di molti fattori di trascrizione naturali, poliammidi possono legarsi al DNA metilato e chromatinized senza perdita di affinità. La specificità sequenza di poliammidi è stata ampiamente studiata in vitro con l'identificazione del sito cognate (CSI) e con approcci tradizionali biochimici e biofisici, ma lo studio di poliammide vincolanti agli obiettivi genomici nelle celle rimane inafferrabile. Qui riportiamo un metodo, la reticolazione di piccole molecole per Isolate cromatina (COSMIC), che identifica i siti di legame di poliammide in tutto il genoma. COSMIC è simile a immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), ma differisce in due modi importanti: (1) un photocrosslinker viene impiegato per consentire selettiva, cattura temporalmente controllata di poliammide eventi di legame, e (2) la maniglia affinità biotina è usato per purificare poliammide coniugati -DNA in condizioni di semi-denaturazione per diminuire DNA che non è legato covalentemente. COSMIC è una strategia generale che può essere utilizzato per rivelare gli eventi di legame genoma di poliammidi e di altri agenti chemioterapici genome-targeting.
Introduzione
Le informazioni da rendere ogni cellula del corpo umano è codificato nel DNA. L'uso selettivo di tali informazioni governa il destino di una cellula. I fattori di trascrizione (TFS) sono proteine che si legano a specifiche sequenze di DNA di esprimere un particolare sottoinsieme dei geni nel genoma, e il malfunzionamento del TF è legata alla comparsa di una vasta gamma di malattie, tra cui difetti di sviluppo, il cancro e il diabete . 1,2 Siamo stati interessati a sviluppare molecole in grado di legare selettivamente al genoma e modulare reti di regolazione genica.
Poliammidi composto da N e N -methylimi....
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Protocollo
1. La reticolazione in cellule vive
- Inizia con ~ 2.5x10 7 celle H1, o altre cellule in coltura.
NOTA: Il numero di celle H1 corrisponde a cinque piatti da 10 cm (circa il 40% di confluenza). - Crescere cellule in E8 media su piatti ricoperti su una superficie in grado di supportare le cellule staminali pluripotenti (vedi Materiali List), e incubare a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% di CO 2. Celle di raccolta enzimatica (vedi Materiali List). Nota: Non lasciare le celle H1 di superare il 90% di confluenza; confluenza induce la differenziazione spontanea delle cellule H1. Per contare le cellule, crescere un 10 cm pi....
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Risultati
Per tenere conto di non uniforme genoma frammentazione e altre variabili, il DNA purificato deve sempre essere normalizzato contro un riferimento di DNA Input. Primer specifici di un luogo di interesse possono essere utilizzati. È utile analizzare anche un locus qualora non si preveda la molecola di legare, come controllo negativo. Vediamo un aumento> 100 volte in occupazione poliammide upon irraggiamento con luce di 365 nm (Figura 2).
Arricchito DNA può essere analizzato.......
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Discussione
Una delle sfide principali con la ChIP convenzionale è l'identificazione di anticorpi adatti. La ChIP dipende fortemente dalla qualità dell'anticorpo e la maggior parte degli anticorpi commerciali non sono accettabili per la ChIP. Infatti, il consorzio ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements) ha riscontrato che solo il 20% degli anticorpi commerciali è adatto per i saggi ChIP. 50 Con COSMIC, gli anticorpi sono sostituiti dalla streptavidina. Poiché le poliammidi sono funzionalizzate con biotina, la streptavidina .......
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Dichiarazioni
A.Z.A. è l'unico proprietario di Vista Motif, LLC e WINStep Forward.
Ringraziamenti
Ringraziamo i membri del laboratorio Ansari e il Prof. Parameswaran Ramanathan per le utili discussioni. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni NIH CA133508 e HL099773, dalla borsa di studio della facoltà H. I. Romnes e dal W. M. Keck Medical Research Award ad A.Z.A. G.S.E. è stato supportato da una borsa di studio Peterson del Dipartimento di Biochimica e Molecular Biosciences Training Grant NIH T32 GM07215. A.E. è stato supportato dalla Morgridge Graduate Fellowship e dalla Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship, e D.B. è stato supportato dalla sovvenzione NSEC della NSF.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) | qualsiasi fonte | ||
| Benzamidina | qualsiasi fonte | ||
| Pepstatina | qualsiasi fonte | ||
| Proteinasi K | qualsiasi fonte | ||
| Dynabeads MyOne Streptavidina C1 | Life Technologies | 65001 | |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | È possibile utilizzare altre fonti |
| StemPro Accutase, reagente per dissociazione cellulare | Life Technologies | A1110501 | |
| Kit di purificazione QIAquick PCR | Qiagen | 28104 | Abbiamo provato con successo altri produttori di colonne per DNA. |
| Kit di preparazione dei campioni TruSeq ChIP | Illumina | IP-202-1012 | Questo kit può essere utilizzato per preparare il DNA cosmico per il sequenziamento di nuova generazione |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 356231 | Utilizzato per rivestire le piastre per la crescita di H1 ESC pH |
| carta | qualsiasi fonte | ||
| provette per microcentrifuga ambrata | qualsiasi fonte | ||
| provette per microcentrifuga | qualsiasi fonte | ||
| filtro in pyrex | qualsiasi fonte | Le piastre da forno in Pyrex sono adatte | |
| qPCR master mix | qualsiasi fonte | ||
| RNasi | qualsiasi fonte | ||
| HCl (6 N) | qualsiasi fonte | ||
| Piastre per coltura tissutale da 10 cm | qualsiasi fonte | ||
| Pipette sierologiche | qualsiasi fonte | ||
| Pipette Pasteur | qualsiasi fonte | ||
| Puntali per pipette | qualsiasi sorgente | ||
| Provette coniche da 15 ml | qualsiasi fonte | ||
| microcentrifuga | qualsiasi fonte | ||
| Magnetico rack di separazione | qualsiasi sorgente | ||
| Sorgente UV | CalSun | B001BH0A1A | È possibile utilizzare altre sorgenti UV, ma il tempo di reticolazione deve essere ottimizzato empiricamente |
| Sonicatore Misonix | Qsonica | S4000 con corno a tazza 431C1 | possibile utilizzare altri sonicatori, ma le condizioni di sonicazione devono essere ottimizzate empiricamente |
| Incubatore CO2 umidificato | qualsiasi fonte | ||
| Cabina di sicurezza biologica con uscita a vuoto | qualsiasi fonte |
Riferimenti
- Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and Its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2013).
- Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nat Rev Genet<....
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Ristampe e permessi
