Clonazione funzionale utilizzando un Xenopus Ovociti Expression System

Summary

Descriviamo un sistema di ovociti e cappucci animali di Xenopus per il clonaggio dell'espressione di geni in grado di indurre una risposta in un ectoderma competente, e discutiamo le tecniche per la successiva analisi di tali geni. Questo sistema è utile nell'identificazione funzionale di un'ampia gamma di prodotti genici.

Abstract

L'identificazione dei geni responsabili dell'induzione embrionale pone una serie di sfide; per citarne alcune, le molecole secrete di interesse possono essere poco abbondanti, possono non essere secrete ma legate alle cellule di segnalazione, o possono richiedere la presenza di partner leganti o molecole regolatrici a monte. Pertanto, nella ricerca di prodotti genici in grado di suscitare una risposta precoce induttiva del lente, in un ectoderma competente, abbiamo utilizzato un sistema di clonaggio di espressione che consentisse l'identificazione di fattori paracrini o juxtacrin, nonché di proteine trascrizionali o di altre proteine regolatorie. Pool di mRNA sono stati iniettati negli ovociti di Xenopus e il tessuto rispondente è stato posizionato direttamente sugli ovociti e co-coltivato. A seguito del clonaggio funzionale di ldb1 da una libreria di cDNA allo stadio di placca neurale basata sulla sua capacità di suscitare l'espressione del marcatore precoce del placode del cristallino foxe3 in un ectoderma animale con cappuccio competente per il cristallino, abbiamo caratterizzato il pattern di espressione dell'mRNA e analizzato la progressione dello sviluppo in seguito a sovraespressione o knockdown di ldb1. Questo sistema è adatto in una varietà molto ampia di contesti in cui l'identificazione di un induttore o delle sue molecole regolatorie a monte è ricercata utilizzando una risposta funzionale in un tessuto competente.

Introduction

Gli approcci genetici avanzati per identificare i geni di interesse attraverso la loro funzione o perdita di funzione^1,2 sono parte integrante della comprensione di eventi di patterning complessi nello sviluppo. Accoppiato con potenti tecniche di genetica inversa disponibili per una gamma sempre più ampia di sistemi e ricercatori^3-5, è ora possibile identificare i geni con un ruolo funzionale chiave in un percorso e quindi chiarire tale funzione a livello cellulare e in interazione con altri prodotti genici. Un approccio per identificare funzionalmente i geni di interesse che ha prodotto molte scoperte chiave in passato è il clonaggio di espres....

Protocol

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dalla University of Virginia Istituzionale Animal Care and Use Committee.

Nota: la figura 1 mostra una panoramica schematica delle procedure sperimentali.

1. Preparazione di ovociti

1. Pre-prime X. laevis femmine con 150 U di Pregnant Mare Serum gonadotropina (PMSG) circa una settimana di anticipo di isolamento degli ovociti. Iniettare 1 ml 150 U / ml PMSG in dorsale linfa sac con 1 cc siringa sterile con 29 ago G.
2. Preparare le soluzioni per l'iniezione degli ovociti e degli ovociti animale cap....

Results

In risposta alla espressione di mRNA iniettato in oociti, rispondendo tessuto protezione animale è stato analizzato per l'espressione di Otx2 mediante ibridazione in situ (Figura 2 e Tabella 1); Otx2 si esprime nella ectoderma lente presuntivo (PLE) da chiusura del tubo neurale attraverso la lente placode ispessimento ^19. Tuttavia, poiché Otx2 si esprime anche nella ectoderma neurale anteriore, così come non-neurale ectoderm.......

Discussion

Il metodo descritto qui per il clonaggio funzionale di geni capaci di indurre una risposta in ectoderma competente può essere utilizzato per identificare una vasta gamma di prodotti genici. Questo metodo si espande sul lavoro passato, combinando analisi dei tessuti che inducono con tecniche di clonazione espressione. Utilizziamo le vie metaboliche della oocita Xenopus come fonte di produzione di indurre fattori, direttamente o indirettamente, dopo l'iniezione di RNA. Questo, in combinazione con l'uso di.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12/101 Studi sullo sviluppo degli anticorpi	Banca degli ibridomi	12/101	Anticorpo monoclonale per la rilevazione del tessuto muscolare
20x SSC Buffer	Sigma	S6639	per ISH
Anidride acetica	Sigma	A6404	per ISH
Anti-Dig-AP	Roche	11093274910	per ISH
Aurum Plasmid Mini Kit	Bio-Rad	732-6400	Purificazione del DNA plasmidico
Reagente bloccante	Roche	11096176001	per ISH
BM Purple	Roche	11442074001	per forno di
ibridazione ISH Boekel	Fisher Scientific	13-245-121	per ISH
Bouin's Solution	Sigma	HT10132	per ISH
BSA	Sigma	A9647	per OCM
CHAPS	Sigma	C3023	per ISH
Collagenasi A		Roche 10103578001	Defollicolazione degli ovociti
Cisteina	Sigma	C121800	embrioni Dejelly
DEPC-H2O	Fisher Scientific	BP5611	per ISH
Dig-RNA Labeling Mix	Roche	11277073910	per sonde ISH
Pinze Dumont #5	Precision Instruments	500233	per busta Vitelline rimozione
Etile 3-amminobenzoato	Sigma	A5040	MS222 anestetico
Ficoll PM 400	Sigma	F4375	per mezzi di iniezione
Formamide	Sigma	F9037	per ISH
Gentamicina solfato	Sigma	G1914	per OCM
Capillari in vetro	World Precision Instruments	4878	3,5" lungo, I, D, 0,530 mm
Fiale per campioni di vetro	Fisher Scientific	06-408B	per ISH
Hair loop			Capelli apposti in pipetta pasteur per manipolazione tissutale
Eparina sale sodico	Sigma	H4784	per ISH
Injector Nanoliter 2010	World Precision Instruments	Nanoliter 2010	Microiniettore controllato da microprocessore
Instant Ocean	Carolina	972433	Aquarium Salt per il recupero della rana
IRBG XGC Xenopus verificato full-length cam cDNA	Fonte Bioscience	989_IRBG	libreria di cDNA
Piastre LB Agar con 100 µ g/ml Ampicillina	Teknova	L5004	Piastre LB-Amp pre-versate da 150 mm per la selezione dei sib
LB Luria Brodo	Teknova	L8650	LB per la raccolta di colonie nella selezione dei sib da piastre e la diluizione delle colture
Kit di isolamento magnetico dell'mRNA	New England BioLabs	S1550S	per l'isolamento dell'RNA arricchito di poli (A)
Acido maleico	Sigma	M0375	per ISH
Micromanipolatore manuale Microfil World	Precision Instruments	M3310R	Micromanipolatore manuale
Miscelatore nutante	Fisher Scientific	22-363-152	Rocker per ISH
Permoplast	Nasco SB33495M		Clay per iniezione e dissezione
Buffered Saline	Sigma	P5368	per ISH
PMSG	Sigma	G4877	per stimolare lo sviluppo degli ovociti
Polivinilpirrolidone	Sigma	PVP40	per estrattore
programmabile	World Precision Instruments	PUL-1000	Estrattore per aghi per micropipette
Proteinasi K	Sigma	P6556	per ISH
pTnT Vector	Promega	L5610	costruzione di librerie di cDNA
di combinazione Riboprobe	Promega	P1450	in vitro Kit
costruzione di librerie di cDNA a lunghezza intera in apice	Kit	di 18248013	Life Technologies per la costruzione di librerie di cDNA
Suture, seta 3-0	Fisher Scientific	19-037-516	Filo e ago per sutura per la rimozione post-ovocita
Torula RNA	Sigma	R3629	per ISH
Trietanolammina	Sigma	T1502	per ISH
Tween 20	Sigma	P9416	per ISH
Universal RiboClone cDNA Synthesis System	Promega	C4360	kit alternativo per la costruzione di librerie di cDNA
Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration	Source Bioscience	5055_XenORFeome	ORFeome Clones
XL2-Blue Ultracompetent Cells	Agilent Technologies	200150	cellule per la trasformazione del cDNA biblioteca