Simultanea a due fotoni In Vivo Imaging di Synaptic ingressi e degli obiettivi postsinaptici nella corteccia mouse retrosplenial

Summary

Questo video mostra la procedura di craniotomia che consente l'imaging cronico dei neuroni nella corteccia retrospleniale del topo utilizzando la microscopia a due fotoni in vivo nella linea transgenica Thy1-GFP. Questo approccio è combinato con l'iniezione di virus adeno-associato che esprime mCherry nell'ippocampo dorsale. Queste tecniche consentono il monitoraggio a lungo termine della plasticità strutturale dipendente dall'esperienza in RSC.

Abstract

Questo video mostra la procedura di craniotomia che consente l'imaging cronico dei neuroni nella corteccia retrospleniale del topo (RSC) utilizzando la microscopia a due fotoni in vivo nella linea di topi transgenici Thy1-GFP. Questo approccio crea la possibilità di studiare la correlazione delle manipolazioni comportamentali con i cambiamenti nella morfologia neuronale in vivo.

La procedura di impianto della finestra cranica è stata considerata limitata solo alle regioni della corteccia facilmente accessibili come il campo del barile. Il nostro approccio consente la visualizzazione dei neuroni nell'RSC altamente vascolarizzato. L'RSC è un elemento importante del circuito cerebrale responsabile della memoria spaziale, precedentemente ritenuto problematico per l'imaging a due fotoni in vivo.

L'impianto della finestra cranica sopra l'RSC è combinato con un'iniezione di virus adeno-associato ricombinante che esprime mCherry (rAAV^mCherry) nell'ippocampo dorsale. L'mCherry espresso si diffonde alle proiezioni assonali dall'ippocampo all'RSC, consentendo la visualizzazione dei cambiamenti sia nei bottoni assonali presinaptici che nelle spine dendritiche postsinaptiche nella corteccia.

Questa tecnica consente il monitoraggio a lungo termine della plasticità strutturale dipendente dall'esperienza in RSC.

Introduction

Microscopia a due fotoni rivoluzionato l'osservazione di attività cerebrale nel vivere e di comportarsi animali. Dalla sua introduzione nel 1990 ha rapidamente guadagnato popolarità ed è ora implementato come uno degli approcci più interessanti e innovative verso l'esame di numerosi aspetti dell'attività cerebrale in vivo ^1,2. Queste applicazioni includono le misurazioni del flusso sanguigno, attivazione neuronale (ad esempio, utilizzando indicatori di livello di calcio o di geni precoci immediati espressione) e la morfologia delle cellule neuronali. Un numero crescente di laboratori utilizzano microscopi a due fotoni, l'a....

Protocol

Tutte le procedure sperimentali descritte di seguito sono stati approvati dal Comitato Etico Locale presso l'Istituto Nencki of Experimental Biology, Accademia polacca delle scienze.

Nota: Alcune delle scene del video associato sono accelerati. Fattore di velocità è indicata in queste scene.

1. Chirurgia Preparazione

1. Sterilizzare tutti gli strumenti, contenitori di vetro per liquidi e tamponi di cotone in autoclave. Utilizzare guanti superflui. Pulire il tavolo operatorio, il telaio stereotassico e tutta l'area circostante con il 70% di etanolo. Utilizzare un tampone sterile chirurgica per c....

Results

L'espressione di GFP in un sottoinsieme di neuroni nel topo giornalista Thy1-GFP permette imaging in vivo dei dendriti corticali e proiezioni assonale locali a RSC. Figura 1A mostra proiezione massima di una pila di immagini con più dendriti GFP-positive visibili. Il corpo cellulare è oscurata da un'arteria. Figura 1B mostra un'immagine ingrandita solo piano (zoom digitale 3x) del ramo dendritico indicato 1A. Dettagli di morfologia d.......

Discussion

Nel documento corrente vi presentiamo un protocollo per la simultanea a due fotoni imaging in vivo degli ingressi sinaptici e gli obiettivi post-sinaptici in RSC attraverso una finestra cranica. La procedura di impianto è composto da diversi passaggi chiave. Innanzitutto, l'animale è profondamente anestetizzati e fissato nel telaio stereotassico, poi il cranio sopra RSC viene diluito con un trapano lungo le linee circolari segnalati e l'osso circolare viene rimosso. Dopo l'emorragia viene arrestato,.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Farmaco
Isoflurano	Baxter	AErrane 8DG9623	5-2% preoperatorio
Isoflurano	Baxter	AErrane 8DG9623	1,5-2% durante l'intervento
chirurgico Dexametasone	Scan Vet	Dexasone 2mg/ml	0,2 mg/kg intramuscolare
Baytril	Bayer	2,50%	5 mg/kg per via sottocutanea
Tolfedina	Vetoquinolo	4%	4 mg/kg per via sottocutanea
Butomidor	Richter Pharma	10 mg/ml	2 mg/kg per via sottocutanea
Carprofene	KRKA-Polska	Rycarfa 50 mg/ml	10 mg/kg per via sottocutanea
Lidocaina	Jelfa	Lignocainum	via topica
Lidocaina	Jelfa	20 mg/g	per via topica
Chirurgia
Gelfoam	Ethicon	Spongostan dental; REF MS0005
Unguento per gli occhi	Dedra	Lubrithal	per via topica
Colla CA	Pelikan Daniel	20G Huste
Dental acrilico	SpofaDental	Duracryl Plus
Montatura stereotassica	Stoelting	51500D
Tool
Coverglass	Harvard Apparecchio	HSE-64-0720
Trapano dentale	Sigmed	Keystone KVet
Barra di fissaggio Su	misura	N/A	Potrebbero essere utilizzati dadi a vite M2 o M3
Pinze	Renex	PN-7B-SA
Micro forbici	Falcon	BM.183.180
Microscopio da dissezione	KOZO	XTL6445T
Imaging
Telaio di supporto	Microscopio N/A		a
due fotoni	Zeiss	Upright Axio Examiner Z1	Unità laser: Camaleonte coerente 690-1040nm con oscillatore parametrico ottico 1050-1300nm. Obiettivi: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 e LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Rilevamento: filtri passa-banda Zeiss BP 500-550 (GFP) e BP 570-610 (mCherry) separati da beam splitter a 560nm e accoppiati a due fotorivelatori GaAsP.
Reagente
Dono del virus	K. Deisseroth		Virus adeno-associato ricombinante (rAAV) che esprime la proteina fluorescente mCherry sotto il controllo del promotore CaMK