Simultanea a due fotoni In Vivo Imaging di Synaptic ingressi e degli obiettivi postsinaptici nella corteccia mouse retrosplenial

Summary

Questo video mostra la procedura di craniotomia che consente l'imaging cronico dei neuroni nella corteccia retrospleniale del topo utilizzando la microscopia a due fotoni in vivo nella linea transgenica Thy1-GFP. Questo approccio è combinato con l'iniezione di virus adeno-associato che esprime mCherry nell'ippocampo dorsale. Queste tecniche consentono il monitoraggio a lungo termine della plasticità strutturale dipendente dall'esperienza in RSC.

Abstract

Questo video mostra la procedura di craniotomia che consente l'imaging cronico dei neuroni nella corteccia retrospleniale del topo (RSC) utilizzando la microscopia a due fotoni in vivo nella linea di topi transgenici Thy1-GFP. Questo approccio crea la possibilità di studiare la correlazione delle manipolazioni comportamentali con i cambiamenti nella morfologia neuronale in vivo.

La procedura di impianto della finestra cranica è stata considerata limitata solo alle regioni della corteccia facilmente accessibili come il campo del barile. Il nostro approccio consente la visualizzazione dei neuroni nell'RSC altamente vascolarizzato. L'RSC è un elemento importante del circuito cerebrale responsabile della memoria spaziale, precedentemente ritenuto problematico per l'imaging a due fotoni in vivo.

L'impianto della finestra cranica sopra l'RSC è combinato con un'iniezione di virus adeno-associato ricombinante che esprime mCherry (rAAV^mCherry) nell'ippocampo dorsale. L'mCherry espresso si diffonde alle proiezioni assonali dall'ippocampo all'RSC, consentendo la visualizzazione dei cambiamenti sia nei bottoni assonali presinaptici che nelle spine dendritiche postsinaptiche nella corteccia.

Questa tecnica consente il monitoraggio a lungo termine della plasticità strutturale dipendente dall'esperienza in RSC.

Introduction

Microscopia a due fotoni rivoluzionato l'osservazione di attività cerebrale nel vivere e di comportarsi animali. Dalla sua introduzione nel 1990 ha rapidamente guadagnato popolarità ed è ora implementato come uno degli approcci più interessanti e innovative verso l'esame di numerosi aspetti dell'attività cerebrale in vivo ^1,2. Queste applicazioni includono le misurazioni del flusso sanguigno, attivazione neuronale (ad esempio, utilizzando indicatori di livello di calcio o di geni precoci immediati espressione) e la morfologia delle cellule neuronali. Un numero crescente di laboratori utilizzano microscopi a due fotoni, l'attuazione della tecnica in tutto il mondo scientifico come un nuovo standard per l'imaging in vivo del cervello.

L'approccio standard prevede l'impianto della finestra del cranio (un foro rotondo nel cranio coperto con una copertura in vetro) oltre il barile o corteccia visiva del cervello di topo ^3. Successivamente, a seconda del protocollo sperimentale, il mouse subisce una serie di visualizzazione e allenamenti comportamentali, consentendo di monitorare i cambiamenti nell'attività cerebrale e la morfologia neuronale nel tempo ^4,5. In entrambi i casi il craniotomia interessa solo l'osso parietale, senza attraversare le suture. È ampiamente ritiene che il principale svantaggio di questa tecnica è la limitata applicazione cortecce facilmente accessibili come il barile o corteccia visiva. L'impianto della finestra del cranio su altre regioni pone molte difficoltà, a causa di eccessivo sanguinamento e / o ostacoli spaziale.

In questo articolo si propone l'impianto della finestra del cranio sopra la corteccia retrosplenial (RSC) come un'altra possibile regione di interesse per due fotoni in vivo microscopia a ^6. RSC è un elemento importante del circuito di cervello responsabile per la formazione della memoria spaziale. Anatomicamente, RSC è una parte di una rete neuronale che collega corticale, ippocampo, talamo e le regioni ^7. Èpesantemente coinvolti in una serie di comportamenti, quali l'apprendimento spaziale e l'estinzione, così come la navigazione spaziale ^6.

Al fine di visualizzare i cambiamenti morfologici dei neuroni che usiamo una linea di topo transgenico che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il promotore Thy1. In questi topi, GFP è espressa in circa il 10% dei neuroni nel cervello consentendo chiara visualizzazione degli assoni e dendriti corticali utilizzando microscopia a due fotoni ^8. Un'altra innovazione che vi proponiamo è l'iniezione di un ricombinante adeno-associato virus sierotipo 2/1 (rAAV2 / 1) che codifica una proteina fluorescente rossa (mCherry) in una specifica-neurone CaMKII promotore ⁹ nelle strutture profonde del cervello sporgenti di RSC , come l'ippocampo. L'espressione di rAAV2 / 1 ^mCherry nell'ippocampo di topo Thy1-GFP permette la visualizzazione simultanea di elementi pre-e post-sinaptici del Hippocampo-cortical sinapsi ^10. L'espressione rAAV-driven di mCherry richiede due o tre settimane per la proteina di raggiungere livello sufficiente nei terminali degli assoni. Questo periodo è coerente con il solito tempo richiesto per il recupero di craniotomia.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali descritte di seguito sono stati approvati dal Comitato Etico Locale presso l'Istituto Nencki of Experimental Biology, Accademia polacca delle scienze.

Nota: Alcune delle scene del video associato sono accelerati. Fattore di velocità è indicata in queste scene.

1. Chirurgia Preparazione

1. Sterilizzare tutti gli strumenti, contenitori di vetro per liquidi e tamponi di cotone in autoclave. Utilizzare guanti superflui. Pulire il tavolo operatorio, il telaio stereotassico e tutta l'area circostante con il 70% di etanolo. Utilizzare un tampone sterile chirurgica per creare uno spazio sterile per tutte le attrezzature sterilizzato. Tagliare Gelfoam in piccoli pezzi e ammollo in soluzione fisiologica sterile.
   Nota: Secondo la Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio, l'etanolo non è né un sterilizzante, né un disinfettante di alto livello. Dovrebbe essere usato solo come un detergente / sgrassante su superfici già sterilizzati.
2. Mettere l'animale in the camera di induzione e impostare il livello isoflurano al 5% e il flusso di ossigeno a 2 L / min. Questa procedura dovrebbe durare circa 3 min.
3. Prendere l'animale dalla camera di induzione. Utilizzare coda o punta pizzicotti per garantire che l'animale è completamente sedato.
4. Utilizzando un trimmer precisa radere i capelli dalla parte posteriore della testa (tra le orecchie) fino agli occhi.
5. Posto l'animale nel telaio stereotassico e stabilizzare la testa con barre orecchio.
6. Impostare i livelli di anestesia per 1,5-2% isoflurano e 0.3 L / min di ossigeno.
7. Applicare l'unguento oculare.
8. Iniettare il sottocutanea animale con Tolfedine (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) e Baytril (5 mg / kg) per prevenire l'infiammazione, il dolore e l'infezione, rispettivamente.
9. Iniettare il intramuscolare animale con desametasone (0,2 mg / kg) per prevenire il gonfiore cervello.
   Nota: È possibile iniettare desametasone per via sottocutanea o intraperitoneale per evitare danni muscolari.
10. Pulire la pelle con stamponi di cotone terile con Betadine seguita da etanolo al 70%.
11. Cambiare i guanti e spruzzarli con il 70% di etanolo.
    Nota: Durante l'utilizzo di guanti usa e getta non toccare il campo sterile. Toccare l'animale solo con le punte di strumenti chirurgici sterili e tamponi sterili.

Chirurgia 2. cranica finestra

1. Sollevare la pelle con una pinza e utilizzando microorganismi forbici incidere la pelle orizzontalmente lungo la base della testa e poi obliquamente al punto fronte tra gli occhi. Rimuovere il lembo cutaneo.
2. Applicare lidocaina pomata con un tampone sterile sul periostio per evitare un eccessivo sanguinamento e dolore.
3. Usare tamponi di cotone sterili o un bisturi per rimuovere il periostio. Asciugare il cranio con tamponi sterili.
4. Utilizzando un ago sterile applicare colla cianoacrilato densa sui bordi della pelle per immobilizzare loro e per evitare il contatto con il cemento dentale. Attendere che la colla si asciughi.
5. Lay uno sterile 3 millimetri coprioggetti sopra tegli cranio anteriormente alla sutura lambdoidea. Centrare il vetrino a RSC coordinate: AP, bregma -2.8; ML, bregma 0. Mark bordi coprioggetto da graffiare la superficie del cranio con un ago sterile. Mettere il coprioggetti nel contenitore sterile, con il 70% di etanolo.
6. Utilizzare un trapano dentistico ad alta velocità con una piccola bava di diametro per delineare un cerchio del diametro di 3 mm. Pulire il sito di perforazione dalla polvere di osso con soluzione salina sterile tamponi immersi. Utilizzare il Gelfoam e tamponi per fermare l'emorragia occasionale e pulire l'osso.
7. Tra foratura controllare lo spessore osseo con una pinza sottile toccando delicatamente il cerchio dell'osso e controllando la sua mobilità. Tenere presente che l'osso è più spessa sulla superficie della sutura. Fermare la perforazione quando il cerchio osso è mobile e solo un pari, sottile strato di tessuto osseo viene lasciato sulla circonferenza. Pulire il campo operativo di tutta la polvere osso residuo con soluzione salina immerso tamponi.
8. Eliminare la soluzione salina sterile nella zona di perforazione, che copre il cir foratoCLE. Scalzare con cura il cerchio osso con una pinza sottile e poi delicatamente ma con fermezza rimuovere l'osso sollevandolo verso l'alto. Fare attenzione a non inclinare il cerchio osso mentre lo si solleva per evitare possibili danni alla dura.
9. applicare delicatamente la Gelfoam imbevuta di soluzione salina sterile sulla dura per aiutare a fermare l'emorragia. Attendere fino a quando tutto il sanguinamento è completamente interrotta. Rimuovere con attenzione il Gelfoam non disturbare il processo di coagulazione.
   Nota: l'area di sutura è altamente vascolarizzata, in modo che il sanguinamento a questo punto potrebbe rivelarsi profonda. È indispensabile attendere il tempo sufficiente per il sanguinamento si fermi completamente. È utile mantenere l'Gelfoam imbevuta di soluzione salina raffreddato mettendolo in ghiaccio.

3. Virus iniezione

1. Fissare la pompa di infusione alla torre stereotassica e collegare il controller.
2. Inserire l'ago 35G nella siringa. Lavare la siringa 10 volte con etanolo per sterilizzare e 10 volte con soluzione salina sterile per rimuovere le tracce di ethanol. Rimuovere le bolle d'aria dalla siringa. Inserire la siringa nella pompa.
   Nota: Si consiglia di utilizzare altri disinfettanti.
3. Scongelare una singola dose di rAAV2 / 1 preparazione ^mCherry (si consiglia 10 ¹² pfu) e tenerlo in ghiaccio. Riempire la siringa con la soluzione di virus.
4. Centrare l'ago sulla bregma e quindi inserire delicatamente nella ippocampo utilizzando le seguenti coordinate: AP -2, ML +/- 1.0, DV -1. Queste coordinate saranno situati vicino al bordo della craniotomia. Attendere per 5 minuti per il tessuto si stabilizzi.
5. Iniettare 0,7 ml di soluzione di rAAV2 / 1 ^mCherry alla velocità di 50 nl / min. Attendere 10 minuti per il virus di adsorbire completamente. Rimuovere delicatamente l'ago. Tamponare con Gelfoam in caso di sanguinamento. Ripetere con il sito controlaterale.

4. cranica Finestra Implantation

1. Lay sterile, coverglass secca sulla parte superiore della dura nel telaio del cerchio forato. Tenere il coprioggetti con la forceps per appiattire delicatamente la dura e portare coverglass 'bordi più vicino alla superficie del cranio.
   Nota: E 'possibile che il coprioggetti sconvolge il coagulo e la riprende sanguinamento. Se questo è il caso, sollevare il coprioggetti, metterlo in alcool, asciutto e tornare al punto 2.9.
2. Usando un ago sterile applicare la colla cianoacrilato densa sui bordi di coperture vetrose per il fissaggio al cranio. Attendere che la colla si asciughi.
3. Mettere una barra di fissaggio (M2 dado o un disegno su ordine) nella parte anteriore del cranio. Applicare la colla cianoacrilato oltre i bordi della barra. Attendere che la colla si asciughi.
   1. Posizionare la barra di fissaggio in una posizione che consenta il posizionamento orizzontale della finestra cranica durante l'imaging sessione. Posizionare il più lontano possibile dal finestrino. Se è posizionato troppo vicino alla finestra, la barra e la vite di collegamento con il supporto misura potrebbero rappresentare un ostacolo per l'obiettivo durante il processo di imaging.
4. Preparare la acrilico dentale e applicarlo sulla superficie del cranio intorno al bicchiere. È utile per formare una figura crateriforme intorno alla finestra. Si creerà una cavità di acqua applicata successivamente per l'imaging con l'obiettivo di acqua.
5. Creare un berretto con l'acrilico dentale, che copre il resto della zona operativa, bordi cutanei, bar fissazione, rafforzando il cratere intorno alla finestra cranica. Attendere che il cemento dentale per indurire.
6. Rimuovere l'animale dal telaio stereotassico e metterlo nella camera di recupero.
7. Attendere che l'animale per recuperare da un intervento chirurgico nel rispetto delle funzioni fisiologiche.
8. Applicare analgesia post-operatoria (carprofen, 10 mg / kg) e il trattamento antibiotici (Baytril, 5 mg / kg) per 48 ore.

5. Imaging

1. Avviare il laser Ti: zaffiro, accendere il microscopio. Il sistema utilizzato in questo esperimento è dotato di un laser a due fotoni, sistema OPO e doppio PMT GaAsP.
2. Mettere l'animale nella Induccamera di e indurre l'anestesia.
3. Rimuovere l'animale dalla camera di induzione e posto nella maschera anestesia gas sotto il microscopio. Diminuire il flusso di ossigeno al 0,3 L / min e la concentrazione isoflurano al 1,5-2%.
4. Fissare l'animale a stativo personalizzato con una vite M2 (o un altro sistema personalizzato). Livellare la finestra del cranio.
   Nota: È possibile utilizzare il sistema di fissaggio della testa del produttore microscopio, anche se il telaio personalizzato specifico dà risultati migliori (migliore stabilità testa, costante posizionamento in più sessioni durante un esperimento cronica).
5. Utilizzando le impostazioni del microscopio widefield e un basso centro obiettivo di ingrandimento della vista su uno dei lati della corteccia retrosplenial e concentrarsi sulla superficie vetrino.
6. Applicare una goccia d'acqua nel pozzo acrilico crateriforme. Passare a un obiettivo di immersione in acqua a lunga distanza. Spostare l'obiettivo verso la finestra del cranio fino a quando l'aria l'acqua del meniscoUnisce il campione e obiettivo.
7. Passare alle impostazioni di due fotoni e iniziare la scansione del campione superiore a fondo utilizzando lo zoom più basso. La traversata di dura madre sarà visibile come un bagliore di segnale non specifico alta.
8. Regolare le impostazioni di acquisizione microscopio in entrambi i canali (GFP e mCherry) secondo la potenza del segnale da cellule fluorescenti in modo da coprire l'intera gamma dinamica.
9. Dopo aver trovato un neurone adeguata (con l'albero dendritiche separata da altre cellule) eseguire una scansione iniziale utilizzando solo il filterset GFP con lo zoom più basso e Z-distanza di 5 micron.
10. Ottenere una proiezione massima dello stack scansionato e stamparlo per le annotazioni (utilizzando colori invertiti).
11. Impostare lo zoom su un valore che permetterà di immagine i dettagli morfologici desiderati. Immagine l'intero albero dendritiche nei canali GFP e mCherry con proiezione massima di guida.

Results

L'espressione di GFP in un sottoinsieme di neuroni nel topo giornalista Thy1-GFP permette imaging in vivo dei dendriti corticali e proiezioni assonale locali a RSC. Figura 1A mostra proiezione massima di una pila di immagini con più dendriti GFP-positive visibili. Il corpo cellulare è oscurata da un'arteria. Figura 1B mostra un'immagine ingrandita solo piano (zoom digitale 3x) del ramo dendritico indicato 1A. Dettagli di morfologia d...

Discussion

Nel documento corrente vi presentiamo un protocollo per la simultanea a due fotoni imaging in vivo degli ingressi sinaptici e gli obiettivi post-sinaptici in RSC attraverso una finestra cranica. La procedura di impianto è composto da diversi passaggi chiave. Innanzitutto, l'animale è profondamente anestetizzati e fissato nel telaio stereotassico, poi il cranio sopra RSC viene diluito con un trapano lungo le linee circolari segnalati e l'osso circolare viene rimosso. Dopo l'emorragia viene arrestato,...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Farmaco
Isoflurano	Baxter	AErrane 8DG9623	5-2% preoperatorio
Isoflurano	Baxter	AErrane 8DG9623	1,5-2% durante l'intervento
chirurgico Dexametasone	Scan Vet	Dexasone 2mg/ml	0,2 mg/kg intramuscolare
Baytril	Bayer	2,50%	5 mg/kg per via sottocutanea
Tolfedina	Vetoquinolo	4%	4 mg/kg per via sottocutanea
Butomidor	Richter Pharma	10 mg/ml	2 mg/kg per via sottocutanea
Carprofene	KRKA-Polska	Rycarfa 50 mg/ml	10 mg/kg per via sottocutanea
Lidocaina	Jelfa	Lignocainum	via topica
Lidocaina	Jelfa	20 mg/g	per via topica
Chirurgia
Gelfoam	Ethicon	Spongostan dental; REF MS0005
Unguento per gli occhi	Dedra	Lubrithal	per via topica
Colla CA	Pelikan Daniel	20G Huste
Dental acrilico	SpofaDental	Duracryl Plus
Montatura stereotassica	Stoelting	51500D
Tool
Coverglass	Harvard Apparecchio	HSE-64-0720
Trapano dentale	Sigmed	Keystone KVet
Barra di fissaggio Su	misura	N/A	Potrebbero essere utilizzati dadi a vite M2 o M3
Pinze	Renex	PN-7B-SA
Micro forbici	Falcon	BM.183.180
Microscopio da dissezione	KOZO	XTL6445T
Imaging
Telaio di supporto	Microscopio N/A		a
due fotoni	Zeiss	Upright Axio Examiner Z1	Unità laser: Camaleonte coerente 690-1040nm con oscillatore parametrico ottico 1050-1300nm. Obiettivi: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 e LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Rilevamento: filtri passa-banda Zeiss BP 500-550 (GFP) e BP 570-610 (mCherry) separati da beam splitter a 560nm e accoppiati a due fotorivelatori GaAsP.
Reagente
Dono del virus	K. Deisseroth		Virus adeno-associato ricombinante (rAAV) che esprime la proteina fluorescente mCherry sotto il controllo del promotore CaMK