Articolo metodologico

Radiomarcatura e quantificazione dei livelli cellulari di fosfoinositidi da alte prestazioni cromatografia liquida accoppiata flusso scintillazione

DOI:

10.3791/53529

⸱

6 gennaio 2016

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biology, Program in Molecular Science, Ryerson University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Fosfoinositidi stanno segnalando lipidi la cui abbondanza relativa cambia rapidamente in risposta a vari stimoli. Questo articolo descrive un metodo per misurare l'abbondanza di fosfoinositidi dalle cellule metabolicamente marcatura con 3 H- myo-inositolo, seguita da estrazione e deacilazione. Estratti glycero-inositides sono quindi separati mediante cromatografia liquida ad alta prestazione e quantificati dal flusso scintillazione.

Abstract

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I fosfoinositidi (PtdInsPs) sono lipidi di segnalazione essenziali responsabili del reclutamento di effettori specifici e del conferimento di identità e funzione molecolare agli organelli. Ciascuno dei sette PtdInsP varia nella loro distribuzione e abbondanza, che sono strettamente regolate da specifiche chinasi e fosfatasi. L'abbondanza di PtdInsP può cambiare bruscamente in risposta a vari eventi di segnalazione o a disturbi del meccanismo regolatore. Per capire in che modo questi eventi portano a cambiamenti nella quantità di PtdInsP e nel loro impatto risultante, è importante quantificare i livelli di PtdInsP prima e dopo un evento di segnalazione o tra il controllo e le condizioni anomale. Tuttavia, a causa della loro bassa abbondanza e somiglianza, quantificare le quantità relative di ciascun PtdInsP può essere difficile. Questo articolo descrive un metodo per quantificare i livelli di PtdInsP marcando metabolicamente le cellule con 3H-mio-inositolo, che è incorporato in PtdInsPs. I fosfolipidi vengono quindi precipitati e deacilati. I 3-glicero-inositidi solubili risultanti vengono ulteriormente estratti, separati mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) e rilevati mediante scintillazione a flusso. L'etichettatura e l'elaborazione dei campioni di lievito sono descritte in dettaglio, così come la configurazione strumentale per l'HPLC e lo scintillatore di flusso. Nonostante la perdita di informazioni strutturali relative al contenuto di catene aciliche, questo metodo è sensibile e può essere ottimizzato per quantificare contemporaneamente tutti e sette i PtdInsP nelle cellule.

Introduzione

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I fosfoinositidi (PtdInsPs) sono importanti fosfolipidi di segnalazione che aiutano a regolare una varietà di funzioni cellulari, tra cui la trasduzione del segnale, il traffico di membrana e l'espressione genica, che quindi modulano il comportamento cellulare di ordine superiore come la divisione cellulare, l'identità degli organelli e l'attività metabolica1-3. Esistono sette specie di PtdInsP che derivano dalla fosforilazione delle posizioni 3, 4 e/o 5 del gruppo di testa dell'inositolo del fosfatidilinositolo (PtdIns), il fosfolipide genitore. È importante sottolineare che i sette PtdInsP sono distribuiti in modo diseguale e la concentrazione locale di ciascuna specie di PtdInsP può aumentare o diminuire in specifici siti subcellulari dove si legano a un insieme distinto di effettori proteici, che insieme consentono a ciascun PtdInsP di controllare l'identità e la funzione della sua membrana ospite3,4. Inoltre, i livelli di ciascun PtdInsP devono essere strettamente controllati poiché ciò può influire in modo significativo sull'intensità del segnale prodotto da un PtdInsP. La localizzazione e i livelli di ciascun PtdInsP dipendono dal targeting e dall'attività di numerose chinasi lipidiche, fosfatasi e fosfolipasi che mediano la sintesi e il turnover di ciascun PtdInsP3,4. Pertanto, un'errata regolazione del meccanismo di regolazione di PtdInsP può perturbare la funzione cellulare, portando a malattie come il cancro e le malattie degenerative2,5,6. Per comprendere appieno i ruoli e le funzioni dei PtdInsP e dei loro meccanismi regolatori, sono state sviluppate tecniche sia basate sulla microscopia che su quelle biochimiche per tracciare e quantificare i PtdInsP.

In molti casi, i PtdInsP si legano ai loro effettori proteici tramite uno specifico dominio proteico7-9. Questi moduli proteici spesso mantengono le loro corrette proprietà di ripiegamento e riconoscimento dei lipidi quando espressi separatamente dall'intera proteina. Ciò ha dato origine alle sonde PtdInsP fondendo uno specifico dominio proteico legante PtdInsP con una proteina fluorescente (FP) come la proteina fluorescente verde (GFP) per la rilevazione subcellulare di PtdInsPs mediante microscopia. Infatti, molti studi hanno utilizzato moduli proteici leganti PtdInsP fusi con FP per identificare la localizzazione e la dinamica di specifiche specie di PtdInsP mediante imaging di cellule vive1,10. Ad esempio, il dominio di omologia di Pleckstrin (PH) della fosfolipasi C δ1 (PLCδ1) fusa a GFP riconosce specificamente il fosfatidilinositolo-4,5-bisfosfato [PtdIns(4,5)P2] sulla membrana plasmatica, mentre copie tandem del dominio FYVE dell'antigene 1 dell'endosoma precoce (EEA1) sono state impiegate per tracciare il fosfatidilinositolo-3-fosfato (PtdIns3P) sugli endosomi10-13. Nel complesso, le tecniche basate sulla microscopia sono ottime per visualizzare la localizzazione e la dinamica di PtdInsP, ma ci sono diversi avvertimenti, tra cui il fatto che i domini di legame di PtdInsP possono anche interagire con fattori aggiuntivi diversi dalla specie bersaglio di PtdInsP e che non possono rilevare cambiamenti al di sotto della fluorescenza citosolica delle sonde FP.

Tecniche biochimiche tra cui cromatografia su strato sottile, spettrometria di massa e marcatura di radioisotopi possono essere utilizzate anche per caratterizzare e quantificare i livelli di ciascun PtdInsP14-16. Questi metodi richiedono l'isolamento dei lipidi per la rilevazione dei livelli cellulari di PtdInsPs. La spettrometria di massa può essere utilizzata per caratterizzare i fosfolipidi da estratti lipidici ed è preziosa per determinare la composizione della catena acilica di PtdInsPs14,17. Tuttavia, la spettrometria di massa è per lo più semi-quantitativa e rimane difficile risolvere e contemporaneamente quantificare le specie di PtdInsP dello stesso peso molecolare14,17. In confronto, la marcatura radioisotopica di PtdInsPs seguita dalla scintillazione a flusso accoppiata con cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) è utile per la separazione e la quantificazione concomitante di tutte e sette le specie di PtdInsPs18. L'uso dell'HPLC con una colonna a scambio anionico forte (SAX) consente di ottenere una separazione basata sul peso molecolare, sulla carica e sulla forma, frazionando così i PtdInsPs deacilati (Gro-InsPs) anche dello stesso peso molecolare e carica. L'accoppiamento dell'eluente HPLC a uno scintillatore di flusso genera quindi picchi di segnale su base radioattiva per ciascuna specie di Gro-InsPs rispetto al glicerolo-inositolo originario (Gro-Ins)18. Ciò corrisponde in ultima analisi ai livelli relativi di PtdInsPs nelle cellule.

La radiomarcatura di PtdInsPs e la scintillazione a flusso accoppiato a HPLC è uno strumento utile per studiare la regolazione e la funzione del fosfatidilinositolo 3,5-bisfosfato [PtdIns(3,5)P2], un PtdInsP che costituisce solo ~0,1-0,3% di PtdIns16,19,20. La sintesi di PtdIns(3,5)P2 è effettuata dalla PtdIns3P 5-chinasi chiamata Fab1 nel lievito e PIKfyve nei mammiferi21. Questa reazione è contrastata da una PtdIns(3,5)P2 5-fosfatasi chiamata Fig4 nel lievito o mFig4/Sac3 nei mammiferi22-24. È interessante notare che sia PIKfyve/Fab1 che mFig4/Fig4/Sac3 esistono in un singolo complesso e sono regolati dalla proteina adattatrice dello scaffolding, Vac14 nel lievito o mVac14/ArPIKfyve nei mammiferi25,26. Nelle cellule di lievito delate con VAC14, Fab1 non funziona in modo efficiente, portando a una diminuzione del 90% dei livelli di PtdIns(3,5)P2 27,28. D'altra parte, Atg18 è una proteina effettrice PtdIns(3,5)P2 che può controllare la fissione vacuolare 29. Atg18 è anche un regolatore negativo delle PtdIns(3,5)P2 poiché la delezione del suo gene, ATG18, provoca un aumento da 10 a 20 volte dei livelli di PtdIns(3,5)P2 29,30. Nel complesso, i cambiamenti nei livelli di PtdIns(3,5)P2 influenzano gravemente la funzione del vacuolo di lievito e dei lisosomi dei mammiferi, influenzando di conseguenza processi come il traffico di membrana, la maturazione dei fagosomi, l'autofagia e il trasporto di ioni 6,19,21,31.

Questo articolo descrive il processo di marcatura radioisotopica di PtdInsPs con 3H-mio-inositolo nel lievito per rilevare i livelli relativi di PtdIns(3,5)P2 nei ceppi di lievito wild-type, vac14Δ e atg18Δ. Usando questo come esempio, vengono mostrate le capacità risolutive dell'HPLC per la separazione dei singoli PtdInsP e la sensibilità della scintillazione del flusso per il rilevamento di tracce di 3H-mio-inositolo. Elaboriamo anche su come si potrebbe ottimizzare la metodologia per l'etichettatura e la separazione di 3PtdInsP marcati con H da cellule di mammifero, i cui campioni tendono ad essere più complessi poiché queste cellule possiedono tutte e sette le specie di PtdInsP.

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Protocollo

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Nota: Il testo seguente descrive in dettaglio un metodo per misurare PtdInsPs in lievito. Esso fornisce i dettagli sperimentali per l'etichettatura cellule di lievito con 3 H- myo inositolo, estrazione e deacilante lipidi e un protocollo HPLC-eluizione di frazionare e quantificare PtdInsPs deacilati. Si prega di notare che l'etichettatura, deacilazione, la risoluzione e la quantificazione di PtdInsPs in cellule di mammifero richiedono ottimizzazione e più profili HPLC-eluizione. Questi dettagli possono essere trovati altrove, anche se si discute alcuni aspetti nella discussione. In generale, il metodo per estrarre lipidi, deacylate ed estrarre il idrosolubile Gro-InsPs dal lievito è dato ed è illustrato in figura 1.

1. Il protocollo per l'etichettatura e Analizzare PtdInsPs in lievito

  1. Colture cellulari e radiomarcatura
    1. Crescere un 20 ml coltura liquida del SEY6210 ceppo di lievito a 30 ° C con costante agitazione in completo sinteticomezzi di fase metà log o densità ottica a 600 nm (OD 600) di circa 0,6-0,7.
      Nota: Non utilizzare supporti YPD come questo può influenzare 3 H- myo-inositolo incorporazione. Questa dimensione culturale dovrebbe fornire materiale sufficiente per 2-3 corse HPLC.
    2. Pellet un totale di 10-14 OD delle cellule di lievito (notare che 1 ml di coltura con un OD 600 = 1 contiene ~ 1x10 7 cellule) mediante centrifugazione a 800 xg per 5 min in 12 ml a fondo rotondo tubo. Risospendere con 2 ml di media liberi-inositolo (IFM) (vedi Tabella 1 per la composizione IFM).
    3. Ripetere la centrifugazione e aspirare i media. Risospendere il pellet con 440 microlitri di IFM e incubare a temperatura ambiente per 15 min.
    4. Aggiungere 60 ml di 3 H- myo-inositolo (1 ml = 1 pCi) per ogni campione e incubare alla crescente temperatura di 30 ° C per 1 a 3 ore con agitazione costante.
      Attenzione: 3 H- myo-inositolo è un compagno radioattivoriale che deve essere maneggiato dopo una formazione adeguata. Inoltre, tutti i materiali di consumo che fanno contatto con il materiale 3-H contenente devono essere smaltiti in modo appropriato e designati come rifiuti radioattivi.
      Nota: La temperatura di crescita può essere modificata secondo necessità finché tutti i ceppi da confrontare sono cresciuti alla stessa temperatura.
    5. Trasferire la sospensione cellulare (500 microlitri) in una provetta contenente 500 ml di 9% di acido perclorico e 200 ml di acido lavato perline di vetro. Mescolare per capovolgimento e incubare in ghiaccio per 5 min.
    6. Agitare il campione alla massima velocità per 10 minuti e trasferire i lisati di una nuova provetta con una punta gel loading evitare le perline di vetro.
    7. Agglomerare il campione a 12.000 xg per 10 min a 4 ° C e aspirare il surnatante.
    8. Risospendere il pellet da bagno sonicazione in 1 ml di EDTA mM ghiacciato 100. Pellet di nuovo come prima.
  2. Deacilazione ed estrazione
    1. Appena preparare 5,0 ml di reagente deacilazione combinando 2,3 ml di metanolo, 1,3 ml di 40% metilammina, 0,55 ml di 1-butanolo e 0,80 ml di acqua. Miscelarlo.
    2. Aspirare il EDTA e sonicare il pellet in 50 ml di acqua.
    3. Aggiungere 500 ml di reagente deacilazione e sonicare per mescolare. Incubare a temperatura ambiente per 20 min.
    4. Lipidi calore per 50 min a 53 ° C in un blocco di calore. Asciugare i campioni mediante centrifugazione completamente vuoto su 3 ore o O / N.
      1. Assicurarsi che una trappola chimica viene installato tra il vuoto-centrifuga e la pompa del vuoto per evitare il rilascio di vapori nell'aria.
    5. Risospendere il pellet con 300 ml di acqua da bagno sonicazione e incubare a temperatura ambiente per 20 min. Asciugare i campioni per centrifugazione vuoto per 3 ore o O / N. Ripetere questo passaggio ancora una volta.
    6. Sonicare il pellet con 450 ml di acqua. Questa è la fase acquosa durante l'estrazione.
    7. Appena preparare 10 ml di extraction reagente aggiungendo 8,0 ml di 1-butanolo, 1,6 ml di etere etilico e 0,40 ml di etile formiato. Miscelarlo.
    8. Aggiungere 300 ml di reagente di estrazione alla fase acquosa. Vortex la miscela alla massima velocità per 5 minuti e separare gli strati per centrifugazione a velocità massima (18.000 xg) per 2 min.
    9. Raccogliere la fase acquosa inferiore in un nuovo tubo per microcentrifuga evitando lo strato superiore organico, l'interfaccia, ed il pellet. Ripetere l'estrazione della fase acquosa due volte con il reagente di estrazione fresca.
    10. Completamente asciugare lo strato acquoso raccolte mediante centrifugazione sotto vuoto. Disperdere il pellet in 50 ml di acqua per il bagno ultrasuoni.
    11. Aggiungere 2 ml di ogni campione 4 ml di liquido di scintillazione in 6 ml di polietilene scintillazione flaconcino. Determinare il numero di conteggi (in CPM) in ogni campione da scintillazione liquida utilizzando una finestra aperta.
    12. Conservare i campioni a -20 ° C fino al momento HPLC.
  3. Separazione3 H-glycero-inositides mediante HPLC
    1. Preparare tampone A filtrando 1 L di acqua ultrapura con una bottiglia superiore del filtro 0,22 micron di vuoto, seguita da degassaggio.
    2. Preparare tampone B facendo una soluzione di 1 L di 1 M di ammonio fosfato bibasico (APS, MW 132.06) in acqua e regolare il pH a 3,8 con acido fosforico. Filtrare il fosfato di ammonio con una bottiglia superiore del filtro 0,22 micron di vuoto, seguita da degassaggio.
    3. Montare il flaconcino da allestimento un flaconcino da 2 ml con una 250 microlitri inserto piccolo volume a molla. Caricare 10 milioni CPM e aggiungere acqua per un volume totale di 55 microlitri. Preparare una fiala vuota con 55 ml di acqua.
    4. Tappare le fiale con tappi a vite attrezzati con setti in PTFE / silicone (lato rosso rivolto verso l'interno del flaconcino). Mettete ogni fiala nel vassoio di auto-campionamento della HPLC, iniziando con il flaconcino vuoto.
    5. Utilizzare un HPLC e software associato che controlla il flusso di buffer, degassa tamponi e controlli campione iniezin data. Utilizzare un scintillatore flusso in linea e il suo software associato per regolare la portata scintillante e monitorare il segnale 3 H-decadimento.
      1. Utilizzare una colonna SAX cromatografia liquida con dimensioni di 250 mm x 4.6 mm e contenenti 5 micron resina silice nella HPLC. Allestire la colonna con una guardia colonna per evitare l'iniezione di contaminanti.
      2. Installare una cella di flusso 500 microlitri compatibile-H 3 in scintillatore flusso.
        NOTA: Il frazionamento può essere fatto con un sistema della serie 1200 Agilent sfioro HPLC controllato dal software Chemstation o con altri sistemi HPLC disponibili commercialmente. Scintillazione flusso dell'eluente HPLC può essere fatto con un flusso scintillatore β-RAM controllato dal software Laura o un'altra scintillatore flusso disponibile in commercio o software compatibile.
    6. Inizializzare la pompa quaternaria a una portata di 1,0 ml / min con 100% tampone A.
    7. Impostare un profilo di equilibrio in HPLCper controllare il gradiente di buffer A e B (chiamare questo "Protocollo A equilibrazione"): 1% Tampone B per 5 min, 1-100% B per 5 min, 100% B per 5 min, 100-1% B per 5 min, 1% B per 20 min. Impostare il limite di pressione di 400 bar, 1,0 ml / min, e 30 minuti il ​​tempo di esecuzione.
    8. Impostazione di un profilo di eluizione (figura 2) sulla HPLC per controllare il gradiente di buffer A e B (chiamare questo "Protocollo A"): 1% B per 5 min, 1-20% B per 40 min, 20-100% B per 10 min, 100% B per 5 min, 100-1% B per 20 minuti, 1% B per 10 min. Impostare il limite di pressione di 400 bar, 1,0 ml / min, e 90 minuti il ​​tempo di esecuzione.
    9. Impostare un protocollo di rilevazione sul flusso di scintillatore (chiamare questo "Protocollo A rilevamento") a correre per 60 minuti, con una portata di fluido di scintillazione di 2,5 ml / min e un tempo di sosta 8.57 sec.
    10. Programmare una sequenza di iniezione automatizzato sul HPLC per iniziare con il bianco acqua sul "Protocollo Un equilibrio", seguito da each radiomarcato campione sul "Protocollo A". Inizializzare la sequenza quando è pronto.
    11. Mentre la marcia è sempre sul protocollo equilibrazione, creare un lotto sulla scintillatore flusso per misurare tutti i campioni con "protocollo di rivelazione." L'iniezione di ogni nuovo campione verrà inizializzato "Protocollo A" sul HPLC mentre scattare l'scintillatore flusso per iniziare "Protocollo di rivelazione."
    12. Al completamento di tutte le corse, lavare l'HPLC, la colonna e il flusso scintillatore con 100% tampone A per 30 minuti a 1,0 ml / min di portata.
  4. Analisi dei dati
    1. Utilizzare il software Laura o qualsiasi altro software in grado di quantificare gli spettri cromatografia. I passaggi descritti in questa sezione sono descritte nella Figura 3.
    2. Aprire i file facendo clic su "File", "Apri", e selezionare il file di dati grezzi per ogni campione.
    3. Nella scheda "cromatogrammi", zoom per allungare ciascuno dei picchi minori (circa 1000 conteggi [y]) pur mantenendo la risoluzione temporale. Zoom in ogni singolo picco se necessario.
    4. Evidenziare ciascuno dei picchi per l'analisi tramite funzione "Aggiungi ROI". Identificare i picchi dal tempo di eluizione: Parental Gro-Ins a 10 min, Gro-Ins3P a 18 min, Gro-Ins4P a 20 min, Gro-Ins (3,5) P 2 a 29 min e Gro-Ins (4,5 ) P 2 a 32 min.
    5. Nella scheda "tabelle regioni", registrare la "zona (conta)" di ogni picco. Notare la "start (mm: ss)" il tempo e "finale (mm: ss)" tempo di ogni picco.
    6. Per sottrazione dello sfondo, evidenziare una regione adiacente al picco attraversa la stessa quantità di tempo. Sottrarre il numero di conteggi del picco corrispondente.
    7. Normalizzare l'area di ogni picco contro genitori Gro-Ins (espresso come "% del totale PtdIns"). Poi, normalizzare ciascuno dei picchi in ogni condizione sperimentale contro la condizione di controllo (espresso come "naumento -fold confrontato con il controllo ").
      NOTA: La normalizzazione di ogni picco può essere effettuata anche contro conteggi totali, ma dal momento che la genitori Gro-Ins è molto più abbondante di tutti gli altri PtdInsPs i risultati tendono ad essere simili.
    8. Esportare i dati per la cromatografia premendo il tasto "File", "Salva con nome ..." e scegliere il "CSV (separati da virgola)" formato di file. Tracciare i dati su un foglio di calcolo e presentare come necessario.

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Risultati

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Utilizzando questo metodo, PtdInsPs lievito sono state metabolicamente etichettati con 3 H- myo-inositolo. Dopo etichettatura, i fosfolipidi sono stati precipitati con acido perclorico, seguita da deacilazione fosfolipidi ed estrazione del Gro-InsPs idrosolubile (Figura 1). In questa fase, è importante quantificare il totale del segnale radioattivo associato al estratta Gro-InsPs scintillazione liquida per garantire una sufficiente rapporto segnale-ru...

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Discussione

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Questo articolo descrive il protocollo sperimentale richiesta per quantificare i livelli cellulari di PtdnsPs mediante HPLC accoppiata flusso scintillazione dal lievito. La metodologia consente di marcatura metabolica di PtdInsPs con 3 H- myo-inositolo, seguite da trattamento di lipidi ed estrazione di solubile in acqua 3 H-Gro-InsPs, HPLC frazionamento e analisi. Utilizzando questo metodo, i relativi livelli di PtdInsPs nelle cellule in varie condizioni sono quantificabili, come dimostra ...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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C.Y.H. è stato supportato da una borsa di studio per laureati dell'Ontario dal governo dell'Ontario. Questo articolo è stato reso possibile grazie ai finanziamenti detenuti da R.J.B. dal Natural Sciences and Engineering Research Council, dal Canada Research Chairs Program e dalla Ryerson University.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1-butanoloBiobasicBC1800Grado reagente
Fosfato di ammonio bibasicoBioshopAPD001
Solfato di ammoniodi grado ACS Autocampionatore di grado ultrapuro BiobasicADB0060
AgilentG1329BAgilent 1260 serie infinity
BiotinaSigmaB4501
Acido boricoBiobasicBB0044Cloruro di calcio di grado di biologia molecolare
BiobasicCT1330Pantotenato di calcio aidro di grado industriale
SigmaC8731
Solfato di rame (II)Sigma451657D-glucosio anidro
BiobasicGB0219Anidro, di grado biotecnologico
Modifica di Dulbecco Eagle's MediumLife11995-065Con 4,5 g/L di glucosio, 110 mg/L di piruto, L-glutammina
Modifica di Dulbecco di Eagle's MediumMP biomedicals0916429 Con 4,5 g/L di glucosio, senza L-gluatmina, senza inositolo
EDTABiobasicEB0107di grado ultra puro
senza acidi Caledon labs1/10/4700Anidro, grado reattivo
Formiato di etileSigma112682Grado reagente
Siero fetale bovinoWisent080-450origine USA, qualità premium, inattivato termicamente
Siero fetale bovino26400044Stati Uniti, vita dializzata origine
FlowLogic ULabLogic Systems LtdSG-BXX-05Fluido di scintillazione per la scintillazione di flusso 
Acido folicoHEPES biobasicaFB0466Grado USP
Life156300801 M Soluzione
Inositolo, Myo-[2-3H(N)]Perkin ElmerNET114005MC9:1 etanolo in acqua
Insulina-transferrina-selenio-etanolamminaLife51500056Soluzione 100x
Cloruro di ferro (III)Sigma157740Reagente grado
Laura - Software per la raccolta e l'analisi dei dati cromatograficiLabLogic Systems LtdVersione 4.2.1.18Software per scintillatore di flusso
L-glutamminaSigmaG7513200  mM, soluzione, filtrato sterile, BioXtra, adatto per colture cellulari
Cloruro di magnesioSigmaM8266
Solfato di manganeseBiobasicMB0334Monoidrato, grado ACS
MetanoloCaledon labs6701-7-40grado HPLC
Sigma42646640% (v/v)
FosfatomonopotassicoBiobasicPB0445Anidro, grado ACS
Acido nicotinicoBiobasicNB0660Reagente
grado OpenLAB CSD ChemStation AgilentRev. C.01.03 Software HPLC
acido p-aminobenzoico (PABA)BioshopPAB001.100Acido libero
Penicillina-streptomicinaSigmaP4333100X, liquido, stabilizzato, filtrato sterile, testato in coltura cellulare
Acido percloricoSigma244252reagente ACS, 70%
Colonna PhenoSpher SAXPhenomenex00G-315-E05 &; m, 80 Å, 250 x 4,6 mm
Acido fosforicoCaledon labs1/29/8425Grado reagente
Cloruro di potassioBiobasicPB0440Ioduro di
potassioGrado ACS BiobasicPB0443Grado ACS
Piridossina cloridratoSigmaP9755
Pompa quaternariaAgilentG1311CAgilent 1260 serie infinity
RiboflavinaBioshopRIB333.100
Cloruro di sodioBiobasicDB0483Molibdato di sodio di grado biotecnologico
Sigma243655
Scomparto colonna termostatataAgilentG1316AAgilent 1260 serie infinity
Tiamina cloridratoSigmaT4625Grado del reagente; fare una soluzione di 0,02% (p/v), forma una sospensione. mescolare e congelare aliquote
Ultima GoldPerkin Elmer6013321Scintillazione coctail per il conteggio della scintillazione liquida
Solfato di zincoBiobasicZB2906Eptaidrato, grado reagente
β-RAM 4Sistemi IN/USModello 4Scintillatore a flusso - 500 µ l cella di flusso; Analizzatore a scintillatore di flusso radiomatico alternativo di Perkin Elmer
Etere etilico Soluzione tampone anidro Soluzione di metilammina di di grado USP

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
  2. Bridges, D., Saltiel, A. R. Phosphoinositides and Disease. Curr. Top. Microbiol. Immuno. 362, 61-85 (2012).
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