Fosfoinositidi stanno segnalando lipidi la cui abbondanza relativa cambia rapidamente in risposta a vari stimoli. Questo articolo descrive un metodo per misurare l'abbondanza di fosfoinositidi dalle cellule metabolicamente marcatura con 3 H- myo-inositolo, seguita da estrazione e deacilazione. Estratti glycero-inositides sono quindi separati mediante cromatografia liquida ad alta prestazione e quantificati dal flusso scintillazione.
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Articolo metodologico
Radiomarcatura e quantificazione dei livelli cellulari di fosfoinositidi da alte prestazioni cromatografia liquida accoppiata flusso scintillazione
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I fosfoinositidi (PtdInsPs) sono lipidi di segnalazione essenziali responsabili del reclutamento di effettori specifici e del conferimento di identità e funzione molecolare agli organelli. Ciascuno dei sette PtdInsP varia nella loro distribuzione e abbondanza, che sono strettamente regolate da specifiche chinasi e fosfatasi. L'abbondanza di PtdInsP può cambiare bruscamente in risposta a vari eventi di segnalazione o a disturbi del meccanismo regolatore. Per capire in che modo questi eventi portano a cambiamenti nella quantità di PtdInsP e nel loro impatto risultante, è importante quantificare i livelli di PtdInsP prima e dopo un evento di segnalazione o tra il controllo e le condizioni anomale. Tuttavia, a causa della loro bassa abbondanza e somiglianza, quantificare le quantità relative di ciascun PtdInsP può essere difficile. Questo articolo descrive un metodo per quantificare i livelli di PtdInsP marcando metabolicamente le cellule con 3H-mio-inositolo, che è incorporato in PtdInsPs. I fosfolipidi vengono quindi precipitati e deacilati. I 3-glicero-inositidi solubili risultanti vengono ulteriormente estratti, separati mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) e rilevati mediante scintillazione a flusso. L'etichettatura e l'elaborazione dei campioni di lievito sono descritte in dettaglio, così come la configurazione strumentale per l'HPLC e lo scintillatore di flusso. Nonostante la perdita di informazioni strutturali relative al contenuto di catene aciliche, questo metodo è sensibile e può essere ottimizzato per quantificare contemporaneamente tutti e sette i PtdInsP nelle cellule.
Introduzione
I fosfoinositidi (PtdInsPs) sono importanti fosfolipidi di segnalazione che aiutano a regolare una varietà di funzioni cellulari, tra cui la trasduzione del segnale, il traffico di membrana e l'espressione genica, che quindi modulano il comportamento cellulare di ordine superiore come la divisione cellulare, l'identità degli organelli e l'attività metabolica1-3. Esistono sette specie di PtdInsP che derivano dalla fosforilazione delle posizioni 3, 4 e/o 5 del gruppo di testa dell'inositolo del fosfatidilinositolo (PtdIns), il fosfolipide genitore. È importante sottolineare che i sette PtdInsP sono distribuiti in modo diseguale e la concentrazione locale di c....
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Protocollo
Nota: Il testo seguente descrive in dettaglio un metodo per misurare PtdInsPs in lievito. Esso fornisce i dettagli sperimentali per l'etichettatura cellule di lievito con 3 H- myo inositolo, estrazione e deacilante lipidi e un protocollo HPLC-eluizione di frazionare e quantificare PtdInsPs deacilati. Si prega di notare che l'etichettatura, deacilazione, la risoluzione e la quantificazione di PtdInsPs in cellule di mammifero richiedono ottimizzazione e più profili HPLC-eluizione. Questi dettagli possono essere trovati altrove, anche se si discute alcuni aspetti nella discussione. In generale, il metodo per estrarre lipidi, deacylate ed estr....
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Risultati
Utilizzando questo metodo, PtdInsPs lievito sono state metabolicamente etichettati con 3 H- myo-inositolo. Dopo etichettatura, i fosfolipidi sono stati precipitati con acido perclorico, seguita da deacilazione fosfolipidi ed estrazione del Gro-InsPs idrosolubile (Figura 1). In questa fase, è importante quantificare il totale del segnale radioattivo associato al estratta Gro-InsPs scintillazione liquida per garantire una sufficiente rapporto segnale-ru.......
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Discussione
Questo articolo descrive il protocollo sperimentale richiesta per quantificare i livelli cellulari di PtdnsPs mediante HPLC accoppiata flusso scintillazione dal lievito. La metodologia consente di marcatura metabolica di PtdInsPs con 3 H- myo-inositolo, seguite da trattamento di lipidi ed estrazione di solubile in acqua 3 H-Gro-InsPs, HPLC frazionamento e analisi. Utilizzando questo metodo, i relativi livelli di PtdInsPs nelle cellule in varie condizioni sono quantificabili, come dimostra .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
C.Y.H. è stato supportato da una borsa di studio per laureati dell'Ontario dal governo dell'Ontario. Questo articolo è stato reso possibile grazie ai finanziamenti detenuti da R.J.B. dal Natural Sciences and Engineering Research Council, dal Canada Research Chairs Program e dalla Ryerson University.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1-butanolo | Biobasic | BC1800 | Grado reagente |
| Fosfato di ammonio bibasico | Bioshop | APD001 | |
| Solfato di ammonio | di grado ACS Autocampionatore di grado ultrapuro Biobasic | ADB0060 | |
| Agilent | G1329B | Agilent 1260 serie infinity | |
| Biotina | Sigma | B4501 | |
| Acido borico | Biobasic | BB0044 | Cloruro di calcio di grado di biologia molecolare |
| Biobasic | CT1330 | Pantotenato di calcio aidro di grado industriale | |
| Sigma | C8731 | ||
| Solfato di rame (II) | Sigma | 451657 | D-glucosio anidro |
| Biobasic | GB0219 | Anidro, di grado biotecnologico | |
| Modifica di Dulbecco Eagle's Medium | Life | 11995-065 | Con 4,5 g/L di glucosio, 110 mg/L di piruto, L-glutammina |
| Modifica di Dulbecco di Eagle's Medium | MP biomedicals | 0916429 | Con 4,5 g/L di glucosio, senza L-gluatmina, senza inositolo |
| EDTA | Biobasic | EB0107 | di grado ultra puro |
| senza acidi Caledon labs | 1/10/4700 | Anidro, grado reattivo | |
| Formiato di etile | Sigma | 112682 | Grado reagente |
| Siero fetale bovino | Wisent | 080-450 | origine USA, qualità premium, inattivato termicamente |
| Siero fetale bovino | 26400044 | Stati Uniti, vita dializzata origine | |
| FlowLogic U | LabLogic Systems Ltd | SG-BXX-05 | Fluido di scintillazione per la scintillazione di flusso |
| Acido folico | HEPES biobasica | FB0466 | Grado USP |
| Life | 15630080 | 1 M Soluzione | |
| Inositolo, Myo-[2-3H(N)] | Perkin Elmer | NET114005MC | 9:1 etanolo in acqua |
| Insulina-transferrina-selenio-etanolammina | Life | 51500056 | Soluzione 100x |
| Cloruro di ferro (III) | Sigma | 157740 | Reagente grado |
| Laura - Software per la raccolta e l'analisi dei dati cromatografici | LabLogic Systems Ltd | Versione 4.2.1.18 | Software per scintillatore di flusso |
| L-glutammina | Sigma | G7513 | 200 mM, soluzione, filtrato sterile, BioXtra, adatto per colture cellulari |
| Cloruro di magnesio | Sigma | M8266 | |
| Solfato di manganese | Biobasic | MB0334 | Monoidrato, grado ACS |
| Metanolo | Caledon labs | 6701-7-40 | grado HPLC |
| Sigma | 426466 | 40% (v/v) | |
| Fosfato | monopotassicoBiobasic | PB0445 | Anidro, grado ACS |
| Acido nicotinico | Biobasic | NB0660 | Reagente |
| grado OpenLAB CSD ChemStation | Agilent | Rev. C.01.03 | Software HPLC |
| acido p-aminobenzoico (PABA) | Bioshop | PAB001.100 | Acido libero |
| Penicillina-streptomicina | Sigma | P4333 | 100X, liquido, stabilizzato, filtrato sterile, testato in coltura cellulare |
| Acido perclorico | Sigma | 244252 | reagente ACS, 70% |
| Colonna PhenoSpher SAX | Phenomenex | 00G-315-E0 | 5 &; m, 80 Å, 250 x 4,6 mm |
| Acido fosforico | Caledon labs | 1/29/8425 | Grado reagente |
| Cloruro di potassio | Biobasic | PB0440 | Ioduro di |
| potassio | Grado ACS Biobasic | PB0443 | Grado ACS |
| Piridossina cloridrato | Sigma | P9755 | |
| Pompa quaternaria | Agilent | G1311C | Agilent 1260 serie infinity |
| Riboflavina | Bioshop | RIB333.100 | |
| Cloruro di sodio | Biobasic | DB0483 | Molibdato di sodio di grado biotecnologico |
| Sigma | 243655 | ||
| Scomparto colonna termostatata | Agilent | G1316A | Agilent 1260 serie infinity |
| Tiamina cloridrato | Sigma | T4625 | Grado del reagente; fare una soluzione di 0,02% (p/v), forma una sospensione. mescolare e congelare aliquote |
| Ultima Gold | Perkin Elmer | 6013321 | Scintillazione coctail per il conteggio della scintillazione liquida |
| Solfato di zinco | Biobasic | ZB2906 | Eptaidrato, grado reagente |
| β-RAM 4 | Sistemi IN/US | Modello 4 | Scintillatore a flusso - 500 µ l cella di flusso; Analizzatore a scintillatore di flusso radiomatico alternativo di Perkin Elmer |
Riferimenti
- Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
- Bridges, D., Saltiel, A. R. Phosphoinositides and Disease. Curr. Top. Microbiol. Immuno. 362, 61-85 (2012).
- Botelho, R. J.
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Ristampe e permessi
