Al fine di identificare nuove mutazioni che influenzano la meccanosensazione, abbiamo progettato un test che misura la risposta comportamentale alla stimolazione tattile delle setole di mosca nei cloni mutanti generati dal metodo MARCM. La combinazione di tecniche consente l'identificazione di mutazioni meccanosensibili che altrimenti sarebbero letali.
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Articolo metodologico
Un test comportamentale per Mechanosensation di cloni in marcm-based
In questo articolo
Sommario
Abstract
A causa della omologia strutturale e funzionale alle cellule ciliate dell'orecchio interno dei mammiferi, i neuroni che innervano i Drosophila organi di senso esterni forniscono un eccellente sistema modello per lo studio della mechanosensation. Questo protocollo descrive un semplice tocco di comportamento nei moscerini della frutta che possono essere utilizzati per identificare le mutazioni che interferiscono con mechanosensation. La stimolazione tattile di una macrochaete setola sul torace di mosche provoca un riflesso governare sia dal primo o terza gamba. Le mutazioni che interferiscono con mechanotransduction (come NOMPC), o con altri aspetti della dell'arco riflesso, possono inibire la risposta governare. Uno schermo tradizionale di comportamenti adulti avrebbe perso mutanti che hanno un ruolo essenziale durante lo sviluppo. Invece, questo protocollo combina il touch screen con analisi mosaico con un marker delle cellule reprimibile (marcm) per consentire solo le regioni limitate di cellule mutanti omozigoti per essere generato e segnata dalla exprESSIONE di proteina fluorescente verde (GFP). Testando cloni marcm per risposte comportamentali anomali, è possibile programmare una collezione di mutazioni p-elemento letali per la ricerca di nuovi geni coinvolti nella mechanosensation che sarebbero state perse con i metodi più tradizionali.
Introduzione
Gli esseri umani si affidano alla capacità di convertire gli stimoli meccanici provenienti dal loro ambiente, come il tatto, la pressione, la vibrazione o le onde sonore, in informazioni sensoriali che possono essere elaborate dal sistema nervoso, in un processo chiamato meccanotrasduzione. Molte delle caratteristiche meccanicistiche generali della meccanotrasduzione tra esseri umani e invertebrati sonole stesse, rendendo la Drosophila un modello utile per studiare i meccanismi molecolari della meccanotrasduzione. La Drosophila melanogaster contiene due serie di organi sensoriali specializzati (Tipo I e II) che sono in grado di convertire gli stimoli meccanici in potenziali d'azione. I meccanocettori di tipo I hanno un neurone con un singolo dendrite o processo sensoriale, circondato da tre cellule di supporto2. I meccanocettori di tipo I includono meccanocettori a setole, organi cordotonali sensibili all'udito (l'organo di Johnston) e sensilli campaniformi che trasmettono informazioni sui battiti delle ali3. Le setole che ricoprono il lato dorsale della mosca sono le più abbondanti e facilmente accessibili degli organi di Tipo I. Simile all'ambiente extracellulare delle cellule ciliate associato all'udito e all'equilibrio nei vertebrati, le cellule di supporto che circondano i neuroni meccanosensibili alla mosca secernono un'endolinfa ad alto contenuto di potassio che crea un insolito gradiente di concentrazione per il potassio1. I neuroni meccanosensibili, sia del sistema dei mammiferi che di quello dei moscerini, utilizzano questo alto potassio extracellulare per depolarizzare la cellula. In risposta alla stimolazione meccanica delle setole dei macrocheti verso la parete del corpo, i neuroni sensoriali rispondono con un'esplosione di potenziali d'azione guidati da questa depolarizzazione del potassio della membrana cellulare4. I neuroni sensoriali di Drosophila che innervano le setole assomigliano alle cellule meccanosensibili di altri organismi, comprese le cellule ciliate dei vertebrati, sia nella struttura che nella funzione1,5. L'accessibilità degli organi di senso esterni della Drosophila alla manipolazione sperimentale e l'abbondanza di tecniche genetiche a disposizione dei ricercatori fanno della Drosophila un eccellente sistema modello per studiare le basi molecolari della meccanosensazione.
Nel volo, la stimolazione di un singolo neurone sensoriale che innerva una setola porta a una risposta comportamentale osservabile. La stimolazione di setole diverse evoca risposte comportamentali specifiche e riproducibili, a seconda della setola che viene stimolata. Dopo la stimolazione tattile, le mosche selvatiche decapitate mostrano un complesso riflesso di toelettatura in cui puliscono l'area vicino alla setola stimolata con una serie di movimenti delle gambe5-7. Quando sono omozigoti per mutazioni note di un singolo gene che interferiscono con l'apprendimento7 o la coordinazione e l'attività locomotoria5, i moscerini rispondono in modo anomalo alla stimolazione meccanica. Questo riflesso di grooming è quindi uno strumento utile per studiare gli effetti delle mutazioni di un singolo gene su un comportamento specifico e replicabile.
La robusta risposta comportamentale alla stimolazione di una singola setola macrocheta ha il potenziale per aiutare a identificare nuovi geni coinvolti nella meccanotrasduzione. Questo protocollo viene utilizzato per testare una collezione di mosche mutanti per l'assenza di una risposta comportamentale che indichi che la mutazione interferisce con la meccanosensazione. Nella collezione di mutanti selezionata per lo screening, le mutazioni causano letalità prima dell'età adulta e quindi sarebbero impossibili da testare utilizzando i tradizionali screening comportamentali degli adulti. Originariamente, questa raccolta di p-elementi letali è stata combinata con siti di ricombinazione FRT per testare i difetti di crescita cellulare nei cloni. I cloni sono stati creati specificamente nell'occhio perché i moscerini adulti possono sopravvivere in laboratorio senza una visione funzionale8. Tuttavia, la rimozione di tutte le meccanosensazioni può causare una grave scoordinazione o la morte degli adulti prima dell'eclosion5. Questo protocollo utilizza un approccio a mosaico per eludere la letalità delle mutazioni e consentire test in stadio adulto. Una tecnica genetica chiamata Analisi del mosaico con un marcatore cellulare repressibile (MARCM)9 viene utilizzata per generare cellule mutanti omozigoti in un numero limitato di organi sensoriali di moscerini adulti, mentre il resto dell'organismo rimane eterozigote. Queste mosche MARCM sopravvivono facilmente fino all'età adulta, ma le setole sono omozigoti per i geni letali di interesse.
MARCM consente di generare regioni di cellule mutanti omozigoti e contrassegnate dall'espressione della proteina fluorescente verde (GFP), mentre il resto dell'organismo rimane eterozigote in quel particolare locus e non marcato9. MARCM combina singole mutazioni dell'elemento p con cinque elementi genetici comuni: GFP sotto il controllo di una sequenza attivante a monte (UAS-GFP), proteina repressore Gal80 sotto il controllo di un promotore generale (tub-Gal80), fattore di trascrizione Gal4 sotto il controllo di un promotore generale (tub-Gal4), l'enzima ricombinasi FRT espresso attraverso un promotore controllato da shock termico e un sito di ricombinazione FRT10. Guidando la ricombinazione mitotica attraverso una ricombinasi attivata da shock termico, un numero limitato di cellule viene reso omozigote per la mutazione e marcato con GFP. L'espressione della GFP è repressa nelle cellule eterozigoti dalla presenza di Gal80 sulla copia wild-type del cromosoma.
Un protocollo di shock termico per MARCM è stato ottimizzato per indurre la ricombinazione negli organi di senso esterni delle setole del moscerino, mentre gran parte dell'organismo rimane eterozigote e quindi non marcato con GFP. I moscerini a mosaico generati utilizzando questo protocollo contenevano mutazioni omozigoti più frequentemente nelle setole centrali post alari o dorsali sulla superficie del noto.
Abbiamo testato l'utilità di questa combinazione di MARCM e lo schermo del comportamento di toelettatura con un noto mutante meccanosensibile, NOMPC. Il canale ionico, senza potenziale meccanocettore C (NOMPC), è un componente essenziale della via di meccanotrasduzione in Drosophila5,11-13. NOMPC appartiene alla superfamiglia dei canali cationici5 del potenziale recettoriale transitorio (TRP) e soddisfa tutti i criteri per qualificarsi come canale meccanosensibile in Drosophila14,15: 1) NOMPC è espresso nelle punte ciliate dei neuroni sensoriali di tipo 1 di Drosophila 13,16-18, 2) Le larve nulle di NOMPC non hanno una risposta elettrica alla stimolazione tattile13, 3) L'espressione ectopica di NOMPC in cellule sensibili al tocco può indurre sensibilità alla stimolazione meccanica13, 4) l'espressione eterologa di NOMPC nelle cellule Schneider 2 produce un canale meccanosensibile13, e 5) i mutanti adulti di NOMPC mostrano difetti nella loro risposta alla stimolazione meccanica5. Alla luce di queste evidenze, abbiamo previsto che i cloni mutanti NOMPC avrebbero mostrato una risposta di grooming alterata o inibita in risposta alla stimolazione meccanica delle setole.
Un ceppo MARCM contenente la mutazione NOMPC è stato sviluppato per l'uso in un esperimento di prova di principio del test di toelettatura. I moscerini a mosaico sono stati stimolati su setole macrochetiche contenenti cellule mutanti NOMPC omozigoti. Ci aspettavamo un'inibizione della risposta di toelettatura in seguito alla stimolazione della setola macrocheta. Abbiamo scoperto che solo 2 delle 14 mosche con setole mutanti testate hanno dato una singola risposta alla stimolazione ripetuta; La maggior parte non ha risposto alla stimolazione della setola mutante omozigote. Avendo confermato che questo test comportamentale basato su MARCM produce un riflesso di grooming anomalo in un noto mutante a mosaico meccanosensibile, questa tecnica può essere utilizzata in uno screening per ulteriori mutazioni meccanosensibili.
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Protocollo
1. Croci per generare mosche marcm
- Mantenere mosche sulla melassa supporti farina di mais (6,5 g / l di agar; 23,5 g / L di lievito; 60 g / L di farina di mais, 60 ml / L melassa; 4 ml / miscela acido L; 0,13% Tegosept) o supporti Drosophila norma a 22 gradi Celsius in una luce 12 ore / ciclo scuro.
Nota: A inferiore ad una temperatura standard viene utilizzato per mantenere marcm-scorte sano. Questo si estende il tempo di sviluppo fra l'uovo e l'età adulta a 14 giorni. - Utilizzare femmine vergini (circa 1 - 8 giorni di età) da uno stock marcm-ready contenente gli elementi genetici necessari (GFP sotto il controllo di una sequenza upstream-attivazione (UAS-GFP), la proteina repressore Gal80, il fattore di trascrizione Gal4, un shock termico ricombinasi guidato, e una ricombinazione sito FRT).
Nota: Il nostro marcm ready-titoli contengono i seguenti genotipi: elavGal4, UAS-CD8-GFP, hs-flipase; FRT40A, tubGal80 / cyo; tubGal4 / TM3Sb.
Nota: Il sito FRT specifico dipenderà dalla posizione della mutazionenel genoma. Ad esempio, FRT40A è utilizzato per testare le mutazioni sul braccio sinistro del cromosoma 2, come NOMPC (vedi 10 per maggiori dettagli sui protocolli marcm). - Croce marcm-ready femmine vergini per i maschi che contengono una mutazione di interesse e il suo sito FRT corrispondente (ad esempio, W-, NOMPC3, FRT40A / cyo; + / +). Per controllare per l'induzione marcm efficace, impostare una seconda croce con le mosche di sesso maschile che contengono lo stesso sito FRT, ma senza una mutazione. Utilizzare un rapporto approssimativo di 5 femmine: 1 maschio in croci.
2. Timed ovaiole
- Dopo aver lasciato le mosche di accoppiarsi per almeno una notte, spostare gli adulti in nuove flaconcini con mezzi freschi. Lasciare le mosche di deporre le uova in un ambiente scuro per circa 4 ore prima di nuovo trasferire le croci in nuove fiale. Nota i tempi di inizio e di fine del periodo di deposizione delle uova.
Nota: gli intervalli più brevi sono accettabili quando sembra che vi sia un alto numero di uova sui media prima della fine del interva di 4 orel.- Tenere i flaconcini con un numero sufficiente di uova (circa maggiore di 20) e conservare in una luce 12 ore / buio ciclo a 22 gradi centigradi per essere il calore scioccato più tardi.
Nota: Fiale con un basso numero di uova sul supporto (inferiore a circa 20) sono difficilmente danno un numero sufficiente di mosche adulte per i test comportamentali e nell'interesse di efficienza si consiglia di non che essere conservati per ulteriori test.
Nota: I nostri mosche sono allevati con le luci accese 08:00-20:00. Abbiamo trovato il tempo serata punti portano a densità più elevate di uova, quindi di solito eseguire incroci cronometrati tra 4-8 PM e 8:00 a mezzanotte. Le mosche depongono le loro uova a RT in un armadio buio ed sono restituiti al incubatore il giorno seguente in modo da non disturbare il normale ciclo luce-buio nell'incubatrice.
- Tenere i flaconcini con un numero sufficiente di uova (circa maggiore di 20) e conservare in una luce 12 ore / buio ciclo a 22 gradi centigradi per essere il calore scioccato più tardi.
3. Eseguire Shock termico per indurre Mitotic Ricombinazione
- Circa 85-100 ore dopo la deposizione delle uova, luogo vIALS in un bagno d'acqua a 37 ° C per 1 ora. Assicurarsi che il livello dell'acqua raggiunge sopra l'altezza media in fiale, ma non annulla completamente le fiale per evitare che le larve dall'annegamento.
- Rimuovere le fiale da bagno di acqua e consentire un periodo di recupero 1 ora a temperatura ambiente.
- Luogo fiale indietro in 37 ° C bagnomaria per 1 ora.
- Rimuovere le fiale da bagnomaria e conservare in incubatrice in luce 12 ore / buio ciclo a 22 ° C fino eclosion.
4. Preparazione per il test comportamentale
- A seguito di eclosion, anestetizzare mosche sul ghiaccio. Selezionare mosche con genotipi che contengono tutti gli elementi genetici per marcm e indicano probabilmente essere osservati GFP cloni di espressione-segnato in base ai marcatori fenotipici osservabili utilizzati nelle scorte genitori. Decapitare mosche con iridectomia forbici.
Nota: Per esempio, abbiamo selezionato per le mosche, senza i marcatori genetici cyo (ali graffe) e Sb (setola stoppie) per identimosche fy che contengono tutti gli elementi genetici necessari per creare le regioni mosaico contrassegnati con GFP.
Nota: La decapitazione è necessaria per evitare che le adulti di volare via quando stimolato. - Posizionare mosche senza testa in un ambiente umido chiuso e consentire circa 10 - 20 ore di recupero. Solo uso vola tale diritto se stessi quando perturbato per ulteriori test. Prova vola entro 30 ore della decapitazione.
5. Test comportamentale
- Osservando mosche decapitati sotto un microscopio a fluorescenza dissezione, identificare i cloni omozigoti contrassegnati con GFP ai setola organi sensoriali esterni. Registrare il nome setole e lato sinistro o destro. Per eliminare ogni pregiudizio potenziale, il membro del laboratorio di eseguire la stimolazione setole dovrebbe essere ciechi per il genotipo del setola, wild-type o mutante.
- Suscitare una reflex grooming deviando la GFP contrassegnato setole verso il corpo volo con un capello rigido o una pinza sottile e osservare la ri gambarisposta. Dare un punteggio da uno a mosche che sollevare la gamba in risposta alla stimolazione setole e un punteggio pari a zero per le mosche che non si muovono le gambe.
Nota: Precedente studi 6,7 hanno caratterizzato la risposta della gamba che si manifesta stimolando una particolare setola. Questo include la gamba che risponde ad ogni setola e la proporzione di mosche che rispondono alla stimolazione di quel particolare setola. Abbiamo segnato solo per i movimenti della gamba che ci aspettavamo di rispondere basò sulla classificazione di Vandervorst 6. - Condurre cinque studi distanziati 2 minuti a parte.
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Risultati
Il successo di questo protocollo dipende in gran parte la resa complessiva di mosche testabili, l'efficacia dello shock termico per indurre ricombinazione mitotica, e la capacità di ottenere una risposta comportamentale robusta in linea stimolati ad intervalli di 2 min. Dal momento che si stima che il 12,5% degli embrioni contengono elementi marcm necessari e si stima che 16,67% degli adulti che Eclose hanno il potenziale per l'espressione della GFP, è fondamentale per ottenere u...
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Discussione
Questo protocollo utilizza un test comportamentale adulti per lo screening per le mutazioni che colpiscono mechanosensation in Drosophila. Poiché la collezione di mutanti contiene letali mutazioni p-elemento che escluderebbe di screening come gli adulti, questo protocollo fa uso di una tecnica genetica complessa descritta da Lee e Luo , (1999) e dettagliato come protocollo da Wu e Luo, (2006) per aggirare letalità degli adulti. Marcm induce ricombinazione mitotica fra cromosomi omologhi di generare regioni clon...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il centro di Bloomington magazzino, Liqun Luo, Charles Zuker, e Lily e Yuh Nung Jan per la generosa condivisione delle scorte mosca e il seguente per il finanziamento: Somas-URM (JD e SW), Laurea Ford Facoltà Estate Fellowship (SW), BD Corporation Estate Research Fellowship (a CL e DL), Il Renee e Anthony M. Marlon, MD '63 Estate Research Fellowship (DL) James C. '75 e Jane Colihan Estate Research Fellowship (TO) attraverso Alumni / Parent Estate Fondo di ricerca del Collegio della Santa Croce e il Stransky Fondazione Estate Research Fellowship (a TO). Un ringraziamento speciale al Dipartimento di Biologia e l'Ufficio di Presidenza a College of the Holy Cross per il sostegno di tutto il lavoro in laboratorio.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Lievito di birra (25 libbre) | MP Biomedicals | ICN90331225 | Cibo per mosche |
| Mais (25 libbre) | MP Biomedicals | ICN90141125 | Cibo per mosche |
| Agar (1 lb) | MoorAgar Inc. | 41004 | Cibo per mosche |
| Tegosept (5 kg) | Genesee | 20-259 | Cibo per mosche |
| Melassa (1 gallone) | Sugarmill Brand - Thomsen Food Service | 0 2625 | Cibo per mosche |
| Acido propionico | Fisher | A258-500 | Cibo per mosche |
| Acido fosforico | Fisher | A260-500 | Cibo per mosche |
| Drosophila Fiale, strette (PS) | Genesee | 32-109 | Culture delle mosche |
| Bottiglia a fondo quadrato da 6 once (PP) | Genesee | 32-130 | Fly Cultures |
| Flugs - Bottiglie di plastica per mosche | Genesee | 49-100 | Fly Cultures |
| Rayon Balls, Large | Genesee | 51-100 | Fly Cultures |
| Droso-Filler, Narrow | Genesee | 59-168 | Fly Food Preparation |
| Droso-Filler, bottiglie | Genesee | 59-170 | Fly Food Preparazione |
| 8A-C / agitatore da laboratorio a ingranaggi con montaggio a morsetto a C 1/15 HP, 700 giri/min velocità variabile, 115 V, 50/60 Hz | Miscelatore Cleveland | 8A-C | Preparazione del cibo per mosche Bollitore |
| rivestito d'acqua | Preparazione del cibo per mosche | ||
| Camera di crescita diurna | Forma scientifica | Temperatura e ciclo luce/buio controllati | |
| Bagno d'acqua | VWR | Per il calore microforbici d'urto | |
| Strumenti di Fine Science | 15000-08 | Per la rimozione delle teste | |
| Microscopio da dissezione a fluroscenza | Zeiss | SteREO Discovery V8 | Con filtro passa-banda GFP cube (KSC295-814D) |
| Sorgente luminosa a fluroscenza | Zeiss | X-Cite 120 | lo rende facile da configurare. |
| Fotocamera per cannocchiale | Zeiss | AxioCam ICc1 | |
| Software di acquisizione immagini | Zeiss | ||
| Secchiello | per ghiaccio per antresia fredda | ||
| Vassoio | per decapitazione di antesia fredda | ||
| Scatole | di plastica per il recupero di mosche debattezzate in ambiente umido |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
