Il metodo immunogold post-inclusione è uno dei modi più efficaci per fornire analisi ad alta risoluzione della localizzazione subcellulare di molecole specifiche. Qui descriviamo un protocollo per analizzare quantitativamente i recettori del glutammato nelle sinapsi del nastro retinico.
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Articolo metodologico
Risoluzione alta analisi quantitativa Immunogold di Recettori di membrana a retina nastro Sinapsi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule gangliari retiniche (RGC) ricevono input glutammatergici eccitatori dalle cellule bipolari. L'eccitazione sinaptica delle RGC è mediata postsinapticamente dai recettori NMDA (NMDAR) e dai recettori AMPA (AMPAR). I dati fisiologici hanno indicato che i recettori del glutammato nelle RGC sono espressi non solo nei compartimenti di membrana postsinaptici, ma anche perisinaptici o extrasinaptici. Tuttavia, non sono state determinate posizioni anatomiche precise per i recettori del glutammato nelle sinapsi RGC. Sebbene sia ampiamente impiegata un'analisi quantitativa ad alta risoluzione dei recettori del glutammato nelle sinapsi centrali, questo approccio ha avuto solo un successo limitato nella retina. Abbiamo sviluppato un metodo immunogold post-embedding per l'analisi dei recettori di membrana, che consente di stimare il numero, la densità e la variabilità di questi recettori nelle sinapsi a nastro retinico. Qui descriviamo gli strumenti, i reagenti e i passaggi pratici necessari per: 1) preparazione di successo della fissazione retinica, 2) sostituzione a freddo, 3) immunocitochimica al microscopio elettronico (EM) immunogold post-inclusione e 4) visualizzazione quantitativa dei recettori del glutammato nelle sinapsi a nastro.
Introduzione
Il glutammato è il principale neurotrasmettitore eccitatorio nella retina 1. Cellule gangliari della retina (RGCs), che ricevono in ingresso sinaptica glutammatergica da cellule bipolari 2, sono i neuroni di uscita della retina che inviano le informazioni visive al cervello. Studi fisiologici hanno mostrato che l'eccitazione sinaptica di RGCs è mediata da recettori NMDA postsinaptica (NMDARs) e recettori AMPA (AMPARs) 3,4,5. Anche se le correnti post-sinaptiche eccitatorie (EPSCs) in RGCs sono mediate da AMPARs e NMDARs 3,5,6,7,8, EPSCs miniatura spontanee (mEPSCs) su RGCs mostrano solo una componente AMPARs mediata
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Protocollo
Cura e trattamento degli animali erano in conformità con NIH cura degli animali e linee guida del Comitato Usa. Postnatale giorno (P) 15-21 ratti Sprague-Dawley, iniettati con 1-1,2% CTB bilateralmente attraverso il collicolo superiore, sono stati mantenuti su un 12: luce 12-hr: ciclo scuro.
1. Fissazione tessuto retinico
- Montare i seguenti materiali e strumenti: un microscopio da dissezione, 2 pinze con punte molto fini, forbici, carta da filtro di cellulosa, pipetta di plastica e un vetrino da microscopio.
- Anestetizzare ratto in una camera chiusa con 2,0 ml alotano (un anestetico inalante). Determinare un'adegua....
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Risultati
I risultati qui presentati dimostrano sorprendentemente diversi modelli di localizzazione subsinaptico di GluA 2/3 e NMDARs sui dendriti RGC in retina di ratto, come descritto in precedenza 24,25. 77% di GluA 2/3 particelle immunogold in RGC profili dendritiche erano situati all'interno del PSD (Figura 1A), simile alla maggior sinapsi centrali. Tuttavia, NMDARs erano situati sia sinapticamente o extrasynaptically. 83% di particelle immunogold GluN2A stati .......
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Discussione
Abbiamo descritto quattro tecniche per il successo post-embedding immunogold EM quantitativa: 1) fissazione breve e debole, 2) freeze-sostituzione, 3) post-embedding colorazione immunogold, e 4) la quantificazione.
EM immunogold permette il rilevamento di proteine specifiche in sezioni di tessuto ultrasottili. Gli anticorpi marcati con particelle d'oro possono essere visualizzati direttamente usando EM. Mentre potente nel rilevare la localizzazione subsinaptico di un recettore di membr.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno divulgazioni.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dai programmi intramurale del National Institute of Neurological Disorder and Stroke (NINDS) e National Institute on Deafness altri disturbi della comunicazione e (NIDCD), del National Institutes of Health (NIH). Ringraziamo l'impianto NINDS EM e il nucleo NIDCD Advanced Imaging (codice # ZIC DC 000.081-03) per l'assistenza.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Paraformaldeide | EMS | 15710 | |
| Glutarraldeide | EMS | 16019 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 7782-85-6 | |
| CaCl2 | Sigma | C-8106 | |
| BSA | Sigma | A-7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
| Glicerolo | Gibco BRL | 15514-011 | |
| Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
| Tris-Base | Fisher | BP151-500 | |
| Tris | Fisher | 04997-100 | |
| Anti-GluN2A | Millipore | AB1555P | Diluizione 1/50 |
| Anti-GluN2B | Millipore | AB1557P | Diluizione 1/30 |
| Anti-GluA2/3 | Millipore | AB1506 | Diluizione 1/30 |
| Anti-PSD-95 | Millipore | MA1... 046 | Diluizione 1/100 |
| Asino anti-coniglio IgG-10 nm particelle d'oro | EMS | 25704 | Diluizione 1/20 |
| Asino anti-topo IgG-10 nm particelle d'oro | EMS | 25814 | Diluizione 1/20 |
| Asino anti-topo IgG-5 nm particelle d'oro | EMS | 25812 | Diluizione 1/20 |
| Asino anti-capra IgG-18 nm particelle d'oro | Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | Diluizione 1/20 |
| Formvar-Griglie a fessura in nichel rivestite in carbonio. | EMS | FCF2010-Ni | |
| Acetato di uranile | EMS | 22400-1 | |
| Metanolo | EMS | 67-56-1 | |
| Citrato di piombo | Leica | ||
| Leica EM AFS | Leica | ||
| Leica EM CPC | Leica | ||
| Ultramicrotomo | Leica | ||
| JEOL 1200 EM | Azoto liquido JEOL | ||
| Roberts Ossigeno | |||
| Propano | Roberts Ossigeno | ||
| CTB | Elenco Laboratori Biologici | 104 | 1 - 1,2% |
| Elenco Anti-CTB | Laboratori Biologici | 703 | Diluizione 1/4.000 |
Riferimenti
- Copenhagen, D. R., Jahr, C. E. Release of endogenous excitatory amino acids from turtle photoreceptors. Nature. 341, 536-539 (1989).
- Wässle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol. Rev. 71, 447-480 (1991).
- Mittman, S., Taylor, W.....
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Ristampe e permessi
