Valutazione della Planar-Cell-polarità fenotipi in Ciliopathy mouse Mutant Coclea

Sommario

Le ciglia primarie influenzano varie vie di segnalazione. La coclea dei mammiferi è ideale per esaminare la segnalazione della polarità cellulare planare (PCP). La disfunzione delle ciglia colpisce la crescita cocleare, il patterning cellulare e l'orientamento delle cellule ciliate, le letture della PCP. Il nostro obiettivo è analizzare la segnalazione della PCP nella coclea murina attraverso l'analisi fenotipica, l'immunoistochimica e la microscopia elettronica a scansione.

Abstract

Negli ultimi anni, le ciglia primarie sono emerse come regolatori chiave nello sviluppo e nella malattia, influenzando numerose vie di segnalazione. Una delle prime vie di segnalazione che si è dimostrata associata alla funzione ciliare è stata la via di segnalazione Wnt non canonica, nota anche come segnalazione della polarità cellulare planare (PCP). Uno dei luoghi migliori in cui studiare gli effetti della segnalazione della polarità cellulare planare (PCP) durante lo sviluppo dei vertebrati è la coclea dei mammiferi. L'interruzione della segnalazione PCP nella coclea di topo interrompe la crescita cocleare, il patterning cellulare e l'orientamento delle cellule ciliate, tutti fattori influenzati dalla disfunzione delle ciglia. L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere l'analisi del segnale PCP nella coclea dei mammiferi in via di sviluppo attraverso l'analisi fenotipica, l'immunoistochimica e la microscopia elettronica a scansione. I difetti di convergenza ed estensione si manifestano come un accorciamento del dotto cocleare e/o cambiamenti nel pattern cellulare, che possono essere quantificati in seguito alla dissezione da mutanti di topo in via di sviluppo. I cambiamenti nell'orientamento del fascio stereociliare e nella lunghezza o nel posizionamento della kinocilia possono essere osservati e quantificati utilizzando l'immunofluorescenza o la microscopia elettronica a scansione (SEM). Una comprensione più approfondita del ruolo delle proteine ciliari nelle vie di segnalazione cellulare e in altri fenomeni biologici è fondamentale per la nostra comprensione della biologia cellulare e dello sviluppo, nonché per lo sviluppo di strategie di trattamento mirate.

Introduzione

cilia primarie sono lunghe appendici microtubuli-based che si estendono dalla superficie della maggior parte delle cellule di mammifero. cilia primaria sono spesso confusi con cilia motilità, di cui ci sono sempre di più per cella, e il cui scopo è quello di spostare il fluido attraverso le superfici della membrana. cilia primaria, in contrasto, adottare ruoli sensoriali e sono quindi anche denominato cilia come sensoriale. Una volta lungo dimenticato, questo organello stato recentemente 'riscoperto' a causa della sua associazione con una moltitudine di malattie genetiche umane ^1. Idealmente posizionato come un organello segnalazione, il ciglio primario è stato dimostrato che regolano numerose vie di segnalazione, molti dei quali sono importanti non solo nella omeostasi tissutale e la malattia, ma anche durante lo sviluppo ^2.

Una delle prime vie di segnalazione dimostrato di essere associato con una disfunzione delle ciglia è stata la via di segnalazione Wnt non canonico, conosciuta anche come la polarità planare delle cellule (PCP) percorso > 3. Questa cascata di segnali inizialmente identificata in Drosophila, è fondamentale per l'embriogenesi; in particolare per processi di convergenza ed estensione e per il corretto orientamento delle cellule nel piano di epiteli ^4. La segnalazione sequenziale di un nucleo insieme di proteine ​​regolatrici traduce indicazioni direzionali che in definitiva portano a riarrangiamenti del citoscheletro e determinano la polarizzazione coordinata di cellule epiteliali in un piano ^5. Il processo di convergenza ed estensione è assolutamente necessaria per il condotto cocleare per allungare e per una corretta patterning cellulare ^6. Dato che questo è regolato attraverso l'attivazione del pathway PCP, uno dei fenotipi più suggestivi della coclea mutanti PCP è un condotto cocleare accorciato con disorganizzato epiteli sensoriali ^7. Allo stesso modo, i mutanti di topo, che mancano di cilia, mostrano anche una tale convergenza ed estensione fenotipo ^8,9, anche se con precisione come questo è regolata ancora da chiarire.

ve_content "> Poiché i processi di convergenza ed estensione sono fondamentali per la conseguenza del condotto cocleare, e patterning cellulare del epiteli sensoriali all'interno del condotto cocleare, la coclea in via di sviluppo è un organo ideale in cui esaminare la segnalazione PCP durante lo sviluppo dei vertebrati. L'organo di Corti, il termine dato al dell'epitelio sensoriale specializzato che le linee del condotto cocleare, è composto di cellule di supporto non-sensoriali e cellule ciliate meccanosensoriali che devono essere orientati in modo uniforme per la coclea di funzionare ^10. le cellule ciliate meccanosensoriali sono così chiamati a causa della fasci stereociliary che si estendono dalla piastra cuticolare (superficie apicale) di ciascuna cella capelli sensoriale ^11. Questi agiscono come trasduttori primari di mechanosensation e nonostante loro nomenclatura come stereocilia, sono in realtà costituiti da actina modificato microvilli filamento-based. da ogni capelli a forma di chevron fascio, tre file di stereocilia sono organizzati in un pa altamente ordinata e regolaresag o ma in un modo simile-scalinata. Reale cilia microtubuli base, kinocilia chiamati, sono necessari per lo sviluppo e l'orientamento dei fasci stereociliary ^12. Su ogni cella di capelli, una singola kinocilium è fisicamente collegato al fascio stereocilia, in posizione centrale adiacente alla più alta fila di stereocilia. La funzione precisa della kinocilium non è chiara, e uno ipotesi è che la kinocilium 'tira' stereocilia in forma man mano che maturano da microvilli ^12. Nei vertebrati, kinocilia nella coclea sono presenti solo transitoriamente e si ritraggono dalle cellule ciliate nei topi prima della comparsa di sentire ^11,13,14.

Completa perdita delle ciglia nello sviluppo risultati coclea in condotti cocleari severamente accorciati, mis-formato e mis-orientato bundle stereociliary, così come corpi basali mis-posizionati ^8,9. Un cilium funzionale non è solo composto dal axoneme ciliare. Molte proteine ​​associate con ciliafunzione di verifica in complessi localizzate a sottodomini cilia-correlate, quali il corpo basale, zona di transizione, o ciliare axoneme ^15. Il corpo basale, derivato dalla centriolo madre del centrosoma, è anche un centro microtubuli organizzando per microtubuli che si estendono lontano dal ciglio nel corpo cellulare e può regolare il traffico intracellulare e il traffico ciliare. La zona ciliare transizione è un'altra regione in cui la funzione ciliare è regolata in termini di organizzazione importazione ed esportazione di composti ciliari ^16.

Diversi studi hanno identificato un legame tra ciglia e Wnt non canonica (segnalazione PCP), anche se il meccanismo preciso non è chiaro ^17. Ridondanza di ciliari e PCP geni e la sensibilità della polarità delle cellule di anomalie cellulari generalizzate, rendono difficile per collegare direttamente una mutazione a deficit specifici PCP. Uno dei outs di lettura di segnalazione PCP è il posizionamento del corpo basale e primary cilium, quindi segregare il primario dai difetti secondari è impegnativo. Alcuni studi in zebrafish e topo mutanti hanno suggerito alcuna connessione tra le ciglia e Wnt segnalazione ^18-20. Le discrepanze nei dati possono riflettere specie, tessuto, o le differenze temporali-dipendente dei contributi ciliari verso segnalazione Wnt. Inoltre, normale risposta Wnt potrebbe essere mantenuta se i corpi basali rimangono funzionale. Uno sguardo più in profondità il ruolo delle proteine ​​ciliari nei percorsi di segnalazione cellulare e altri fenomeni biologici è fondamentale per la nostra comprensione della biologia cellulare e dello sviluppo, nonché per lo sviluppo di strategie terapeutiche mirate.

Protocollo

Uso e l'eutanasia tutti gli animali in conformità con le linee guida e le normative istituzionali e governative, più comunemente tramite CO ₂ inalazione e dislocazione cervicale.

1. Preparazione dei reagenti

NOTA: Prima di iniziare, preparare tutti i reagenti che utilizzano prodotti chimici puri per analisi. Fare soluzioni utilizzando grado molecolare distillata e acqua deionizzata, se non diversamente specificato.

1. Tampone fosfato (PBS 1x): fare 1 L di PBS 1x sciogliendo 8g NaCl, 0,2 g KCl, 1.44g Na ₂ HPO ₄ e 0.24g KH ₂ PO _{4 in 1} L di H ₂ O. Regolare il pH a 7,4 con HCl. PBS non deve essere sterile e può essere conservata a temperatura ambiente. Si noti che questo buffer è fatta senza CaCl _{2 o} MgCl _2.
2. Paraformaldeide (4% PFA): Preparare una soluzione al 4% di PFA in 1x PBS in una cappa aspirante ventilato. Aggiungere 40 g di polvere di paraformaldeide al 1 L di PBS 1x. Per sciogliere, mescolare e riscaldare a circa 60 ° C,e aggiungere lentamente NaOH goccia a goccia per aumentare il pH. Una volta che la polvere si è sciolta, regolare il pH a 7,4 con HCl. Filtrare attraverso un filtro da 0,45 micron e congelare aliquote. Scongelare una nuova aliquota per ogni esperimento.
3. Triton buffer: Preparare un 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M di NaCl, 0,1% Triton X-100 soluzione sciogliendo 8.77 g di NaCl in 1 L di 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5). Aggiungere 1 ml di Triton X-100. Mescolare per sciogliere. Conservare tampone Triton a RT.
4. blocco Triton: Preparare 10% di siero di capra in tampone Triton con l'aggiunta di 1 ml di siero di capra a 9 ml di tampone Triton. Conservare a 4 ° C. Se si utilizza anticorpi primari sollevate nel topo, aggiungere capra anti topo-IgG Fab frammenti a una diluizione di 1 a 200 al blocco del Tritone per la fase di blocco.
   NOTA: Se si intende utilizzare i campioni per la microscopia elettronica a scansione (SEM), preparare i reagenti aggiuntive, come indicato di seguito.
5. Soluzione salina bilanciata Hanks '(HBSS), con calcio e magnesio: ottenere una soluzione 1X di HBSS diluendo da una soluzione madrein distillata sterile H ₂ O. Come tampone HBSS è complicato da fare e ci sono rischi, si consiglia di ordinare un premade 10x soluzione madre. La concentrazione finale di HBBS del buffer comunemente impiegati è la seguente: 1.26 mM CaCl _2, 0.49 mM MgCl ₂ -6H2O, 0,41 mm MgSO ₄ -7H2O, 5,33 mM KCl, 0,44 mM KH _{2 PO} 4, 4.17 mM NaHCO _3, 137.93 mM NaCl , 0,34 mm Na ₂ HPO _4, 5,56 millimetri destrosio.
6. Hepes buffer: Preparare una soluzione 0,1 M Hepes a 1x HBSS, sciogliendo 23,8 g HEPES in 1 tampone L 1x HBSS.
7. Scansione microscopia elettronica fissativo (SEM Fix): Preparare fissativo per SEM diluendo microscopia elettronica grade glutaraldeide (2,5%) e paraformaldeide (4%) in tampone Hepes. Aggiungere CaCl ₂ ad una concentrazione finale di 10 mM.
8. 1% tetrossido di osmio (OSO ₄₎ in tampone Hepes; 1% tetrossido di osmio in acqua: Diluire una soluzione madre di tetrossido di osmio in tampone Hepes, e separately in sterile distillata H ₂ O, ad una concentrazione finale di 1%. Tetrossido di osmio è altamente tossico ed è più comunemente venduto come una soluzione al 4%.
9. 1% (w / v) di acido tannico: Sciogliere 0.5 g di acido tannico in 50 ml sterile distillata H ₂ O. Filtro sterilizzare filtrando attraverso un filtro con pori 0,45.
10. Graded etanolo serie soluzione: Diluire 200 etanolo prova con sterili H _{2 O} distillata per rendere le soluzioni di 30, 50, 70, 90 e 95% di etanolo. Per i risciacqui etanolo finali, è necessario il 100% di etanolo 200 prove. Utilizzare una bottiglia appena aperta di 200 etanolo prova per i risciacqui finali.

2. Scelta del tessuto

1. Idealmente, esaminare gli embrioni o giovani cuccioli di età compresa tra giorno embrionale 16,5 (E16.5) e il giorno postnatale 3 (P3) tra.
   NOTA: ossificazione del labirinto osseo e ossa temporali rende la dissezione progressivamente più impegnativo come topi maturano. Inoltre kinocilia, l'unico vero ciglio microtubuli-based trovati su cellule ciliate cocleari,ritrae durante lo sviluppo e non è più presente in topi adulti.
2. Dopo la fissazione, Decalcificare coclee adulti. Posto sezionato (vedi sezione 3) labirinti ossee, in 2 ml di EDTA (4,13% in PBS), pH 7,3, in una provetta per 3 - 4 giorni con la rotazione. Ricostituire EDTA quotidiano. Dopo che i tessuti sono ammorbidite, sciacquare in 1,5 ml o più PBS 3 volte per 5 minuti su un nutator con una maggiore agitazione.

3. Coclea Dissection

1. Euthanization messaggio tramite dislocazione cervicale o di CO ₂ inalazione (100% CO _2), togliere la testa. Utilizzare una lama di bisturi o piccolo paio di forbici, a seconda della dimensione dell'animale, per sezionare la testa lungo la linea mediana sagittale cominciando dal naso e si estende caudalmente. Rimuovere il cervello da ogni metà del cranio con un paio di pinze. Identificare le ossa temporali, che contengono i labirinti in via di sviluppo ossee dell'orecchio interno (vedi freccia nella Figura 1A).
2. Utilizzare un paio di perCEPS per isolare con cura i labirinti ossei dal cranio (ossa temporali). Fare questo sotto un microscopio da dissezione. Prise via il tessuto osseo dal cranio eseguendo la pinza delicatamente sotto i labirinti ossee. Negli animali fino a P4 i labirinti ossee sono ancora cartilagineo e possono essere facilmente rimossi senza rompersi.
3. A seguito di dissezione, utilizzare la punta delle dissettore per cancellare l'ovale e finestre rotonde e fare un piccolo foro nel vertice della spirale cocleare. Fissare i labirinti ossee prima di ulteriori dissezione del dotto cocleare. Per consentire una facile rimozione della membrana tectorial (vedi 3.7), fissare i labirinti ossee in 1,5 ml 4% PFA per 5 minuti in ghiaccio.
   NOTA: Se non è richiesta la rimozione della membrana tectorial, si consiglia di fissaggio più lungo (vedi 4,1-4,3). Breve fissaggio delle ossa temporali precedenti dissezione del condotto cocleare aiuta il processo di dissezione e rimozione della membrana tectorial. dissezione Post e l'esposizione dell'organo del Corti, furtè richiesta la sua fissazione.
4. Ulteriori sezionare i labirinti ossee per esporre l'epitelio sensoriale cocleare come segue. Posizionare i labirinti ossee in un elastomero rivestite piatto dissezione silicone nero contenente PBS per facilitare la dissezione. Utilizzare perni minutien per immobilizzare il tessuto, se necessario. Per utilizzare perni minutien, metterli attraverso la porzione vestibolare dei labirinti ossee con la faccia ventrale della spirale cocleare rivolta verso l'alto.
   NOTA: Nero silicone elastomero piatto: Mescolare componente di base elastomero siliconico con polvere di carbone per ottenere un colore nero opaco. Aggiungere l'agente indurente e versare in una o più piastre di Petri (vetro o plastica). Secco sotto vuoto per eliminare le bolle d'aria intrappolate. piatti asciugare completamente prima dell'uso.
5. Utilizzare una pinza sottile (# 5) per rimuovere la cartilagine esterna esponendo il dotto cocleare. Inizia la finestra ovale; inserire la punta inferiore della pinza nella finestra ovale e sollevare delicatamente aprire la cartilagine, si muove lentamente verso l'alto verso laapice.
6. Dopo l'esposizione del condotto cocleare, rimuovere la superficie ventrale membrana della Reissner. Utilizzare un bel paio di pinze per pizzicare membrana della Reissner alla base del condotto cocleare e sfilarlo in un movimento ascendente. Visualizza la faccia dorsale del condotto cocleare, compreso l'epitelio sensoriale.
7. Rimuovere la membrana tectorial come descritto di seguito (opzionale). Per SEM o immunoistochimica della kinocilium o fasci stereociliary rimuovere la membrana tectorial.
8. Utilizzare un bellissimo paio di pinze (# 55 o più fine) per pizzicare la membrana tectorial alla base della coclea e la buccia verso l'alto verso l'apice.
   NOTA: La membrana tectorial è otticamente trasparente che rende difficile l'identificazione. Più spesso la membrana si stacca in un unico pezzo e anche se non è facilmente visualizzato, si può sentire la resistenza mentre viene tirato fuori dall'organo esposta di Corti.
9. Dopo aver esposto l'organo del Corti, fissare ulteriormente il tessuto come described sotto. Conservare la regione vestibolare per facilitare le operazioni di preparazione dei tessuti.

4. Fissazione

1. Per l'immunoistochimica regolare risolvere i labirinti ossee sezionati in 1,5 ml 4% PFA a 4 ° C su un nutator per 2 ore.
   NOTA: A causa della sensibilità dei diversi anticorpi e antigeni, variazioni nella lunghezza e la composizione di determinazione può essere richiesto e dovrebbe essere ottimizzato per ciascun anticorpo.
2. Dopo la fissazione, lavare i campioni con il risciacquo in 1,5 ml o più PBS 3 volte per 5 minuti su un nutator con una maggiore agitazione. I campioni possono essere conservati in PBS a 4 ° C per diverse settimane prima di elaborare.
3. Se la preparazione dei campioni per SEM, fissare sezionato ossa temporali in SEM correzione (vedi 1.7) per 2 ore a temperatura ambiente. Lavare sciacquando in 1,5 ml o più Hepes tampone 3 volte per 5 minuti su un nutator con una maggiore agitazione. Conservare in tampone Hepes a 4 ° C fino ad ulteriore lavorazione. Bagagli per più di un paio di settimanes non è raccomandato.

5. immunoistochimica

1. Eseguire immunoistochimica su campioni sezionati in un pozzetto di una piastra da 96 pozzetti a fondo piatto. In alternativa, utilizzare una PCR o provetta. Si consiglia di conservare la porzione vestibolare del labirinto osseo per facilitare l'elaborazione.
2. Permeabilize tessuto incubando in 1,5 ml di tampone Triton per 1 ora a RT su un nutator con agitazione.
3. Bloccare il tessuto incubando in 0,5 ml blocco Triton per almeno 1 ora a RT. Se si utilizza anticorpi primari sollevate nel topo, aggiungere frammenti anti-topo IgG Fab al blocco a una diluizione di 1 a 200 (vedi paragrafo 1.4). Questo diminuisce notevolmente legame di IgG anti-topo al tessuto topo non specifico.
4. Incubare il tessuto con anticorpi primari diluiti in Triton blocco O / N a 4 ° C con agitazione. diluizione degli anticorpi dipende anticorpi in uso (vedere paragrafo 6.1). In alternativa incubare antibodie primarias per 2 ore a temperatura ambiente. Idealmente utilizzare un volume minimo di 0,5 ml di diluizione anticorpo primario. Se anticorpo è limitata, utilizzare il più piccolo volume di diluizione anticorpo che avvolge completamente il tessuto.
5. Lavare il tessuto con il risciacquo in 1,5 ml o più tampone Triton, un minimo di 3 volte per 15 minuti, su un nutator con una maggiore agitazione.
6. Incubare il tessuto con anticorpi secondari fluorescenti colorante coniugato diluiti ai produttori concentrazione negativa (tipicamente 1: 200-1: 1000) nel blocco Triton per 1 ora a RT su un nutator. Utilizzare un volume minimo di 0,5 ml di diluizione anticorpo secondario.
   1. Centrifugare l'anticorpo secondario diluito a 13.000 xg per 3 minuti prima dell'uso per ridurre al minimo legame non specifico degli aggregati anticorpo secondario. Proteggere il tessuto dalla luce da questo punto in poi per evitare photobleaching dei coloranti fluorescenti.
7. Come nella fase 5.5, lavare il tessuto da risciacquo in 1,5 ml o più Triton tampone, un minimo di 3 volte per 15 minuti, su unnutator con una maggiore agitazione. Conservare i campioni in PBS a 4 ° C fino al momento di montare.

6. Selezione Anticorpo

NOTA: La fonte di anticorpi raccomandati e le loro diluizioni sono elencati nella tabella dei materiali e attrezzature specifiche. Eseguire le incubazioni anticorpi come descritto nella sezione 5.

1. Per visualizzare il kinocilium microtubuli-based, utilizzare un ciliare axoneme marcatore come anti-Arl13b (1: 1.000) o anti-acetilata-α-tubulina (1: 800). Visualizzare corpo basale utilizzando un anticorpo contro γ-tubulina (1: 200) o qualsiasi altro marcatore centrosomica.
2. Per visualizzare i actina ricco di filamenti fasci stereociliary, aggiungere falloidina (1: 300 - 1.000) coniugata con uno dei diversi fluorofori diversi per l'incubazione anticorpo secondario. Falloidina etichette anche altre strutture filamentose di actina, tra cui i filamenti di actina corticale che circondano la periferia di ogni cella capelli epiteliale. Questo è utile per determinareil contorno di ciascuna cella capelli. Utilizzare un marcatore membrane alternative come anti-Zo-1 (1: 500), se necessario.
3. Etichetta cellule ciliate cocleari utilizzando anticorpi contro la miosina VI (1: 1.000) o miosina VIIa (1: 1.000). Questi possono essere usati se valutare lunghezza coclea.

NOTA: L'uso appropriato fluorescenti anticorpi secondari colorante coniugato ottimizzati per le esigenze microscopio.

7. Montaggio e Imaging

1. Trasferire il campione in un nero piatto elastomero siliconico contenente PBS. Utilizzando una pinza sottile, rimuovere la regione vestibolare dalla spirale cocleare.
2. Molto rimuovere con attenzione la cartilagine sottostante e mesenchima dalla spirale cocleare. La spirale cocleare rimanente contiene il solco interno, organo del Corti e solco esterno.
3. Trasferire la spirale cocleare in una goccia di PBS posto su un vetrino da microscopio. Se lo si desidera, separare la spirale cocleare in pezzi equivalenti a un giro. Questo passaggio non è necessario tuttavia, e può portare a loss del tessuto. La superficie apicale (lato stereociglia) delle cellule ciliate cocleari deve essere rivolto verso l'alto verso il vetrino.
4. Wick via la PBS con un tessuto assorbente o un pezzo di carta da filtro e delicatamente riposizionare la spirale cocleare se gli epiteli è spostato e si sovrappone su se stesso.
5. Aggiungere una goccia di mezzi di montaggio direttamente sul campione coclea e delicatamente mettere un coprioggetto sulla parte superiore, avendo cura di evitare bolle d'aria. Non sono necessari distanziatori; posizionare il coprioggetto direttamente sul campione. Si raccomanda una, non fluorescente solubile in acqua, mezzo di montaggio semipermanente che non richiede ulteriori misure per contenere il vetrino in posizione. supporti di montaggio e spessore coprioggetto dovrebbero essere abbinati al microscopio specifiche.
6. Utilizzare un microscopio epifluorescente o confocale a scansione laser dotato di alto ingrandimento (63 - 100X), ad alta apertura numerica (1,2-1,4) obiettivi per catturare le immagini della superficie apicale della cellula capelli cocleare. Utilizza loobiettivi wer (5 - 20X) per prendere immagini sovrapposte della spirale cocleare per quantificare la lunghezza del condotto cocleare. laser di eccitazione partita e filtri di emissione di fluorofori utilizzati per gli anticorpi secondari.

8. Scanning Electron Microscopy

1. Continuare dal paragrafo 4.3. Dopo aver lavato i campioni SEM fisse in tampone Hepes, effettuare le seguenti operazioni sotto ventilazione. Il seguente protocollo funziona bene per il tessuto coclea ed evita l'uso del rivestimento a polverizzazione con un metallo conduttivo.
2. Post-fix in 1% OsO ₄ in Hepes tampone per 1 ora, seguito da 3 lavaggi con 1 ml di acqua distillata per 5 minuti ciascuna. Il più piccolo volume di OsO ₄ che avvolge completamente il tessuto deve essere usato per ridurre rifiuti tossici. Non è richiesta alcuna agitazione.
3. Incubare campioni a RT in ciascuna delle seguenti soluzioni per 1 ora con 3 lavaggi con 1 ml di acqua distillata per 5 minuti ciascuna tra fasi: Acido tannico 1% preparata in acqua e filtrato prima dell'uso; 1% OsO ₄ in acqua, acido tannico 1% in acqua, 1% OsO ₄ in acqua.
4. Disidratare campioni attraverso una serie graduata di etanolo mediante incubazione per 10 min in ciascuna delle seguenti diluizioni: 30, 50, 70, 90 e 95%. Non è richiesta alcuna agitazione.
5. campioni di trasferimento attraverso tre cambi, 5 minuti ciascuno, su 100% di etanolo (da una bottiglia di recente apertura di 200 etanolo prova).
6. Eseguire i campioni anche se un punto secco critica seguenti istruzioni del produttore.
7. Montare i campioni utilizzando adesivo carbonio conduttivo sopra un stub SEM prima di imaging su un microscopio elettronico. Sotto uno stereomicroscopio, utilizzare un paio di pinze sottili e un pennello per posizionare delicatamente il campione con gli epiteli cocleari rivolto verso l'alto. Utilizzare la porzione vestibolare del campione 'anchor' il tessuto allo stub. Conservare i campioni in un essiccatore fino a quando l'imaging. Eseguire l'imaging SEM come descritto in Jones (2012) ^21.

9.quantificazione

1. Dopo la preparazione immunoistochimica, di acquisire le immagini utilizzando un epifluorescente o confocale a scansione laser microscopio. Dopo la preparazione per SEM, utilizzare un microscopio elettronico a scansione di immagine esemplari. Immagine superficie apicale dell'organo di Corti con le cellule ciliate cocleari a vista e le cellule di supporto intercalate.
2. Definire posizioni specifiche lungo il condotto cocleare, come ad esempio 25, 50, e 75% dalla base e utilizzare questi per confrontare regioni coclea tra i campioni mutanti e di controllo. Analizzare e confrontare i mutanti ciglia con i loro controlli littermate, come le differenze di background genetico possono modificare il fenotipo cocleare.
   NOTA: L'organo di Corti sviluppa in un gradiente che si estende dalla metà di base sia verso l'apice e la base. Nel topo, sviluppo non è completa fino P14, quindi è importante confrontare regioni a stadi di sviluppo simili e posizioni.
3. Scattare foto utilizzando il software che accompagna il microscopio che permesso fumarew per la quantificazione della particolare fenotipo come richiesto (vedi sotto). Utilizzare un'immagine software di analisi come J immagine o software che accompagna il microscopio per misurare lunghezze, contare le cellule e determinare la localizzazione delle proteine ​​come descritto di seguito. Grafico questi dati come un grafico a barre, grafico a dispersione, scatola macchia o istogramma, confrontando il controllo contro mutante.
4. La lunghezza totale del condotto cocleare (Figura 3A):
   1. Utilizzando un marker delle cellule dei capelli o falloidina, (che segna i fasci stereociliary), determinare e misurare in cui l'epitelio sensoriale inizia e finisce. La lunghezza del condotto cocleare è spesso abbreviato in mutanti ciglia.
5. Anomalie fascio Stereociliary (Figura 3B, D, E, G):
   1. Misura convessità fascio (altezza) come la distanza più breve tra il vertice del fascio e la linea che si estende attraverso entrambe le estremità 'bracci' il fascio come mostrato in figura 3G, partita. In alternativa, quantificare la zonaoggetto degli braccia di esterno cella capelli fascio stereociliary come mostrato in figura 3G, destra. Se le cellule dei capelli con fasci stereociliary circolari possono essere identificati contano questi come percentuale di cellule totale dei capelli.
      NOTA: In molti mutanti ciliari anomalie bundle può essere osservato indipendentemente dall'orientamento fascio. E 'difficile quantificare con precisione anomalie fascio stereociliary.
6. Orientamento dei fasci stereociliary (Figura 3B, C, G):
   1. Valutare l'orientamento di ogni singolo fascio rispetto ad una linea che si estende perpendicolare alla fila di celle pilastro che separa le cellule ciliate interne ed esterne. Cellule con un orientamento normale sono allineati lungo questo asse perpendicolare e quindi hanno una rotazione di 0 °. Determinare angoli di rotazione utilizzando una notazione 360 ​​° o scostamenti assoluti da 0 °.
7. Posizionamento Kinocilia o posizionamento fascio stereociliary (Figura3B, F, H):
   1. Conta la percentuale di cellule in cui kinocilia mancano. Misurare la distanza dal kinocilium al 'vertice' o il centro del fascio. Il 'vertice' del fascio può non essere facile definire se fasci sono anormali, e quindi il centro del fascio possono essere utilizzati.
8. Quantificare la posizione di kinocilia e fasci stereociliary sulla superficie cellulare apicale capelli, sovrapponendo una griglia posizionale su ciascuna cella capelli e segna la posizione di una base del kinocilium o vertice / centro del fascio stereociliary. Visualizzare i dati come percentuale di ciascuna categoria che si trova all'interno di una regione specifica della griglia, e sovrapponendo le posizioni di ciascuna marcatura su una griglia posizionale.
   NOTA: Nei tessuti di controllo, kinocilia sono sempre collegato al vertice del fascio stereociliary. In mutanti ciglia, kinocilia sono spesso mancano, ma mislocalized ancora attaccato, o addirittura completamente distaccato dalle sfascio tereociliary.
9. Lunghezza Kinocilia (Figura 3I):
   1. Misurare la lunghezza del kinocilium etichettando con un pennarello ciliare axoneme. Unica misura kinocilia che rimangono piatte in un piano confocale a 1,5 micron. Verificare che le ciglia sono distesi osservando una vista in sezione trasversale del tessuto scansionato. Confronto campioni misti invecchiati dalla stessa regione della coclea poiché la kinocilium ritrae durante lo sviluppo.
10. Mislocalization di proteine ​​di polarità:
    1. A seguito di immunoistochimica utilizzando anticorpi contro le proteine ​​di polarità, come Vangl2 e Gαi3, determinare la localizzazione tramite imaging.

NOTA: In alcuni mutanti ciglia, la localizzazione delle proteine ​​di polarità è perturbato. Questi includono Vangl2 e Gαi3, che hanno dimostrato di essere interrotta in Ift20, Bbs8 e Bbs6 coclea mutante.

NOTA: Ulteriori esempi di come quantificare e Polarit cellule capelli visualizzazioney si possono trovare nei seguenti documenti. Curtin, et al. (2003) Current Biology ^22, Montcouquiol, et al. (2003) Natura ^7, Wang, et al (2006) The Journal of Neuroscience ^23, Montcouquiol, et al. (2008) Methods in Molecular Biology ^24, maggio-Simera, et al. (2012) Methods in Molecular Biology ^25, Yin et al (2012) PLoS One ^26.

Risultati

Coclea dissezione e Preparazione del tessuto

Dopo la rimozione del cervello, dopo mezzeria dissezione sagittale di una testa P0 mouse, labirinto osseo, visto da dietro, può essere visualizzato (Figura 1A, freccia bianca) e rimosso. Figura 1B mostra i labirinti ossee isolate con i capelli cocleare rivolto verso l'alto, ventrale, (a sinistra) e da dietro, dorsale (a destra). La ...

Discussione

Quando si prepara il tessuto cocleare per l'analisi, ci sono alcuni punti chiave da tenere a mente. In primo luogo, le differenze di background genetico possono modificare il fenotipo cocleare, rendendo necessario analizzare e confrontare solo i controlli littermate. In secondo luogo, la rimozione completa della membrana tectorial è necessaria per ottenere le migliori immagini con immunoistochimica ed è essenziale per SEM. La membrana tectorial è una struttura opaca e può oscurare le cellule dell'epitelio sensor...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Strumenti/Attrezzature
Elastomero siliconico - Sylgard 184	Sigma-Aldrich	761028-5EA	Vedi nota 2
Forbici da micro dissezione-lama dritta	Varie
Pinze fini (n. 5 e 55) e pinze smussate	Vari
microscopi da dissezione.	Vari
vetrini per microscopio in vetro non rivestito	Vari
vetrini coprimicroscopio (22 mm & volte; 40 mm & volte; 0,15 mm)	Varie
pipette di trasferimento	Vari
perni per minuzie	Fine Science Tools	26002-10
Supporto per campioni SEM	tousimis	8762
Perni per microscopia elettronica a scansione	TED PELLA	16111
PELCO Schede: Adesivo al carbonio	TED PELLA	16084-3
Microscopio fluorescente	Vari
Essiccatore per punti critici	Vari
Microscopio elettronico a scansione	Vari
vetrini per microscopio Vari
vetrini coprioggetti	Vari
tessuti Kimwipe	Vari
reagenti
per pennelli
1&volte; Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Gibco/Life Technologies	10010023
Paraformaldeide  (PFA) (Grado EM richiesto per EM)	Vari		Preparare una soluzione al 4% in 1& volte; PBS fatto fresco ogni volta. Grado EM richiesto per EM.
2,5% Glutaraldeide Grado1	Sigma-Aldrich	G5882
Tris-HCl (pH 7,5)	Vari
NaCl	Vari
CaCl 2	Vari
Triton X-100	Vari
Siero di capra normale	Vari
AffiniPure Fab Frammento d'asino Anti-Topo IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearch	715-007-003
Fluoromount-G Mezzi di montaggio	SouthernBiotech	0100-01
10&volte; Hanks' Soluzione salina bilanciata (HBSS)	Gibco/Life Technologies	14065
Hepes	Gibco/Life Technologies	15630-080
Tetrossido di osmio (OsO4 )	Sigma-Aldrich/Fluka Analytical	75632
Acido tannico	Sigma-Aldrich	403040
Etanolo 200 proof	Vari
anticorpi
anti Arl13b	Protein Tech	17711-1-AP	Concentrazione consigliata 1:1.000
anti tubulina acetilata (611-B1)	Sigma-Aldrich	T6793	Concentrazione consigliata 1:800
anti gamma tubulina (GTU-88)	Sigma-Aldrich	T6557	Concentrazione consigliata 1:200
anti Zo_1	Invitrogen	40-2300	Concentrazione consigliata 1:500
Miosina VI	Proteus Biosciences	25-6791	Concentrazione consigliata 1:1000
Miosina VIIa	Proteus Biosciences	25-6790	Concentrazione consigliata 1:1.000
anti Vangl2	Merk Millipore	ABN373	Concentrazione consigliata 1:250
anti G&alfa; i3	Sigma-Aldrich	G4040	Concentrazione consigliata 1:250
Alexa Fluor® 488 Falloidina	Invitrogen/Life Technologies	A12379	Concentrazione suggerita 1:300 - 1.000
Alexa Fluor® 568 Falloidina	Invitrogen/Life Technologies	A12380	Concentrazione suggerita 1:300 - 1.000