Descriviamo una procedura sperimentale semplice e rapido per la generazione di fibroblasti primari dalle orecchie e le code di topi. La procedura non richiede addestramento speciale animali e può essere utilizzato per la generazione di colture di fibroblasti da spighe conservati a temperatura ambiente per 10 giorni.
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Articolo metodologico
Generazione di primaria fibroblasti culture da orecchio e coda tessuti di topo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cellule primarie derivano direttamente dal tessuto e si pensa di essere più rappresentativo dello stato fisiologico delle cellule in vivo di linee cellulari stabilizzate. Tuttavia, colture cellulari primarie di solito hanno una durata di vita limitata e devono essere frequentemente ristabilita. I fibroblasti sono una fonte facilmente accessibile di cellule primarie. Qui, si discute una procedura semplice e rapida sperimentale di stabilire colture di fibroblasti primari da orecchie e le code di topi. Il protocollo può essere utilizzato per stabilire colture primarie di fibroblasti da spighe conservati a temperatura ambiente per 10 giorni. Quando il protocollo è attentamente seguita, contaminazioni sono improbabili nonostante l'uso di tessuti non sterile immagazzinato per tempo prolungato in alcuni casi. I fibroblasti proliferano rapidamente in coltura e possono essere espanse per un numero considerevole prima di subire la senescenza replicativa.
Introduzione
Cellule primarie sono derivati da tessuti e coltivate che vivono in condizioni in vitro. Si ritiene generalmente che le cellule primarie avvicinano maggiormente lo stato fisiologico e background genetico del tessuto da cui sono derivati di linee cellulari immortalizzate o tumorali 1. Per questo motivo, cellule primarie rappresentano un modello utile per studiare le domande biologica 2,3. Tuttavia, a differenza di linee cellulari stabilizzate che crescono indefinitamente, pile infine subiscono senescenza nella cultura e devono essere frequentemente ristabilita.
Pile comunemente usati includono fibroblasti....
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Protocollo
I topi sono stati alloggiati in condizioni di assenza di patogeni in conformità con le linee guida istituzionali fino euthanization (La cura istituzionale degli animali e del Comitato uso (IACUC) le linee guida presso l'Università Nazionale di Singapore e del Comitato consultivo nazionale per Research Laboratory Animal (NACLAR) le linee guida).
1. Topi
- Ordinare un mouse del background genetico appropriato. Questo protocollo è basato sul tessuto derivato da uno C57BL / 6 del mouse.
2. Preparazione del terreno completo
- Preparare terreno completo aggiungendo le seguenti componenti al Roswell Park Memor....
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Risultati
Estrazione di fibroblasti da risultati tessuto in una notevole quantità di frammenti di tessuto (Figura 1). In contrasto con i residui di tessuto, fibroblasti aderire a superfici di plastica coltura dei tessuti tra il giorno 1 e 3 della cultura. Il mezzo di colture di fibroblasti può essere modificato in modo sicuro il giorno 3 di coltura, che dovrebbe ridurre significativamente i livelli di detriti presenti nella cultura (Figura 2). I fibroblasti mostrano una morfologia allungata e un .......
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Discussione
Qui forniamo una procedura semplice, economico e veloce sperimentale di stabilire colture di fibroblasti primari da orecchie e le code di topi. L'estrazione dovrebbe risultare in fibroblasti divisorie aderenti e rapidamente entro 3 giorni post-isolamento del tessuto. Un importante limite di pile è senescenza, una crescita arresto permanente 15. Utilizzando il protocollo, colture di fibroblasti possono essere diversi passaggi da 5 a 6 volte prima fibroblasti diventano senescente, indicato dalla appiattimen.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi finanziari.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione NRF HUJ-CREATE - Meccanismi cellulari e molecolari dell'infiammazione.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| RPMI-1640 | HyClone | SH30027.01 | |
| Siero fetale di vitello | HyClone | SV30160.03 | |
| 2-mercaptoetanolo | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Asparagina | Sigma-Aldrich | A4159 | |
| Glutammina | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Penicillina/Streptomicina | HyClone | SV30010 | |
| Etanolo | Merck Millipore | 107017 | Absolute per analisi |
| Collagenasi D | Roche Diagnostics | 11088866001 | Da Clostridium histolyticum, liofilizzato, non sterile |
| Pronasi proteasi | Merck Millipore | 53702 | Da Streptomyces griseus |
| Tris tampone (pH 8) | 1° BASE | 1415 | Grado ultra puro |
| 0,5M EDTA (pH 8) | 1° BASE | BUF-1053 | Grado biotecnologico |
| 10X Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | 1° BASE | BUF-2040-10X4L | di grado ultra puro |
| 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | 0,5% tripsina, 0,2% EDTA, tripsina gamma irradiata mediante processo SER-TAIN, senza rosso fenolo, in soluzione salina |
| Amfotericina B | Sigma-Aldrich | A2492-20ml | 250 μ g/ml in acqua deionizzata, filtrata sterile |
| Forbice | Aesculap | ||
| Forcep | Aesculap | AE-BD312R | |
| 0.2 μ M filtro per siringa | Sartorius Stedim | 16534 | |
| 70 μ Filtro cellulare M | SPL | 93070 | |
| Stantuffo siringa | Terumo | SS+10L | |
| Provetta crioviale | NUNC | 368362 | |
| Provetta per microcentrifuga da 1,7 ml | Axygen | MCT-175-C | |
| Piatto per coltura cellulare da 10 cm | Greiner | 664160 | Piatto trattato per colture cellulari |
| Provetta a fondo conico da 15 ml | Greiner | 188271 | |
| Provetta a fondo conico da 50 ml | Greiner | 227261 | |
| Bagnomaria | GFL | 1002 | |
| Centrifuga | Eppendorf | 5810R | |
| Agitatore di incubazione | Sartorius Stedim | Certomat-BS1 | |
| Zeiss Axiovert 25 microscopio ottico | Carl Zeiss AG |
Riferimenti
- Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications. Biomater Sci. 3 (1), 12-24 (2015).
- Elenbaas, B., et al. Human breast cancer cells generated by oncogenic transformat....
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Ristampe e permessi
