Imaging potenziale di membrana con due tipi di geneticamente codificati fluorescenti di sensori di tensione

Summary

Viene descritto un metodo per l'imaging dei cambiamenti nel potenziale di membrana utilizzando indicatori di tensione geneticamente codificati.

Abstract

Gli indicatori di tensione geneticamente codificati (GEVI) sono migliorati al punto che stanno iniziando ad essere utili per le registrazioni in vivo. Mentre l'obiettivo finale è quello di visualizzare l'attività neuronale in vivo, si deve essere in grado di visualizzare l'attività di una singola cellula per garantire il successo delle preparazioni in vivo. Questa procedura descriverà come visualizzare il potenziale di membrana in una singola cellula per fornire una base per l'imaging in vivo. Qui descriviamo i metodi per l'imaging di GEVI costituiti da un dominio di rilevamento del voltaggio fuso a una singola proteina fluorescente (FP) o a due proteine fluorescenti in grado di trasferire energia di risonanza di Förster (FRET) in vitro. L'utilizzo di uno splitter di immagini consente la proiezione simultanea di immagini create da due diverse lunghezze d'onda sulla stessa fotocamera CCD (Charge-Coupled Device). Lo splitter di immagini posiziona un secondo cubo filtro nel percorso della luce. Questo secondo cubo filtrante è costituito da un dicroico e due filtri di emissione per separare le lunghezze d'onda fluorescenti del donatore e dell'accettore a seconda degli FP del GEVI. Questa configurazione consente la registrazione simultanea dei partner fluorescenti accettori e donatori mentre il potenziale di membrana viene manipolato tramite la configurazione del patch clamp per l'intera cellula. Quando si utilizza un GEVI costituito da un singolo FP, il secondo cubo filtro può essere rimosso consentendo agli specchi nello splitter di immagini di proiettare una singola immagine sulla camera CCD.

Introduction

Il principale obiettivo di questo lavoro è quello di dimostrare l'imaging ottico delle variazioni di potenziali di membrana in vitro utilizzando proteine ​​fluorescenti geneticamente codificate. cambiamenti di imaging del potenziale di membrana offre l'eccitante possibilità di studiare l'attività dei circuiti neuronali. Quando i cambiamenti nella membrana risultato potenziale in un cambiamento intensità di fluorescenza, ogni pixel della telecamera diventa un elettrodo surrogata per misure non intrusivi di attività neuronale. Da oltre quarant'anni, coloranti organici voltaggio-sensibile sono stati utili per osservare i cambiamenti nel potenziale di membrana <....

Protocol

dichiarazione etica: Il protocollo sperimentazione animale è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso KIST protocollo animale 2014-001.

1. Installazione apparecchiature

1. configurazione Imaging
   1. Inserire un microscopio invertito a fluorescenza su un tavolo isolamento dalle vibrazioni. Utilizzare un alto ingrandimento (lente immersione in olio 60X con 1,35 apertura numerica) lente obiettivo e un cubo filtrante con uno specchio dicroico e filtri adatti per le proteine ​​fluorescenti utilizzate per imaging tensione.
      Nota: Questa configurazione utilizza un microscopio invertito per....

Results

Transitoriamente cellule transfettate possono presentare una significativa variazione di intensità di fluorescenza e il grado di espressione membrana plasmatica. Anche sullo stesso vetrino alcune cellule avranno diversi livelli di fluorescenza interna. Questo è probabilmente dovuto alla quantità di agente trasfezione assorbita dalla cella. Di tanto in tanto, troppo espressione fa sì che la cellula di sperimentare la risposta proteina spiegato con conseguente apoptosi ²⁷ (lumin.......

Discussion

Il sistema nervoso utilizza tensione in diversi modi, inibizione provoca un leggero iperpolarizzazione, ingresso sinaptica provoca un leggero depolarizzazione e un'azione potenziali risultati in un cambiamento relativamente grande tensione. La possibilità di misurare le variazioni del potenziale di membrana dalla Gevis offre il potenziale promettente di analizzare diversi componenti di circuiti neuronali contemporaneamente. In questo rapporto si dimostra un metodo fondamentale per le modifiche di imaging del potenzi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopio Invertito	Obiettivo Olympus	IX71
60X (apertura numerica = 1,35)	Olympus	UPLSAPO 60XO
Filtro di eccitazione	Semrock	FF02-472/30	Per l'imaging di tensione della pHluorin super eclittica in Bongwoori
Specchio dicroico	Semrock	FF495-Di03-25x36
Filtro di emissione	Semrock	FF01-497/LP
75W Lampada ad arco allo xeno	CAIRN	OptoSource	Illuminatore LED e laser sono anche sorgenti luminose efficaci
Telecamera CCD a bassa velocità	Hitachi	KP-D20BU
Adattatore per fotocamera a doppia porta	Olympus	U-DPCAD
Telecamera CCD ad alta velocità	RedShirtImaging, LLC	NeuroCCD-SM
Splitter di immagini	CAIRN	Optosplit 2
Filtro di eccitazione	Semrock	FF01-475/23-25	Per l'imaging della tensione di GEVI basato su coppie FRET composto da Clover e mRuby2)
Specchio dicroico	Semrock	FF495-Di03-25x36
Filtro di emissione	Chroma	ET520/40
Specchio dicroico	Semrock	FF560-FDi01-25X36
Filtro di emissione	Chroma	ET645/75
Sistema di isolamento dalle vibrazioni	Sistemi cinetici	250BM-IC, 5702E-3036-31
Camera di patching	Warner instruments	RC-26G, 64-0235
#0 Micro Coverglass (22 x 40 mm)	Microscopia elettronica Sciences	72198-20
Regolatore di temperatura	Warner instruments	TC-344B
#0 (0,08 ~ 0,13 mm) - vetrino coprioggetti in vetro diametro 10 mm	Ted Pella	260366
Agente di lipofezione	Life Technologies	11668-027
Reagente fosfato di calcio	Clontech - Takara	631312
Amplificatore patch clamp		USB HEKA	EPC 10
Software di acquisizione dati multicanale	HEKA	Patchmaster
Software di acquisizione e analisi delle immagini	RedShirtImaging	Neuroplex
Software applicativo per fogli di calcolo	Microsoft	Microsoft Excel 2010
Software	di analisi datiOriginLab	OriginPro 8.6.0
Lente d'ingrandimento	Qioptiq LINOS	Optem Accoppiatore fotocamera standard 0,38x SC38 J clamp
Microscopio confocale	Nikon	Nikon A1R
Reagente anti-sbiadimento	Life Technologies	P36930