Imaging potenziale di membrana con due tipi di geneticamente codificati fluorescenti di sensori di tensione

Summary

Viene descritto un metodo per l'imaging dei cambiamenti nel potenziale di membrana utilizzando indicatori di tensione geneticamente codificati.

Abstract

Gli indicatori di tensione geneticamente codificati (GEVI) sono migliorati al punto che stanno iniziando ad essere utili per le registrazioni in vivo. Mentre l'obiettivo finale è quello di visualizzare l'attività neuronale in vivo, si deve essere in grado di visualizzare l'attività di una singola cellula per garantire il successo delle preparazioni in vivo. Questa procedura descriverà come visualizzare il potenziale di membrana in una singola cellula per fornire una base per l'imaging in vivo. Qui descriviamo i metodi per l'imaging di GEVI costituiti da un dominio di rilevamento del voltaggio fuso a una singola proteina fluorescente (FP) o a due proteine fluorescenti in grado di trasferire energia di risonanza di Förster (FRET) in vitro. L'utilizzo di uno splitter di immagini consente la proiezione simultanea di immagini create da due diverse lunghezze d'onda sulla stessa fotocamera CCD (Charge-Coupled Device). Lo splitter di immagini posiziona un secondo cubo filtro nel percorso della luce. Questo secondo cubo filtrante è costituito da un dicroico e due filtri di emissione per separare le lunghezze d'onda fluorescenti del donatore e dell'accettore a seconda degli FP del GEVI. Questa configurazione consente la registrazione simultanea dei partner fluorescenti accettori e donatori mentre il potenziale di membrana viene manipolato tramite la configurazione del patch clamp per l'intera cellula. Quando si utilizza un GEVI costituito da un singolo FP, il secondo cubo filtro può essere rimosso consentendo agli specchi nello splitter di immagini di proiettare una singola immagine sulla camera CCD.

Introduction

Il principale obiettivo di questo lavoro è quello di dimostrare l'imaging ottico delle variazioni di potenziali di membrana in vitro utilizzando proteine ​​fluorescenti geneticamente codificate. cambiamenti di imaging del potenziale di membrana offre l'eccitante possibilità di studiare l'attività dei circuiti neuronali. Quando i cambiamenti nella membrana risultato potenziale in un cambiamento intensità di fluorescenza, ogni pixel della telecamera diventa un elettrodo surrogata per misure non intrusivi di attività neuronale. Da oltre quarant'anni, coloranti organici voltaggio-sensibile sono stati utili per osservare i cambiamenti nel potenziale di membrana ^1-4. Tuttavia, questi coloranti mancano di specificità cellulare. Inoltre, alcuni tipi di cellule sono difficili da macchiare. indicatori di tensione geneticamente codificati (GeViS) superare queste limitazioni avendo le cellule da studiare specificamente esprimono la sonda fluorescente tensione-sensibili.

Ci sono tre classi di Gevis. La prima classe di GEVI utilizza il vodominio della fosfatasi tensione-sensing ensione-sensing con una singola proteina fluorescente (FP) ^5-9 o un paio ^10-12 un Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET). La seconda classe di sensori utilizza microbica rodopsina come indicatore fluorescente direttamente ^13-15 o tramite FRET elettrocromico ^16,17. La terza classe utilizza due componenti, il componente genetica essendo un FP membrana ancorata ed un secondo componente essendo una membrana vincolato tempra colorante ^18-20. Mentre il secondo e terzo classi sono utili per esperimenti in vitro e fetta ^19,20, solo la prima classe di sensori sono attualmente utile per analisi in vivo ^6.

In questo rapporto ci sarà dimostrare l'imaging del potenziale di membrana utilizzando la prima classe di Gevis (figura 1) in vitro. Questa prima classe di sensori di tensione è il più facile da passare a imaging in vivo. Dal momento che Gevis utilizing un dominio di rilevamento della tensione fuso ad una FP sono circa 50 volte più luminoso classe rodopsina dei sensori, possono essere ripreso con illuminazione lampada ad arco anziché richiedere un laser estremamente potente. Un'altra conseguenza della disparità di luminosità è che la prima classe di GeViS può facilmente superare l'auto-fluorescenza del cervello. Le sonde rodopsina-based non può. La terza classe di sensore è altrettanto chiaro come la prima classe, ma richiede l'aggiunta di un quencher chimico che è difficile da gestire in vivo.

Noi, quindi, dimostrare l'acquisizione di una sonda con un singolo FP (Bongwoori) ⁸ e una sonda costituita da una coppia FRET (Nabi 2) ^12. Il FRET costruisce in questo rapporto sono versioni farfalla di VSFP-CR (proteine ​​fluorescenti voltaggio-sensibile - Clover-mRuby2) ¹¹ costituito da un donatore fluorescente verde, trifoglio, e un accettore fluorescente rossa, mRuby2, chiamato Nabi 2.242 e 2.244 Nabi

Figura 1. due tipi di indicatori geneticamente codificati tensione (Gevis) Divisori stampati in questo rapporto (A) Un FP mono basato GEVI avere un dominio di tensione-sensing trans-membrana e una proteina fluorescente. (B) Un GEVI basato FRET composto da un dominio di tensione-sensing trans-membrana, un donatore tasto e accettore. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Protocol

dichiarazione etica: Il protocollo sperimentazione animale è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso KIST protocollo animale 2014-001.

1. Installazione apparecchiature

1. configurazione Imaging
   1. Inserire un microscopio invertito a fluorescenza su un tavolo isolamento dalle vibrazioni. Utilizzare un alto ingrandimento (lente immersione in olio 60X con 1,35 apertura numerica) lente obiettivo e un cubo filtrante con uno specchio dicroico e filtri adatti per le proteine ​​fluorescenti utilizzate per imaging tensione.
      Nota: Questa configurazione utilizza un microscopio invertito per utilizzare obiettivi con maggiore NA, ma microscopi verticali può anche essere usato. Infatti, il microscopio invertito è solo per lo sviluppo sonda dal maggiore apertura numerica (NA) dell'obiettivo obiettivo raccoglie più luce di quella con un basso NA migliorando così il rapporto segnale-rumore (SNR, può essere descritto come il segnale ottico picco diviso dal deviazione standard della linea di basefluorescenza) della registrazione. Per i non-sviluppatori, si consiglia un microscopio in posizione verticale per applicazioni quali fetta o nelle registrazioni vivo.
   2. Preparare una sorgente luminosa, ad es., Xenon lampada ad arco, dotata di un otturatore meccanico per efficiente epifluorescenza immagini a grande campo. Dirigere la luce al microscopio tramite una guida di luce di montaggio. La luce passa attraverso il filtro di eccitazione e viene riflessa dal primo specchio dicroico nel cubo filtro. Allineate la luce per illuminare il campione uniformemente con intensità luminosa massimizzato il campo di vista ^21.
      Nota: Tradizionalmente, una lampada ad arco da 75 watt è stata utilizzata da più elevati lampadine wattaggio creano più grande, ma non i campi di illuminazione più brillanti. I laser possono essere usati ma sono limitati ad una singola lunghezza d'onda. I LED sono sempre più luminoso e possono effettivamente essere la fonte luminosa preferita offrendo molteplici lunghezze d'onda e che non richiedono un otturatore meccanico.
   3. Montare le due telecamere CCD a flmicroscopio za come mostrato nella figura 2D.
      Nota: La prima camera CCD è ad alta risoluzione spaziale e viene utilizzato per l'identificazione di una cellula che esprime il GEVI nella membrana plasmatica da testare. Per le modifiche di imaging del potenziale di membrana, in modo che la seconda camera CCD ha una struttura alto tasso quali 1.000 frame al secondo (fps). Utilizzare un adattatore per fotocamera doppia porta (figura 2D (3)) per cambiare il percorso per immagini tra le due telecamere CCD. In questa configurazione, un demagnifier viene utilizzato per adattare l'immagine dalla lente dell'obiettivo sul chip CCD nella seconda camera CCD.
   4. Installare uno splitter immagine tra il primo (lento) e il secondo telecamere CCD (veloce) per l'imaging di GEVI basato FRET. Inserire un cubo filtro avente uno specchio dicroico (560 nm) e due filtri di emissione (520 nm / 40 e 645 nm / 75) nella splitter immagine. Questo si tradurrà in due campi di vista, uno per la fluorescenza del donatore e l'altro rappresenta la fluorescenza accettore. Rimuovere questo sFiltro econda cubo quando l'imaging un GEVI con una sola FP.
      Nota: Il singolo GEVI basato FP testato in questo metodo è Bongwoori che utilizza la FP, super eclittica pHluorin A227D (SE A227D). Il filtro di eccitazione (472 nm / 30), filtro per le emissioni (497 nm / passaggio lungo) e lo specchio dicroico (495 nm) sono stati selezionati in base alla sua eccitazione ed emissione spettri ^5. Generalmente, i filtri di eccitazione e di emissione dovrebbe avere la più grande sovrapposizione con ogni spettro del fluoroforo per acquisire un'immagine luminosa, mentre i blocchi specchio dicroico qualsiasi luce di eccitazione trasmessa attraverso il filtro per le emissioni. La selezione dei filtri e specchi dicroici per la registrazione GEVI basato FRET coppia ¹¹ segue lo stesso principio, tranne che richiede un secondo cubo filtro nel splitter immagine per simultanea osservazione di donatore e accettore di fluorescenza. Il primo cubo filtro posto nella scatola filtro microscopio deve avere un filtro di eccitazione (475 nm / 23) di trifoglio. Poi il emessa fluorescence sia PQ sarà trasmessa al secondo cubo filtro attraverso il primo specchio dicroico (495 nm). Il secondo cubo filtro ha uno specchio dicroico (560 nm) e due filtri di emissione (520 nm / 40 per il trifoglio e 645 nm / 75 per mRuby2) per ogni FP separando così la fluorescenza da due diversi PQ.

		Singolo GEVI basato FP (Bongwoori)	FRET coppia GEVI base (Nabi 2.42 e 2.44 Nabi)
Prima cubo filtro posto nel microscopio	filtro di eccitazione	472 nm / 30	475 nm / 23
	specchio dicroico	495 nm	495 nm
	filtro per le emissioni	497 nm / passaggio lungo	-
Secondo cubo filtro posto nel divisore di fascio	specchio dicroico	-
	filtro per le emissioni 1	-	520 nm / 40
	filtro per le emissioni 2	-	645 nm / 75

Tabella 1. Due filtro differente set utilizzati per una singola GEVI FP base e un FRET Based GeVi Recordings

2. isolamento delle vibrazioni
   1. Non montare le apparecchiature con lo spostamento dei componenti sul tavolo isolamento dalle vibrazioni. Assicurarsi che i cavi che sono collegati ad apparecchiature non isolato sono sciolti per evitare vibrazioni del campione.
3. camera di patch clamp
   1. Sigillare la parte inferiore della camera di patch clamp con un sottile # 0 coprioggetto poiché la distanza di lavoro dell'obiettivo è relativamente piccola. Questo è uno svantaggio della configurazione microscopio invertito.
      Nota: Come un compromesso di avere una elevata lente obiettivo NA, la distanza di lavoro diminuisce. Al fine di collocare la SPECIMen entro il breve distanza di lavoro, il vetro di copertura e il coprioggetto (step 2) devono essere il più sottile possibile.
4. Controllo della temperatura
   1. Assicurarsi che la soluzione del bagno scorre attraverso un regolatore di temperatura per mantenere le cellule rattoppate circa 33 ^{° C} tutto l'esperimento.
5. collegamenti dell 'apparecchiatura
   1. Collegare l'amplificatore patch clamp e l'otturatore meccanico della fonte di luce alla scatola di comando baionetta Neill-Concelman (BNC) della telecamera CCD ad alta velocità. Ciò consentirà il software di imaging per controllare l'amplificatore, videocamera, e la sorgente luminosa simultaneamente.
      Nota: i componenti elettrici e di imaging devono essere sincronizzati in modo da fornire registrazioni elettriche ed ottiche simultanee di attività elettrica.

Figura 2. EquipSetup mento per l'imaging di tensione con GeViS Il workflow seguendo il percorso ottico, (A) lampada ad arco 75W Xenon, (B) la luce di eccitazione dalla lampada ad arco viene filtrato dal filtro di eccitazione e quindi riflessa dal primo specchio dicroico prima che raggiunge il portaoggetti, un inserto in alto a destra mostra l'intera configurazione della cella, (C) la telecamera CCD lenta velocità viene utilizzato per aiutare sia scelta di un morsetto cellulare e patch, (D) della parte di acquisizione dell'immagine; (1) la fotocamera CCD ad alta velocità, (2) lo splitter immagine sia per Fret l'associazione e la mono FP Gevis, (3) la demagnifier per adattare l'immagine sul chip CCD nella telecamera CCD ad alta velocità, (4) il dual port adattatore videocamera di commutare il percorso imaging e (5) la telecamera lenta CCD velocità con elevata risoluzione spaziale per l'identificazione della cella di patch, (e & F) l'acquisizione di immagini con una base singola FP GEVI (e) ed un GEVI FRET-based(F). Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

2. Espressione dei Gevis

1. In embrionali umane del rene 293 cellule
   1. Cultura embrionale umano Rene 293 (HEK 293) cellule con medie di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino ^a 37 ° C in un incubatore CO ₂ (5% di CO _2). Utilizzare un piatto di coltura di tessuti con diametro di 100 mm e 20 mm di altezza. Avviare la coltura con 2 x 10 ³ - 6 x 10 ³ cellule / cm ² e incubare fino a raggiungere 80-90% di confluenza per la successiva trasfezione.
   2. Il giorno della transfezione, aspirare i media di cellule e lavare delicatamente una volta con tampone fosfato Dulbecco. Disperdere le cellule HEK 293 con soluzione di tripsina-EDTA 0,25% per 1-2 minuti, aspirare la soluzione e toccare delicatamente il lato del piatto per staccare il cells. Aggiungere DMEM fresco (10% FBS) e dissociare le cellule aggregata pipettando. Determinare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro.
   3. Inserite 0,08 - 0,13 millimetri di spessore, 10 mm di diametro coprioggetto pre-rivestito con poli-L-lisina in un 24-pozzetti di coltura tissutale. Seme le cellule HEK 293 su vetrini a 1 x 10 ⁵ cellule / cm ² densità cellulare.
      Nota: Poiché HEK 293 cellule sono in grado di formare giunzioni tra loro, il numero di semi deve produrre cellule isolate.
   4. Transitoriamente trasfezione le cellule con un adeguato costrutto gene che codifica per una GEVI utilizzando un reagente lipofezione seguendo le istruzioni del produttore.
      Nota: I costrutti genici utilizzata in questa fase pcDNA3.1 utilizzata (Bongwoori) e pUB2.1 (Nabi 2.242) come vettori backbone. La quantità di DNA utilizzata era di 100 ng per ogni vetrino; Tuttavia, le condizioni di trasfezione devono essere determinati empiricamente per ogni GEVI da testare.
2. In hip dissociata del mouseneuroni primari pocampal
   1. Sezionare ippocampi dal giorno embrionale 17 topi C57BL6 / N e quindi dissociare i neuroni dell'ippocampo come descritto in precedenza ^22,23.
   2. Piastra i neuroni dissociati Onto poli-D-lisina rivestite 0.08-0.13 mm di spessore, 10 coprioggetto mm di diametro a 1 x 10 ⁵ cellule / ml densità delle cellule. Incubare le cellule a 37 ^{° C in} CO _{2 incubatore} (5% di CO _2).
   3. Trasfezione neuroni dissociati transitoriamente a 6 - 7 giorni in vitro (DIV) con un costrutto gene codificante una GEVI utilizzando un reagente di trasfezione fosfato di calcio come descritto in precedenza ^24.
      Nota: I costrutti genici utilizzata in questa fase pcDNA3.1 utilizzata (Bongwoori) e pUB2.1 (Nabi 2.244) come vettori backbone. La quantità di DNA utilizzato è stato di 1 mg per ogni coprioggetto. Ancora una volta, le condizioni di trasfezione devono essere determinati empiricamente per ogni GEVI testato.
3. Controllare il livello di espressione prima di tensione imaging
   1. Prendere la piastra di coltura tissutale dall'incubatore CO ₂ e osservare la fluorescenza dalle cellule trasfettate con un microscopio a epifluorescenza.
   2. Dopo aver confermato la fluorescenza dalla membrana, trasferire il vetrino alla camera di patch per imaging di tensione nella sezione 3.
      Nota: la tensione di imaging è condotto 16 - 24 ore dopo la trasfezione. Tuttavia, come diverse proteine ​​fluorescenti hanno diversi tempi di maturazione, alcuni Gevis bisogno di più tempo in trasfezione posta. Per esempio, le coppie FRET contenenti mRuby2 in questo protocollo potrebbe richiedere più tempo per esprimere in quanto la maturazione di mRuby2 prende significativamente più lungo rispetto Clover ^11. La fluorescenza del donatore e accettore deve essere controllato.

3. Tensione Imaging Protocol

1. Scegli una cellula sana con buona espressione di membrana
   1. Utilizzando la microscopia, trovare una cellula sana (Figura 4B) che mostra una fortemembrana fluorescenza localizzato rispetto alla fluorescenza interna. Cercate di non rattoppare le cellule arrotondate. cellule circolari sono sia divisione o morire e sono difficili da correggere. Applicare un impulso di prova di 5,0 mV in msec di ampiezza e 5,0 in durata per aiutare esperimenti successivi patch clamp.
2. Preparare la cella per l'imaging di tensione
   1. Dopo aver scelto una cella per patch, posizionare la pipetta patch clamp sopra la cella. Portare la pipetta verso il basso fino a toccare delicatamente la membrana cellulare. A questo punto, osservare 1 MW - 2 MW aumento della resistenza della membrana sulla patch software morsetto ^25.
      NOTA: Occasionalmente, una buona tenuta giga ohm può avvenire semplicemente toccando la membrana cellulare. Finché il sigillo giga ohm è stabile, dovrebbe essere OK.
   2. Stabilire un sigillo giga ohm applicando delicatamente pressione negativa attraverso la pipetta. Impostare il potenziale pipetta ad un potenziale tiene desiderato.
   3. Pur mantenendo il sigillo giga ohm, The cella con la fotocamera CCD ad alta velocità e concentrarsi alla zona della membrana.
   4. Rompere la membrana cellulare applicando impulsi di aspirazione per bocca o siringa delicatamente per fare una configurazione a cellula intera ^26.
   5. Immagine patch bloccato cella sotto una configurazione tutta morsetto cella secondo il disegno sperimentale utilizzando un software di imaging
      1. Avviare il software di imaging. Fare clic su [Acquisisci] - menu [SciMeasure fotocamera] per aprire la pagina 'RILEVAZIONE CCD'.
      2. Creare un nuovo file di dati per salvare le immagini.
      3. Fare clic su [Uscita analogica] e poi [Leggi l'ASCII] per aprire un file di protocollo impulso di condurre l'imaging. Fare clic su 'la media dei ripetizioni interne' se i dati devono essere mediati. Poi chiudere la pagina 'USCITA ANALOGICA'.
         Nota: deve essere progettato e salvato come file '.txt' a seconda dello scopo di ogni esperimento prima di questa fase Questo protocollo impulsi.
      4. Impostare dell'acquis specificoparametri gnote dalla pagina 'RILEVAZIONE CCD'. Inserire i valori specifici per 'Numero di fotogrammi per l'acquisizione' e 'numero di prove'.
         Nota: Il numero di frame è determinata dalla velocità di acquisizione e la tempistica del protocollo impulsi. Per esempio, se l'imaging a 1 kHz, 1.000 fotogrammi equivale a 1 sec di tempo di registrazione.
      5. Fare clic su [prendere i dati (Ottica + BNC)] per avviare la registrazione. Mentre la tensione di imaging è in atto, guardare la finestra oscilloscopio dal software patch clamp per garantire la configurazione cellula intera stabile durante la registrazione.
         Nota: Per testare gamma di tensioni di risposta del GEVI, formato del segnale in Af / valore F o risoluzione temporale in tutta la gamma di tensione fisiologica, condurre un intero esperimento morsetto di tensione delle cellule con impulsi di tensione un protocollo impulso di aver fatto un passo che vanno da -170 mV a 130 mV. Per determinare le prestazioni del GEVI nella risoluzione dei potenziali d'azione evocati da Prima coltaneuroni Ry, immagine della cella in una configurazione pinza amperometrica cellule intere.

4. Acquisizione dati

1. Calcolo di Af / F
   1. Avviare il software di imaging. Fare clic su [File] - [Lettura dati File] per aprire un file di dati da analizzare. Osservare l'immagine Cella nella sua intensità Riposo Luce (RLI) sul lato destro
      Nota: Le medie software i primi 5 fotogrammi per determinare RLI della registrazione.
   2. Clicca su 'Mostra' BNC per portare i valori di corrente e tensione misurata sullo schermo.
   3. Cambiare il modo di pagina dal 'RLI telaio' a 'sottrazione Frame' di utilizzare la funzione di cornice sottrazione di identificare i pixel con segnali ottici sensibili. Questo è il vero potere delle immagini dal momento che ogni pixel può essere esaminato per eventuali cambiamenti di fluorescenza.
   4. Selezionare due punti di tempo (F ₀ e F ₁₎ per la sottrazione. Identificare quale area della cella èmostrando segnali di rispondere ai cambiamenti potenziale di membrana.
      Nota: Il SNR per le immagini telaio sottrazione può essere migliorata selezionando più fotogrammi per ciascun punto di tempo a media temporale del segnale. Il software sottrae l'intensità della luce media tratto da fotogrammi selezionati e calcola i valori F ₁ -F ₀ (Af). Di solito si sceglie un punto di volta acquisita presso l'azienda potenziale punto e un altro tempo impiegato durante il periodo di stimolazione.
   5. Designare i pixel che devono essere analizzati mediante trascinamento o facendo clic su ogni pixel con il mouse del computer. Osservare la rappresentazione grafica l'intensità media di fluorescenza dai pixel selezionati sul lato sinistro della finestra del software. Figure 4B e 5B mostrano immagini rappresentative dall'analisi fotogramma sottrazione.
   6. Dividere i pixel sottratti dal RLI (F _0). Fare clic su [Dividere per RLIs] per acquisire valori Af / F
2. Esporta dati
   Calcolare i valori Af / F per ogni passaggio di tensione per analizzare ulteriormente tensione proprietà di rilevamento del GeVi. Utilizzare questi valori per disegnare grafici quali Af / F rispetto alla tensione per i dati successive analisi.
3. Rimuovere i grafici di corrente e tensione per Cliccando di menù 'Mostra BNC. Vai a [OUTPUT] - [Salva Tracce come visualizzato (ASCII)] per esportare la traccia di fluorescenza in un formato di file ASCII per curva di analisi raccordo con software grafici standard.

Analisi 5. I dati

1. Tensione di proprietà di rilevamento della GEVI
   1. Disegnare la variazione di fluorescenza rispetto al grafico di tensione (FV) riportando i valori Af / F rispetto alla tensione in un programma di analisi dei dati. Montare la curva a una funzione di Boltzmann (Tabella 2) per determinare il range di tensione del segnale ottico facendo clic su [ANALISI] - [montaggio] - [in forma sigmoidale] - [finestra di dialogo Apri], e quindi scegliere la funzione di Boltzmann.
      Nota: Montaggio a una funzione rende possible per caratterizzare le proprietà di tensione di rilevamento di diverse sonde di tensione o per confrontare le loro prestazioni in celle diverse. La funzione Boltzmann può essere utilizzata per le sonde testati in questo lavoro perché le curve FV di tali sonde mostrano modello sigmoidale.
   2. Normalizzare ogni valore Af / F utilizzando i valori iniziali e finali (A ₁ e A ₂₎ calcolato dalla funzione.
      Nota: Nella equazione di Boltzmann, il minimo è di ₁ A e il massimo è A _2. Per la normalizzazione, utilizzare un software di foglio di calcolo per regolare i valori Af / F definendo un ₁ come zero e A _{2 come} uno. La media dei valori normalizzati Af / F e calcolare l'errore standard per l'analisi statistica.
   3. Replot l'Af normalizzato / valori F rispetto alla tensione come precedentemente descritto nel paragrafo 5.1.1).
2. La velocità della risposta ottica
   1. Aprire il file ASCII acquisita dal punto 4.2.2) con una analisi dei datiprogramma e tracciare la traccia Af / F in funzione del tempo.
   2. Clicca su 'selettore di dati' nel software di analisi dei dati e selezionare un punto temporale corrispondente all'inizio di un impulso di tensione a gradini e un secondo punto di tempo in cui il segnale ottico ha raggiunto il regime. Adatta questa gamma sia a un singolo e doppia funzione di decadimento esponenziale facendo clic su [ANALISI] - [montaggio] - [fit esponenziale] - [Apri finestra di dialogo], e selezionare una funzione di decadimento esponenziale. Segnala la misura migliore.
      Nota: Per il montaggio alle funzioni di decadimento esponenziale singole o doppie, le costanti di tempo quantificati rappresentati da τ possono essere acquisite. Ciò contribuirà a sperimentatori confrontare la cinetica delle loro misurazioni effettuate con indicatori di tensione differenti. La traccia di fluorescenza potrebbe mostrare componenti veloci e lenti che possono essere descritte con una doppia funzione di decadimento esponenziale. In questo caso, il calcolo si tradurrà in due costanti di tempo con ampiezze diverse.
   3. Calcola °e costanti ponderata T per confrontare la cinetica di sonde che presentano due componenti temporali alle sonde con un singolo componente.
      Nota: Un tau ponderato è calcolato come la somma di τ ₁ moltiplicata per la relativa ampiezza, A _{1, più} τ ₂ moltiplicato per la relativa ampiezza, A _2, come definito dalla seguente formula;

Results

Transitoriamente cellule transfettate possono presentare una significativa variazione di intensità di fluorescenza e il grado di espressione membrana plasmatica. Anche sullo stesso vetrino alcune cellule avranno diversi livelli di fluorescenza interna. Questo è probabilmente dovuto alla quantità di agente trasfezione assorbita dalla cella. Di tanto in tanto, troppo espressione fa sì che la cellula di sperimentare la risposta proteina spiegato con conseguente apoptosi ²⁷ (lumin...

Discussion

Il sistema nervoso utilizza tensione in diversi modi, inibizione provoca un leggero iperpolarizzazione, ingresso sinaptica provoca un leggero depolarizzazione e un'azione potenziali risultati in un cambiamento relativamente grande tensione. La possibilità di misurare le variazioni del potenziale di membrana dalla Gevis offre il potenziale promettente di analizzare diversi componenti di circuiti neuronali contemporaneamente. In questo rapporto si dimostra un metodo fondamentale per le modifiche di imaging del potenzi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopio Invertito	Obiettivo Olympus	IX71
60X (apertura numerica = 1,35)	Olympus	UPLSAPO 60XO
Filtro di eccitazione	Semrock	FF02-472/30	Per l'imaging di tensione della pHluorin super eclittica in Bongwoori
Specchio dicroico	Semrock	FF495-Di03-25x36
Filtro di emissione	Semrock	FF01-497/LP
75W Lampada ad arco allo xeno	CAIRN	OptoSource	Illuminatore LED e laser sono anche sorgenti luminose efficaci
Telecamera CCD a bassa velocità	Hitachi	KP-D20BU
Adattatore per fotocamera a doppia porta	Olympus	U-DPCAD
Telecamera CCD ad alta velocità	RedShirtImaging, LLC	NeuroCCD-SM
Splitter di immagini	CAIRN	Optosplit 2
Filtro di eccitazione	Semrock	FF01-475/23-25	Per l'imaging della tensione di GEVI basato su coppie FRET composto da Clover e mRuby2)
Specchio dicroico	Semrock	FF495-Di03-25x36
Filtro di emissione	Chroma	ET520/40
Specchio dicroico	Semrock	FF560-FDi01-25X36
Filtro di emissione	Chroma	ET645/75
Sistema di isolamento dalle vibrazioni	Sistemi cinetici	250BM-IC, 5702E-3036-31
Camera di patching	Warner instruments	RC-26G, 64-0235
#0 Micro Coverglass (22 x 40 mm)	Microscopia elettronica Sciences	72198-20
Regolatore di temperatura	Warner instruments	TC-344B
#0 (0,08 ~ 0,13 mm) - vetrino coprioggetti in vetro diametro 10 mm	Ted Pella	260366
Agente di lipofezione	Life Technologies	11668-027
Reagente fosfato di calcio	Clontech - Takara	631312
Amplificatore patch clamp		USB HEKA	EPC 10
Software di acquisizione dati multicanale	HEKA	Patchmaster
Software di acquisizione e analisi delle immagini	RedShirtImaging	Neuroplex
Software applicativo per fogli di calcolo	Microsoft	Microsoft Excel 2010
Software	di analisi datiOriginLab	OriginPro 8.6.0
Lente d'ingrandimento	Qioptiq LINOS	Optem Accoppiatore fotocamera standard 0,38x SC38 J clamp
Microscopio confocale	Nikon	Nikon A1R
Reagente anti-sbiadimento	Life Technologies	P36930