Au-Interazione di SLP1 Polimeri e monostrato da Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS e AFM come strumenti di studi Biomolecule metallo

Sommario

Per ottenere informazioni di base sull'assorbimento e il riciclaggio dell'oro dai sistemi acquosi, è stata studiata l'interazione delle nanoparticelle Au(III) e Au(0) sulle proteine dello strato S. L'assorbimento dei polimeri proteici è stato studiato mediante ICP-MS e quello dei monostrati proteici mediante QCM-D. Il successivo AFM consente l'imaging delle nanostrutture.

Abstract

In questa pubblicazione viene descritto il comportamento di assorbimento dell'oro delle proteine dello strato superficiale (S-layer) (Slp1) di Lysinibacillus sphaericus JG-B53. Queste biomolecole si dispongono in matrici bidimensionali paracristalline sulle superfici, legano i metalli e sono quindi interessanti per diverse applicazioni biotecnologiche, come i materiali bioassorbenti per la rimozione o il recupero di diversi elementi dall'ambiente e dai processi industriali. La deposizione di nanoparticelle di Au(0) su strati S, sia mediante sintesi diretta dello strato S ¹ che adsorbimento di nanoparticelle, apre nuove possibilità per diverse applicazioni sensoriali. Sebbene numerosi studi abbiano descritto le proprietà di bioassorbimento degli strati S ^2-5, una comprensione più approfondita dell'interazione proteina-proteina e proteina-metallo rimane ancora impegnativa. Nello studio seguente, la spettrometria di massa accoppiata induttivamente (ICP-MS) è stata utilizzata per il rilevamento dell'assorbimento di metalli da parte di strati S sospesi. Ciò è stato correlato alle misurazioni della microbilancia a cristalli di quarzo con monitoraggio della dissipazione (QCM-D), che consente il rilevamento online della formazione di monostrati proteici e della deposizione di metalli e, quindi, una comprensione più dettagliata del legame dei metalli.

I risultati dell'ICP-MS hanno indicato che il legame di Au(III) ai polimeri dello strato S sospeso dipende dal pH. Il massimo legame di Au(III) è stato ottenuto a pH 4,0. Le indagini QCM-D hanno permesso di rilevare l'assorbimento di Au(III) e la deposizione di Au(0)-NP in tempo reale durante gli esperimenti in situ. Inoltre, questo metodo ha permesso di studiare l'influenza del legame metallico sulla stabilità del reticolo proteico di Slp1. Le proprietà strutturali e la stabilità dello strato proteico possono essere visualizzate direttamente dopo l'esperimento QCM-D utilizzando la microscopia a forza atomica (AFM). In conclusione, la combinazione di questi diversi metodi fornisce una comprensione più approfondita del legame del metallo da parte delle proteine batteriche dello strato S in sospensione o come monostrati su cellule batteriche o superfici ricristallizzate.

Introduzione

A causa della crescente uso di oro per diverse applicazioni come l'elettronica, catalizzatori, biosensori o strumenti medici, la domanda di questo metallo prezioso è cresciuta nel tempo degli ultimi anni ^6-9. L'oro così come molti altri metalli preziosi e pesanti vengono rilasciati nell'ambiente tramite scarichi industriali in concentrazioni diluite, attraverso attività minerarie, e lo smaltimento dei rifiuti ^7,8,10, anche se la maggior contaminazione ambientale da metalli pesanti o preziosi è un processo in corso principalmente causato da attività tecnologiche. Questo porta ad una interferenza significativa di ecosistemi naturali e potrebbe minacciare la salute umana ^9. La conoscenza di questi risultati negativi promuove la ricerca di nuove tecniche per rimuovere i metalli da ecosistemi e miglioramenti contaminati nel riciclaggio dei metalli dalle acque di scarico industriali. Metodi fisico-chimici ben affermati come precipitazione o scambio ionico non sono così efficaci, specialmente in altaly diluito soluzioni ^7,8,11. Bioassorbimento, sia con la vita o la biomassa morti, è un'alternativa interessante per trattamento delle acque reflue ^10,12. L'uso di tali materiali biologici può ridurre il consumo di prodotti chimici tossici. Molti microrganismi sono stati descritti per la costituzione o immobilizzare metalli. Per esempio, le cellule di Lysinibacillus sphaericus (L. sphaericus) JG-A12 hanno dimostrato elevate capacità di legame per i metalli preziosi, per esempio, Pd (II), Pt (II), Au (III), e altri metalli tossici come Pb (II) o U (VI) ^4,13, cellule di Bacillus megaterium per Cr (VI) ^14, le cellule di Saccharomyces cerevisiae per Pt (II) e Pd (II) ^15, e Chlorella volgare Au (III) e U (VI) ^{16 , 17.} Il legame di metalli precedenti, come Au (III), Pd (II), e Pt (II) è stato riportato anche per Desulfovibrio desulfuricans ¹⁸ e per L. sphaericus JG-B53 ^19,20. Tuttavia, non all microbi legano elevate quantità di metalli e la loro applicazione come materiale sorbitive è limitato ^12,21. Inoltre, la capacità di legame del metallo dipende da diversi parametri, ad esempio, la composizione delle cellule, il bio-componente utilizzato, o ambientali e condizioni sperimentali (pH, forza ionica, temperatura etc.). Lo studio di frammenti di parete cellulare isolati ^22,23, come lipidi di membrana, peptidoglicano, proteine ​​o altri componenti, aiuta a comprendere il processo di complessi costruiti cellule intere ^8,21 vincolante metallo.

I componenti cellulari focalizzati su in questo studio sono proteine ​​S-layer. Proteine ​​S-strato sono parti della busta esterna delle cellule di molti batteri e di archeobatteri, e costituiscono circa il 15 - 20% della massa di proteine ​​totali di questi organismi. Come la prima interfaccia per l'ambiente, questi composti cellulari influenzano fortemente le proprietà di assorbimento batteriche ^3. Proteine ​​S-strato con peso molecolare compreso tra quarantaa centinaia di kDa sono prodotti all'interno della cellula, ma sono montati all'esterno dove sono in grado di formare strati sulle membrane lipidiche o componenti della parete cellulare polimerici. Una volta isolato, quasi tutti S-layer proteine ​​hanno la proprietà intrinseca di auto-assemblarsi spontaneamente in sospensione, alle interfacce, o su superfici che formano strutture planari o tube-like ^3. Lo spessore del monostrato proteine ​​dipende batteri ed è in un intervallo di 5 - 25 nm ^24. In generale, le strutture proteiche S-strato formato può avere un obliquo (P1 o P2), quadrato (P4), o esagonale (p3 o p6) simmetria con costanti reticolari 2,5 a 35 nm ^3,24. La formazione reticolare sembra essere in molti casi dipendono cationi bivalenti e principalmente su Ca ^{2+ 25,26, Raff, J. et al. S-layer a base di nanocompositi per applicazioni industriali a base di proteine ​​Engineered Nanostructures. (a cura di Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2}016 (presentato)). Tuttavia, la cascata reazione piena di monomero piegatura, interazione monomero-monomero, la formazione di un reticolo, e il ruolo dei diversi metalli, in particolare di cationi bivalenti come Ca ²⁺ e Mg ^2+, non sono ancora del tutto chiaro.

Il ceppo gram-positivi L. sphaericus JG-B53 (rinominato da Bacillus sphaericus dopo nuova classificazione filogenetica) ²⁷ è stato isolato dalla miniera di uranio rifiuti mucchio "Haberland" (Johanngeorgenstadt, Sassonia, Germania) ^4,28,29. La sua funzionale proteina S-layer (SLP1) possiede un reticolo quadrato, un peso molecolare di 116 kDa ^30, e uno spessore di ≈ 10 nm a vivere cellule batteriche ^31. In studi precedenti, la formazione in vitro di uno strato proteico chiuso e stabile con uno spessore di circa 10 nm è stato raggiunto in meno di 10 min ^19. Il ceppo correlate L. sphaericus JG-A12, anche un isolato dal mucchio "Haberland", possiede alta metallo capacità di legame e il suo isolato proteina S-layer ha mostrato un buon tasso di assorbimento chimica e stabilità meccanica e per i metalli preziosi come Au (III), Pt (II), e Pd (II) ^4,32,33. Questo legame di metalli preziosi è più o meno specifici per alcuni metalli e dipende dalla disponibilità di gruppi funzionali sulla superficie esterna della proteina e interna del polimero e nei suoi pori, forza ionica, e il valore del pH. Gruppi funzionali rilevanti per l'interazione metallo da parte delle proteine ​​sono COOH-, NH ₂ -, OH-, _PO 4 -, _SO 4 - e SO-. In linea di principio, capacità di legame metallo aprono un ampio spettro di applicazioni, ^{Raff, J. et al. S-layer a base di nanocompositi per applicazioni industriali a base di proteine ​​Engineered Nanostructures. (a cura di Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (presentato)).} ad esempio, come componenti biosorptive per la rimozione o recuperodi metalli tossici o pregiati disciolti, i modelli per sintesi o la deposizione di nanoparticelle definito regolarmente strutturati metalliche (NP) per la catalisi, e altri materiali bio-ingegneria, come bio-sensoriali strati ^3,5,18,33. Array NP regolarmente organizzati come Au (0) -NPs potrebbero essere utilizzati per le principali applicazioni che spaziano dall'elettronica molecolare e biosensori, dispositivi di storage ad altissima densità, e catalizzatori per CO-ossidazione ^34-37. Lo sviluppo di tali applicazioni e design intelligente di questi materiali richiede una comprensione più profonda dei meccanismi vincolanti metallo sottostante.

Un prerequisito per lo sviluppo di tali materiali bio-based è l'implementazione affidabile di un livello di interfaccia tra la biomolecola e la superficie tecnica ^38,39. Ad esempio, polielettroliti assemblati con il layer-by-layer (LBL) ^40,41 tecnica sono stati utilizzati come strato di interfaccia per ricristallizzazione proteine ​​S-strato ³⁹ . Tale interfaccia offre un modo relativamente semplice per eseguire il rivestimento proteico in modo riproducibile e quantitativa. Eseguendo esperimenti diversi con e senza modifiche con i promotori adesive, è possibile fare dichiarazioni riguardanti la cinetica di rivestimento, la stabilità strato, e l'interazione dei metalli con biomolecole ^{19,42, Raff, J. et al. S-layer a base di nanocompositi per applicazioni industriali a base di proteine ​​Engineered Nanostructures. (a cura di Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (presentato)).} Tuttavia, il complesso meccanismo di adsorbimento di proteine ​​e interazione proteina-superficie non è completamente noto. Soprattutto informazioni sulla conformazione, l'orientamento del modello, e la densità di rivestimento è ancora mancante.

Cristallo di quarzo microbilancia con il monitoraggio di dissipazione (QCM-D) la tecnica ha attirato l'attenzione negli ultimi anni come uno strumento per lo studio delle proteine, la cinetica di rivestimento, e l'interazione proprocessi su scala nanometrica ^19,43-45. Questa tecnica permette di rilevare dettagliata di adsorbimento di massa in tempo reale, e può essere utilizzato come indicatore per il processo di auto-assemblaggio di proteine ​​e di accoppiamento molecole funzionali su reticoli proteine ^{​​19,20,42,46-48.} Inoltre, le misure QCM-D aperta la possibilità di studiare processi di interazione del metallo con lo strato proteico in condizioni biologiche naturali. In un recente studio, l'interazione della proteina S-strato con metalli scelti come Eu (III), Au (III), Pd (II) e Pt (II) è stato studiato con QCM-D ^19,20. Lo strato proteina adsorbita può servire come un modello semplificato di una parete cellulare di batteri gram-positivi. Lo studio di questo singolo componente può contribuire a una più profonda comprensione delle interazioni metallo. Tuttavia, esclusivamente QCM-D esperimenti non consentono dichiarazioni riguardanti strutture superficiali e le influenze dei metalli alle proteine. Altre tecniche sono necessarie per ottenere tali informazioni. Una posbilità per immagini bio-nanostrutture e informazioni sulle proprietà strutturali ottenere è la microscopia a forza atomica (AFM).

L'obiettivo dello studio presentato era studiare l'assorbimento di oro (Au (III) e Au (0) -NPs) alle proteine ​​S-strato, in particolare SLP1 di L. sphaericus JG-B53. Gli esperimenti sono stati fatti con proteine ​​sospesi su scala batch in un intervallo di pH di 2,0 - 5,0 mediante ICP-MS e con immobilizzati S livelli utilizzando QCM-D. Inoltre, l'influenza della soluzione di sale di metallo sulla stabilità lattice è stata studiata con successivi studi AFM. La combinazione di queste tecniche contribuisce a una migliore comprensione dei processi di interazione in vitro in metallo come strumento per saperne di più su eventi in cellule batteriche intere riguardanti affinità metalliche specifiche vincolanti. Questa conoscenza non è solo cruciale per lo sviluppo di materiali filtranti applicabili per il recupero di metalli per la tutela dell'ambiente e la conservazione del reFonti ^49, ma anche per lo sviluppo di array di NP metalliche altamente ordinati per varie applicazioni tecniche.

Protocollo

1. di microrganismi e di coltivazione Condizioni

Nota:. Tutti gli esperimenti sono stati fatti in condizioni di sterilità L. sphaericus JG-B53 è stato ottenuto da una cultura crio-conservati ^29,30.

1. La cultura (1,5 ml) sotto il banco pulito trasferimento crio-conservati per 300 ml di brodo nutriente sterile (NB) media (3 g / L di estratto di carne, 5 g / l di peptone, 10 g / L di NaCl). Successivamente agitare la soluzione per almeno 6 ore a 30 ° C per ottenere la pre-coltura per la coltivazione.
2. Coltivare i batteri in condizioni aerobiche in NB mezzi a pH = 7,0, 30 ° C in 70 L scalata a vapore in-place bioreattore. Pertanto, riempire il reattore con ≈ 57 l di acqua deionizzata. Aggiungere e sciogliere i media NB solido direttamente a bioreattore (concentrazioni vedi sopra).
   1. Inoltre aggiungere agente antischiuma (30 ml / L NB-media) per i media a sopprimere la formazione di schiuma durante la coltivazione, poi in autoclave (122 ° C, temperatura di mantenimento di 30 min) i mediaall'interno della struttura del reattore.
3. Raffreddare i mezzi di comunicazione ed eseguire completa saturazione di ossigeno. Aggiustare il pH a 7,0 (1 utilizzando MH ₂ SO _{4 e 2} M NaOH) e avviare l'inoculazione automatica del 300 ml precoltura. Avviare la registrazione dei dati dei parametri di coltivazione nel punto di inoculazione. Log parametri online per esempio, il livello di ossigeno disciolto (DO _2), aggiunta di acido e di base, e del valore pH all'interno della coltivazione.
   1. Monitorare la crescita batterica in linea dalle misure di torbidità non invasive.
4. Eseguire campionamento supplementare dopo ogni ora di coltivazione e determinare ulteriore parametro come il peso bio secco (BDW) e la densità ottica offline (OD). Pertanto, raccogliere 20 ml di brodo coltura in ciascun punto di campionamento in condizioni sterili.
   1. Determinare offline OD da misurazioni fotometriche di adsorbimento a 600 nm. Utilizzare sterile filtrata NB-mezzo come un valore vuoto. A poppaer raggiungendo adsorbimento> 0,4 ​​diluire la sospensione cellulare segue la linearità della legge di Lambert-Beer.
   2. Per la determinazione del BDW centrifuga 1 a 5 ml di sospensione batterica (seconda densità delle cellule) a 5.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Essiccare il pellet cellulare ottenuta a 105 ° C in un forno di riscaldamento fino alla stabilità di massa e misurare la massa pellet.
5. Prendere immagini microscopiche con ottica di fase microscopio di ricerca contrasto 400 e 1000 ingrandimenti volte (contrasto di fase condensatore 2 e 3, rispettivamente) per il controllo della crescita batterica e come controllo contaminazione incrociata.
6. Dopo aver raggiunto la fase di crescita esponenziale rilevata dalla linea dO ₂ e torbidità online, raccogliere la biomassa mediante centrifugazione flow-through a 15.000 xg, a 4 ° C e lavare la biomassa due volte con tampone standard (50 mM Tris, 10 mM MgCl _2, 3 mM NaN _3, pH = 7,5).
   Nota: Il pellet biomassa ottenuta può essere conservato a -18 & #176; C sino al successivo utilizzo per l'isolamento.

2. S-layer Protein isolamento e purificazione

Nota: Purificare polimeri SLP1 secondo un metodo adatto come descritto in precedenza ^{2,19,30,32,50,51.}

1. Omogeneizzare la biomassa grezzo lavato e scongelato ottenuto dalla coltivazione in tampone standard (1: 1 (w / v)) per rimuovere flagelli usando un dispersore (livello 3, 10 min) sotto raffreddamento bagno di ghiaccio a 4 ° C.
2. Centrifugare la sospensione (8.000 xg, a 4 ° C per 20 min) e lavare il pellet ottenuto due volte con tampone standard (1: 1 (w / v)). Dopo il lavaggio e la centrifugazione (8000 xg, a 4 ° C per 20 min), risospendere il pellet nel tampone standard (1: 1 (w / v)), aggiungere DNasi II e RNasi (0,4 unità / g biomassa) alla sospensione e disintegrano le cellule a 1.000 bar con un omogeneizzatore ad alta pressione. Successivamente centrifugare la sospensione a 27.500 xg, a 4 ° C per 1 ora.
   Nota: sospensione cellulare di controllo con i mi di ricercacroscope. Rottura è completato quando meno di 2 - 3 cellule intatte sono visibili nel campo Vista del microscopio in 400 ingrandimenti piega.
3. Lavare due volte il pellet con tampone standard (1: 1 (w / v)) e ripetere la centrifugazione. Successivamente risospendere il pellet nel tampone standard (2: 1 (w / v)) mescolato con 1% Triton X-100 e incubare per 20 min sotto successive scuotimento (100 rpm) per solubilizzare depositi lipidici.
4. Centrifugare la soluzione (27.500 xg, a 4 ° C per 1 ora) e lavare i pellet ottenuti tre volte con tampone standard (1: 1 (w / v)).
5. Incubare il pellet ottenuto dopo centrifugazione supplementare (27.500 xg, a 4 ° C per 1 ora) per 6 ore in tampone standard (1: 1 (w / v)) miscelato con 0,2 g / L lisozima, per idrolizzare legami di peptidoglicano ^50. Inoltre aggiungere DNasi II e RNasi (ogni 0,4 unità / g biomassa) alla sospensione.
6. Dopo centrifugazione (45.500 xg, a 4 ° C, 1 ora), risospendere il fase proteica bianco superiore con un basso volume di tlui centrifugazione surnatante (<30 ml) contenenti subunità proteiche.
7. Solubilizzare la sospensione bianca mescolando 1: 1 con 6 M guanidina cloridrato (6 M GuHCl, 50 mM Tris, pH = 7,2). La soluzione diventa luminoso.
8. Eseguire filtrazione sterile (0,2 micron) della soluzione trattata GuHCl seguita da una centrifugazione ad alta velocità supplementare (45.500 xg, a 4 ° C per 1 ora).
9. Trasferire il surnatante in provette di membrana di dialisi (MWCO 50.000 Dalton) e dializzato contro tampone ricristallizzazione (TRIS 1,5 mm, 10 mM CaCl _2, pH = 8.0) per 48 ore.
10. Trasferire la soluzione di bianco polimero proteico ricristallizzato in provette e centrifugare a 45.500 xg, 4 ° C per 1 ora. Risospendere il pellet in un basso volume di acqua ultrapura (<30 ml).
11. Successivamente, trasferire la sospensione in tubi di membrana di dialisi e di eseguire una dialisi contro acqua ultrapura per 24 ore per rimuovere i contenuti del buffer.
    Nota: Diversi cambiamenti di tampone o acqua ultrapura durante la dialisi sono indispensabili.
12. Lyophilize il SLP1 purificato in un liofilizzatore.

3. Caratterizzazione e quantificazione di SLP1 per gli esperimenti

Nota: la concentrazione SLP1 per assorbimento e rivestimento esperimenti sono stati quantificati mediante spettrofotometria UV-VIS.

1. Pipettare 2 ml di campione SLP1 disciolto direttamente sul piedistallo di misura inferiore del fotometro. Determinare la concentrazione di proteine ​​di adsorbimento massima alla lunghezza d'onda di 280 nm, caratteristico per le proteine. Utilizzare il coefficiente di estinzione di 0.61 per determinare la concentrazione SLP1. Utilizzare soluzione gratuita SLP1 per misurazioni di riferimento.
2. Diluire la proteina con il tampone (per esperimenti di adsorbimento in modalità batch utilizzano 0,9% NaCl, pH = 6,0 e per esperimenti QCM-D utilizzano buffer di ricristallizzazione, pH = 8,0) alla concentrazione desiderata per esperimenti (1 g / L e 0,2 g / L rispettivamente).
3. Analizzare la qualità SLP1 e peso molecolare dal bioanal normaelettroforesi ytical metodo di sodio dodecil solfato poliacrilammide (SDS-PAGE) descritta da Laemmli, Regno Unito ^52.
   1. Eseguire SDS-PAGE prima di utilizzare SLP1 entro esperimenti e ad esempio, dopo Au (0) -NP incubazione utilizzando 10% gel di separazione poliacrilammide.
   2. Per SDS-campioni mix ≈10 ml di campione coltivazione o di proteine ​​con il tampone (1.97 g TRIS, 5 mg di bromofenolo blu, 5,8 ml di glicerina, 1 g di SDS, 2,5 ml di β-mercaptoetanolo, si riempiono di acqua ultrapura a 50 ml) in un rapporto di 1: 1 (v / v) e pipetta la miscela dopo 4 min di incubazione a 95 ° C nelle tasche gel.
   3. Run SDS-PAGE 30 min ad una tensione di 60 V finché i campioni passano la raccolta gel e variazione di tensione di 120 V, una volta superato il gel di separazione.
   4. Rimuovere il gel dal sistema di gel, sciacquare con acqua ultrapura e luogo per 1 ora in una soluzione di fissaggio (acido acido 10%, il 50% di etanolo assoluto). In seguito, lavare il gel con acqua ultrapura.
   5. Gel Stainutilizzando un colloidale non specifica adapted Coomassie brillante metodo blu ^53,54. Dopo la decolorazione ^72,73, scattare immagini SDS-PAGE da parte del sistema di documentazione gel secondo il protocollo del produttore.

4. Gli esperimenti di adsorbimento in batch mode e quantificazione metallo

1. Per lotto esperimenti di assorbimento preparano Au (III) soluzione madre da _HAuCl4 ∙ 3 H _{2 O,} diluire il sale metallico e mescolare con la soluzione SLP1 / NaCl ad una concentrazione di metallo iniziale di 1 mm e concentrazione finale SLP1 di 1 g / l . Effettuare esperimenti in terzine con un controllo negativo supplementare senza SLP1. Utilizzare un volume totale di 5 ml per esperimenti di assorbimento.
2. Agitare la sospensione continuamente a RT a diversi valori di pH preregolate tra 2,0-5,0 per 24 ore (regolare il pH con una soluzione di HCl e NaOH bassa concentrazione).
3. Dopo assorbimento, centrifugare i campioni a 15.000 xg, 4 ° C per 20 min) a Separmangiato SLP1 da surnatante.
4. Trasferire il surnatante in provette di ultrafiltrazione (MWCO 50.000 Da) e centrifugare a 15.000 xg questo, 4 ° C per 20 minuti per rimuovere i monomeri disciolti proteine.
5. Determinare la concentrazione di metalli nel filtrato risultante da ICP-MS ^19,20 e utilizzare i risultati per il back-calcolo sorbito metallo dalla massa secca SLP1. Misurare i principi, le opportunità del metodo e dei componenti dei macchinari usati per ICP-MS sono stati descritti in letteratura ^55.
   1. Preparare i campioni e riferimenti per le misure ICP-MS con 1% HNO ₃ come matrice e rodio come standard interno (1 mg / ml).

5. Sintesi di Au-NP e Determinazione della dimensione delle particelle

Nota: citrato stabilizzato Au (0) -NP sono stati sintetizzati secondo un metodo descritto in precedenza adattato da Mühlpfordt, H. et al. (1982) per ottenere particelle sferiche con un diametro di 10 - 15 nm ^56,57

1. Preparare una stabilizzato 25 HAuCl _mm 4 ∙ 3 H ₂ O stock per la formazione NP.
2. Diluire 250 ml di questa soluzione in 19,75 ml di acqua ultrapura e incubare questi a 61 ° C per 15 minuti sotto i successivi agitazione.
3. Preparare 5 ml di una seconda soluzione madre (12 mm di acido tannico, di 7 mm di citrato di sodio-idrato, 0.05 K mM _{2 3} CO) e incubare la soluzione ² ° separatamente a 61 ° C per 15 minuti.
4. Aggiungere sotto costante agitazione la soluzione di riserva ² al soluzione one. Mescolare la miscela di reazione per almeno 10 min a 61 ° C. Successivamente raffreddare la soluzione ed utilizzarla per il rivestimento NP su SLP1 reticolo all'interno QCM-D esperimenti.
   Nota: Il Au risultante (0) -NP stati caratterizzati mediante spettroscopia UV-VIS al massimo assorbimento di 520 nm, tipicamente utilizzati per la rilevazione di formato Au (0) -NPs ^58. La soluzione può essere conservato a 4 ° C.
5. Analizzare le dimensioni del formatoAu (0) -NP mediante spettroscopia di correlazione fotonica (PCS) che è anche conosciuto come dispersione dinamica della luce.
   1. Per la determinazione delle dimensioni NP, trasferire 1,5 ml di Au sintetizzato (0) -NP soluzione nella cuvette in condizioni privo di polvere in una scatola flusso laminare e analizzare con una dimensione e potenziale zeta sizer particella. Una descrizione dettagliata di PCS e preparazione del campione è dato in Schurtenberger, P. et al. (1993) ⁵⁹ e Jain, R. et al. (2015) ^60.

6. QCM-D Esperimenti - SLP1 rivestimento sulle superfici e Au-NP adsorbimento su SLP1 Lattice

Nota: Le misurazioni sono state effettuate con una QCM-D dotato di un massimo di quattro moduli di flusso. Tutti gli esperimenti QCM-D sono stati eseguiti con una portata costante di 125 microlitri / min a 25 ° C. Rivestimento SLP1 e metallo / NP incubazione sono stati fatti su SiO ₂ sensori piezoelettrici di quarzo AT-cut (Ø 14 mm) con una frequenza fondamentale di ≈ 5 MHz. Risciacquo passi e aggiungereition di soluzione sono contrassegnati nelle figure dei risultati parte rappresentativa. Gli esperimenti QCM-D potrebbe essere descritto come un passo per passo modo che inizia con la pulizia e la modificazione superficiale dei sensori utilizzati seguita da ricristallizzazione SLP1 e successivamente sull'interazione NP metallo e metallo.

1. Procedure di pulizia:
   1. Dotare le cellule del liquido con manichini del sensore. Pompa almeno 20 ml (ciascuno per modulo) di un agente detergente liquido alcalino (2% detergente in acqua ultrapura (v / v)) attraverso il sistema QCM-D e tubo. Successivamente pompare il volume di cinque volte (ciascuna per modulo) di acqua ultrapura attraverso il sistema (portata fino a 300 ml / min). Eseguire la pulizia secondo il protocollo del produttore.
   2. Pulire i SiO _{2 sensori} di fuori dei moduli di flusso mediante incubazione (almeno 20 min) a 2% soluzione di SDS e sciacquare i sensori in seguito più volte con acqua ultrapura ^61,62.
   3. Asciugare i cristalli con comp filtrataressed aria e metterli in una camera di pulizia di ozono per 20 min ^63,64.
   4. Ripetere la procedura di pulizia due volte per rimuovere tutti i contenuti organici.
   5. Per rimuovere i metalli legati dalla superficie del sensore sciacquare i sensori con 1 M HNO _3. Successivamente, eseguire tutte le operazioni di risciacquo con acqua ultrapura.
2. Sensore modifica della superficie per polielettroliti:
   Nota: modifica di superficie può essere effettuato sia all'interno (fluire attraverso procedura) o all'esterno del modulo di flusso (tecnica LBL). All'interno di questi esperimenti è stata utilizzata la seguente modo per modificare le superfici.
   1. Modificare i sensori con 3 g / L di strati alternati di PE di polietilenimminico (PEI, MW 25.000) e polistirene sulfonato (PSS, MW 70.000) tramite dip coating utilizzando LBL tecnica ^40,41 descritto in precedenza per il sistema utilizzato speciale nell'articolo di Suhr, M. et al. (2014) ^19.
   2. Posizionare i sensori all'interno del PE-soluzione appropriata in profonda well piastre e incubare questi per 10 minuti a RT.
   3. Prendete i sensori di PE-soluzione e sciacquare i sensori tra ogni tuffo rivestimento passo intensamente con acqua ultrapura.
      Nota: La nuova modifica superficie è costituita da almeno tre strati PE terminante con carica positiva PEI.
   4. Dopo questa modifica esterna posizionare i sensori all'interno del modulo di flusso ed equilibrare i sensori risciacquando con acqua ultrapura prima di iniziare gli esperimenti.
3. SLP1 monostrato Ricristallizzazione:
   1. Sciogliere SLP1 a 4 M di urea per convertire i polimeri in monomeri.
   2. Centrifugare le proteine ​​a 15.000 xg monomerized, 4 ° C per 1 ora per rimuovere agglomerati di proteine ​​più grandi.
   3. Mescolare il surnatante SLP1 solubilizzato e centrifugato con tampone ricristallizzazione ad una concentrazione proteica finale di 0,2 g / L.
      Nota: Il calcio seconda ricristallizzazione SLP1 (auto-assemblaggio) inizia con l'aggiunta del recBuffer rystallization. Pertanto, la soluzione mista pompa con una portata di 125 ml / min per i sensori (posto all'interno moduli di flusso) immediatamente. La ricristallizzazione avviene dopo che i valori stabili di frequenza e di dissipazione turni sono stati individuati all'interno QCM-D esperimenti.
   4. Dopo successo ricristallizzazione proteina sulla cima dei sensori PE-modificato all'interno dei moduli di flusso sciacquare i sensori rivestiti con tampone ricristallizzazione o ultrapura waterintensively con una portata di 125 ml / minuto fino a valori stabili di spostamenti di frequenza e di dissipazione sono stati rilevati.
      Nota: La modifica SiO ₂ superficie con PE per esperimenti di assorbimento successive Onto SLP1 monostrato e AFM studi viene visualizzato nella figura 1.

Figura 1. Schema di disegno di PE modifica della superficie e SLP1 monostratoPaint; Questa cifra è stata modificata da Suhr, M. et al. (2015) ¹⁹ con il permesso di Springer. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

4. Metallo e metallo NP Interazione:
   Nota: L'assorbimento con soluzione di sale di metallo Au _(HAuCl4 ∙ 3 H _{2 O)} è stata effettuata in concentrazione 1 mM o 5 mM a pH = 6.0 in soluzioni di NaCl 0,9%. Au-NP assorbimento è stato fatto con puro Au-NP in 1,6 mm di buffer tri-sodio-citrato a pH ≈ 5.0.
   1. Dopo il rivestimento SLP1 successo nei moduli di flusso, sciacquare lo strato SLP1 ottenuto intensamente con 0,9% NaCl finché sono stati rilevati valori stabili di spostamenti di frequenza e di dissipazione.
   2. Pompa la soluzione preparata in metallo (1 mM) e la soluzione NP ai moduli di flusso con una portata di 125 ml / min e monitorare l'adsorbimento di massa alla Sllivello p1. Adsorbimento di massa può essere rilevato direttamente tracciando i turni di frequenza che si riferiscono alla equazione Sauerbrey (equazione 1).
   3. Dopo aver completato l'interazione metallo e NP metallo, lavare lo strato di metallo / NP buffer libero per rimuovere deboli metalli o nanoparticelle collegate rilegati o deboli.
      Nota: Un'illustrazione del setup sperimentale è mostrato in Figura 2.

Figura 2. Schema di disegno di Setup QCM-D utilizzando il modulo di flusso QFM 401 * ^66. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

5. Registrazione dei dati e valutazione:
   1. Registrare i cambiamenti di frequenza in Hz (Af _n) e la dissipazione (ΔD _n) Entro gli esperimenti QCM-D utilizzando QCM-D software specifico.
   2. Utilizzare per la valutazione della sensibilità di massa adsorbita (Δm) l'equazione / modello di Sauerbrey (Equazione 1) ^{65 66} valido per film sottili e rigidi accoppiati senza attrito sulla superficie del sensore applicato al n ^° armonico. Il termine C (costante Sauerbrey) per l'usato 5 MHz a sensore di quarzo taglio è del 17,7 ng ∙ Hz ^-1 ∙ cm ^{-2 68.} Per rigida, distribuiti in modo uniforme, e gli strati adsorbiti sufficientemente sottili utilizzano Equazione 1 come una buona approssimazione.
      
   3. Eseguire ulteriore modellazione secondo il modello di Kelvin-Voigt valido per molecole viscoelastici ^68-71 con il software specifico produttore e confrontare i risultati con quella del modello Sauerbrey.
   4. Per il calcolo dello spessore dello strato e l'uso di adsorbimento di massaimportante parametro modellazione una densità strato dello strato adsorbito di 1,35 g ∙ cm ^-3 corrispondente ai valori descritti in precedenza per le proteine ​​S-strato ^72-75. Utilizzare lo stesso valore per il calcolo di interazione metallo con lo strato proteinico.

7. Misure AFM

1. Effettuare studi con pienamente in grado AFM su un microscopio ottico invertito.
   1. Registra immagini AFM in liquido usando il tampone ricristallizzazione o acqua ultrapura direttamente sui sensori QCM-D rivestiti.
   2. Sciacquare i sensori con acqua ultrapura dopo gli esperimenti QCM-D e metterli all'interno della cellula fluido AFM. Pertanto, utilizzare una cella chiusa di fluido con un volume totale di circa 1,5 ml. Mantenere la temperatura del fluido costante di cella a 30 ° C.
   3. Utilizzare un cantilever con una frequenza di risonanza di ≈ 25 kHz in acqua e una rigidità di <0,1 N / m. Regolare la velocità di scansione tra 2,5 e 10 micron / sec.
   4. 76.
      Nota: Le immagini vengono visualizzate con altezza z scala mentre valori z rappresentano la topografia esatta della superficie. Amplitude immagini (pseudo 3D) sono indicati senza z scala perché z valori di ampiezza dipendono i parametri di scansione e portano informazioni limitate. L'analisi delle immagini è stata effettuata utilizzando tre software di valutazione diverso di ^77.

Risultati

Coltivazione di microrganismi e SLP1 Caratterizzazione

I dati registrati di crescita batterica indica la fine della fase di crescita esponenziale a circa 5 ore. Studi precedenti hanno dimostrato che SLP1 può essere isolato da questo punto di raccolta (4,36 g / L biomassa umida (≈ 1,45 g / L (BDW)) con una resa massima ^19. Tuttavia, l'ottimizzazione della coltivazione utilizzando componenti o support...

Discussione

In questo lavoro ha studiato il legame di Au alle proteine ​​S-layer è stata studiata utilizzando una combinazione di diversi metodi di analisi. In particolare, il legame di Au è molto interessante non solo per il recupero di Au da acque minerarie o soluzioni di processo, ma anche per la costruzione di materiali, ad esempio, superfici sensoriali. Per gli studi di interazione Au (Au (III) e Au (0) -NPs) con sospensione e ricristallizzata monostrato di SLP1, la proteina doveva essere isolato. Pertanto, q...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
equiment e software
Bioreattore, sistema pilota a vapore in loco 70L	Applikon Biotechnology, Paesi Bassi	Z6X	inclusi dO2, sensori di pH di Applikon Biotechnology e software BioXpert V2
Monitor di biomassa non invasiva BugEye 2100	BugLab, Concord (CA), USA	Z9X	---
Spectrometer Ultrospec 1000	Amersham Pharmacia Biotech, Gran Bretagna	80-2109-10	Azienda ora GE Healthcare Life Sciences
Microcentrifuga	MiniStar VWR, Germania	521-2844	Per la centrifugazione di campioni di coltivazione
Microscopio per sistemi di ricerca BX-61	Olympus Germany LLC, Germania	037006	Microscopio in combinazione con il software di imaging
Cell^P (versione 3.1)	Olympus Soft Imaging Solutions LLC, Mü nster, Germania---		insieme al microscopio
Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-S	Carr Centritech, Florida, USA	9010PLT	Per la raccolta di biomassa
T18 basic Ultra Turrax	IKA Labortechnik, Germania	431-2601	Per la rimozione dei flagelli e l'omogeneizzazione dei campioni
Sorvall Evolution RC Superspeed Centrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA	728411	Utilizzato nell'isolamento delle proteine Processore
mobile di fluidi ad alto taglio, M-110EH-30 Pilot	Microfluidics, Massachusetts, USA	M110EH30K	Utilizzato per la rottura cellulare
Alpha 1-4 LSC Liofilizzatore	Martin Christ Liofilizzatori LLC, Osterode, Germania
Spettrofotometria 102041---UV-VIS (NanoDrop 2000c)	Thermo Fisher Scientific, USA	91-ND-2000C-L	Per la determinazione delle proteine camera
elettroforesi verticale Mini-PROTEAN	Bio-Rad Laboratories GmbH, Monaco di Baviera, Germania	165-3322	Per SDS-PAGE
VersaDoc Imaging System 3000	Bio-Rad Laboratories GmbH, Monaco di Baviera, Germania	1708030	Utilizzato per l'imaging di gel SDS-PAGE
ICP-MS Elan 9000	PerkinElmer, Waltham (MA), USA	N8120536	Per la determinazione della concentrazione
di metalliZetasizer Nano ZS	Malvern Instruments, Worcestershire, Regno Unito	ZEN3600	Per la determinazione della dimensione delle nanoparticelle
del dispositivo Q-Sense E4	Q-Sense AB, Göteborg, Svezia	QS-E4	ordinato tramite LOT quantum design (software incluso con la piattaforma E4)
Q-Soft 401 (registrazione dati)	Q-Sense AB, Göteborg, Svezia
Q-Tools 3 (valutazione e modellazione dei dati)	Q-Sense AB, Göteborg, Svezia
QCM-D moduli di flusso QFM  401	Q-Sense AB, Göteborg, Svezia	QS-QFM401	ordinato tramite LOT quantum design
QSX  303 SiO2 sensori piezoelettrici al quarzo AT-cut	Q-Sense AB, Göteborg, Svezia	QS-QSX303	ordinato tramite LOT quantum design
Camera di pulizia dell'ozono	Bioforce Nanoscience, Ames (IA), USA	QS-ESA006	ordinata tramite LOT quantum
design Microscopio a forza atomica MFP-3D Bio AFM	Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA	MFP-3DBio AFM	misure e software di imaging
Software AFM per la ricerca sull'asilo AR Versione 120804+1223	Ricerca sull'asilo, Santa Barbara (CA), USA		software di imaging incluso nella Cat. No. MFP-3DBio
Igor Versione Pro 6.3.2.3 Software	WaveMetrics, Inc., USA		software di imaging incluso in Cat. No. MFP-3DBio
BioHeater	Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA	Bioheater	Riscaldatore campione per misurazioni AFM
Biolever mini cantilever,  BL-AC40TS-C2	Olympus Germania LLC, Germania	BL-AC40TS-C2	Cantilever preferito per le misurazioni AFM
WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013)	Nanotec Electronica S.L., Spagna	freeware	per l'analisi AFM
Name	Company	Numero di catalogo	Comments
Detergenti e altri equipaggiamenti
acido acido, 100 %, p.a.	CARL ROTH GmbH+CO. KG	3738.5	Pericolo, liquidi e vapori infiammabili e corrosivi. Provoca gravi ustioni cutanee e danni agli occhi.
Antischiuma 204	Sigma-Aldrich Co. LLC.	A6426	Per la soppressione della schiuma
bromofenolo blu, sale sodico	Sigma-Aldrich Co. LLC.	B5525	---
Coomassie Blu brillante R (C45H44N3NaO7S2)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	3862.1	---
Desossiribonucleasi II dalla milza suina	Sigma-Aldrich Co. LLC.	D4138	Tipo IV , 2.000 - 6.000  Kunitz unità/mg proteina
Etanolo, 95%	VWR, Germania	20827.467	infiammabile
, p.A.	CARL ROTH GmbH+CO. KG	3783.1	---
Cloridrato di guanidina (GuHCl)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	0037.1	---
Hellmanex III	Hellma GmbH & Co. KG	9-307-011-4-507	---
Acido cloridrico (HCl) (37%)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	4625.2	Pericolo; Corrosivo, utilizzato per la regolazione del pH
Lisozima dall'albume d'uovo di gallina	Sigma-Aldrich Co. LLC.	L6876	Polvere liofilizzata, proteine = 90 %, = 40.000 unità/mg di proteine (Sigma)
Agitatore magnetico con riscaldamento,  MR 3000K	Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Germania	504.10100.00	Agitatore standard nell'ambito dell'esperimento
NB-Media DM180	Mast Diagnostica GmbH	121800	---
Acido nitrico (HNO3)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	HN50.1	Pericolo; Ossidante, corrosivo
PageRuler Scala proteica non colorata	ThermoScientific-Pierce	26614	---
Poly(sodium 4-styrenesulfonat) (PSS)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	243051	Mw medio ~70.000
Polietilenimmina (PEI), ramificata	Sigma-Aldrich Co. LLC.	408727	Avvertimento; Nocivo, irritante, pericoloso per l'ambiente; Mw medio ~25.000
Carbonato di potassio anidro (K2CO3)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	60108	Avvertimento; Ribonucleasi A dannosa
dal pancreas bovino	Sigma-Aldrich Co. LLC.	R5503	Tipo I-AS, 50 - 100 unità Kunitz/mg di proteina
Sodio azide (NaN3)	Merck KGaA	106688	Pericolo; molto tossico e pericoloso per l'ambiente
Cloruro di sodio (NaCl)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	3957.2	---
Sodio dodecil solfato (SDS)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	L-5750	Pericolo; tossico
Idrossido di sodio (NaOH)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	6771.1	Pericolo; Corrosivo, utilizzato per la regolazione del pH all'interno della coltivazione e la regolazione del pH
Spectra/Por 6, membrana per dialisi, MWCO 50.000	CARL ROTH GmbH+CO. KG	1893.1	---
Acido solforico (H2SO4)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	HN52.2	Pericolo; Corrosivo, utilizzato per la regolazione del pH all'interno della coltivazione
Acido tannico (C76H52O46)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	16201	---
TRIS HCl (C4H11NO3HCl)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	9090.2	---
Triton X-100	CARL ROTH GmbH+CO. KG	3051.3	Avvertenza; Nocivo, Pericoloso per l'ambiente
VIVASPIN 500, 50.000 MWCO Tubi per ultrafiltrazione	Sartorius AG	VS0132	---
β-mercaptoetanolo	Sigma-Aldrich Co. LLC.	M6250	Pericolo, tossico