Quantitative Fundus autofluorescenza per la valutazione delle patologie retiniche

Sommario

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) supporta la retina sensoriale attraverso il riciclaggio dei sottoprodotti del ciclo visivo, che si accumulano sotto forma di lipofuscina. Questi prodotti sono autofluorescenti e possono essere visualizzati qualitativamente in vivo. Qui, descriviamo un metodo per visualizzare quantitativamente la lipofuscina RPE utilizzando l'oftalmoscopia laser a scansione confocale.

Abstract

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è giustapposto alla retina sensoriale sovrastante e supporta la funzione del sistema visivo. Tra i compiti svolti dall'RPE vi sono la fagocitosi e l'elaborazione dei segmenti fotorecettori esterni attraverso organelli derivati dai lisosomi. Questi prodotti di degradazione, conservati e indicati come granuli di lipofuscina, sono composti parzialmente da bisretinoidi, che hanno ampi spettri di assorbimento ed emissione della fluorescenza che possono essere rilevati clinicamente come autofluorescenza del fondo oculare con oftalmoscopia laser a scansione confocale (cSLO). L'accumulo di lipofuscina è associato all'avanzare dell'età, ma si trova anche in vari modelli nelle malattie degenerative della retina sia acquisite che ereditarie. Pertanto, studiare il suo modello di accumulo e correlare tali modelli con i cambiamenti nella retina sensoriale sovrastante è essenziale per comprendere la fisiopatologia e la progressione della malattia retinica. Qui, descriviamo una tecnica impiegata dal nostro laboratorio e da altri che utilizza il cSLO per quantificare il livello di RPE lipofuscina sia negli occhi sani che in quelli malati.

Introduzione

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) supporta la funzione della retina sensoriale attraverso numerosi processi ^1. Età degenerazione maculare (AMD) è la causa più importante di cecità incurabile nei paesi industrializzati ed è caratterizzata da cambiamenti nella RPE, tra cui la perdita di pigmento, perdita della funzione e atrofia. In AMD ed in normale invecchiamento, l'RPE accumula fluorescenti, organelli lisosomi-derivati ​​contenenti frammenti di fotorecettori fagocitati, di cui come granuli di lipofuscina. L'accumulo di RPE lipofuscina è stato pensato per indicare ossidativo disfunzioni ^1, ma recenti studi hanno dimostrato che la morfologia RPE rimane normale negli occhi età con elevati livelli di lipofuscina ^2. Marcatori Tuttavia, i modelli anormali di distribuzione lipofuscina, in particolare la perdita di lipofuscina, sono documentate per la progressione di AMD e AMD, sia istologicamente e clinicamente ^3,4

proces difettosicantare di RPE lipofuscina è stato dimostrato anche che si verifichi in certe degenerazioni retiniche ereditarie. I pazienti affetti da malattia di Stargardt (STGD) si accumulano lipofuscina nel RPE in giovane età, alla fine lo sviluppo di perdita della vista simile a quello visto in AMD ^5. Questi risultati hanno suggerito che l'accumulo di lipofuscina stessa può essere tossico e guidare RPE disfunzioni ^6,7. Tuttavia, uno studio di imaging dettagliata di soggetti con STGD nel corso del tempo non ha confermato che l'accumulo di lipofuscina focale ha portato alla conseguente perdita RPE ^8. Quindi, anche se le anomalie lipofuscina sono marcatori per degenerazioni retiniche, un ruolo per tossicità diretta di lipofuscina ancora da dimostrare.

La RPE è la più strato di cellule posteriore della retina, ma genera la maggior parte del segnale fluorescente dal fondo oculare. Generazione e rilevamento di autofluorescenza (AF) derivato dal RPE possono essere eseguite utilizzando ophthalmoscopy scansione laser confocale (cSLO), che consente visualization della distribuzione spaziale di AF fondo. Alcune degenerazioni retiniche mostrano modelli distintivi del fondo oculare AF, e aiuti di imaging AF nella diagnosi e nel monitoraggio di queste condizioni. Sebbene l'imaging standard di AF è clinicamente importante, AF quantitativa (Qaf) è diventato un importante mezzo per valutare la salute RPE. Noi e altri hanno sviluppato un approccio standardizzato che può determinare in modo affidabile i livelli di Qaf a specifiche posizioni della retina ^9. Qaf ha potenziali applicazioni nella diagnosi e nel monitoraggio delle condizioni della retina, e può anche avere utilità nella prognosi e stratificazione del rischio. Inoltre, la capacità diagnostica di Qaf sono anche stati descritti per certi disturbi della retina ^10-12. Qui, forniamo dettagli graduale per eseguire la nostra tecnica accompagnata da una dimostrazione visiva della sua applicazione nella valutazione di occhi sani e malati.

Protocollo

Etica Dichiarazione: Tutti i pazienti arruolati in questi studi sono stati fatti così in conformità approvato revisione istituzionale di Vigilanza presso la New York University School of Medicine.

1. selezione dei pazienti e preparazione iniziale per l'imaging

Nota: Sono necessari i seguenti materiali: 0.5% soluzione oftalmica tropicamide, 2,5% soluzione oftalmica fenilefrina, cSLO dotato di dominio spettrale tomografia a coerenza ottica (SD-OCT), e il riferimento di fluorescenza interna.

1. Prima di immagini, opportunamente istituito cSLO per l'acquisizione dei dati in base alle istruzioni del produttore.
2. Montare un riferimento fluorescente interna nel cSLO. Nota: Il riferimento fluorescente interna, come acquistati dal produttore, è ospitato in un anello di metallo e viene posizionato direttamente dietro l'obiettivo della fotocamera. Se viene utilizzato un cSLO da un altro produttore, ci può essere una configurazione diversa da quella che è descritta inquesto protocollo.
   1. Per inserire il riferimento nella cSLO, ruotare la lente per rimuoverla, svitare ghiera della macchina, e sostituirlo con il nuovo anello metallico contenente il riferimento.
      Nota: il riferimento fluorescente interno è essenziale alla tecnica QaF, in quanto consente la correzione per variazione di potenza del laser e rivelatore di sensibilità / guadagno.
3. Hanno pazienti reclutati per l'imaging sottoposti ad un esame di routine occhio dilatato e ottenere informazioni di base sulla storia passata e oculare condizioni mediche di base che possono manifestarsi con i risultati oculari.
4. Dilatare gli alunni con lo 0,5% e il 2,5% tropicamide fenilefrina. PUNTO CRITICO: Dilata alunni di almeno 6 mm. Nota: Ciò è essenziale per passaggio continuo di luce, e quindi per la visualizzazione ottimale e la misurazione del fondo.
5. Prima di immagini, posizionare il paziente correttamente sul cSLO, con il mento appoggiato sul mentoniera, la fronte posta contro la forehead riposo, e angoli palpebrali laterali correttamente allineati con gli indicatori.

2. Baseline Imaging del fondo oculare

1. In primo luogo, l'immagine del fondo oculare con riflessione della luce infrarossa (IR), vicino (lunghezza d'onda di 820 nm) al fine di centralizzare la fotocamera sopra la macula e ottenere messa a fuoco approssimativa.
   1. Con il paziente posizionato correttamente, attivare l'impostazione hardware sul pannello di controllo per la modalità di imaging IR, macchina fotografica posizionare manualmente fino a quando il fondo è in pieno centro, e prendere una immagine
   2. Regolare l'impostazione sul pannello di controllo per "IR-OCT", che utilizza spettrale dominio tomografia a coerenza ottica (SD-OCT), in combinato disposto con l'imaging a infrarossi per valutare la macula per malattia di base.
   3. Utilizzare le guide presenti nella finestra di imaging per orientare correttamente l'Office per l'immagine IR del fondo. Per ottenere ottimale SD-OCT qualità, posizionare la telecamera in modo tale che l'immagine PTOM nel terzo superiore della finestra di imaging. Acquisire almeno una sc linea orizzontaleuna attraverso la fovea e attraversa l'intero campo di ripresa.

3. Impostazione di Qaf Imaging

1. Utilizzare acquisizione di immagini "ad alta velocità". Nota: Questa impostazione consente per l'acquisizione delle immagini più veloce, che riduce il rischio di perdita del segnale a causa del movimento del paziente e conseguente blocco della luce da parte dell'iride o le palpebre.
2. Utilizzare "Mean di 9" frames. Nota: Questa impostazione consente la rapida, cattura sequenziale di 9 fotogrammi di immagini, che possono essere successivamente "media" per ridurre il rumore e artefatti (vedi sotto).
3. Utilizzare campo "30 x 30 gradi". Nota: Questo si riferisce ai gradi di zona della retina catturati durante l'acquisizione dell'immagine.
4. Prima di imaging, avvertire paziente circa la luce blu, in quanto questo può essere allarmante in un primo momento.
5. Attivare la modalità AF e allineare l'asse della telecamera in modo che lo schermo è al massimo "riempito" con fundus AF (oscuramento minima dei lati e gli angoli dell'immagine).
   1. Se i pazienti have difficoltà a tollerare la luce blu brillante, avviare l'imaging con la telecamera più lontano dall'occhio e quindi portare la fotocamera lentamente verso il paziente fino a quando il fondo è in vista.
      PUNTO CRITICO: Se la luce di entrare in o uscire dall'occhio è ostruito, è diminuito il segnale risulterà. diminuzione localizzata è visibile come oscuramento asimmetrica di un lato un'immagine o un angolo. perdita generalizzata di segnale è visto quando i movimenti degli occhi solo ostruiscono il passaggio della luce.
6. Allineate la telecamera in modo tale che il segnale AF è al livello più alto in tutto il campo. Obiettivo per il segnale massima anziché immagine più nitida, tuttavia essi più o meno correlati. Regolare la messa a fuoco spostando il cSLO per riposizionare la fotocamera manualmente o con il joystick oftalmoscopio.
7. Regolare la sensibilità / guadagno tale da fondo AF è facilmente visibile, ma evitare un eccesso di saturazione. Durante l'acquisizione delle immagini, pixel colorati visibili sia il riferimento interno (situato nella parte superiore dellaimmagine) o fundus indicano sovrasaturazione e quindi perdita di segnale.

4. Acquisizione di immagini

Nota: PUNTO CRITICO: L'obiettivo in acquisizione delle immagini deve essere quello di ottenere 2 qualità 9-cornice dell'immagine pile alte per sessione per controllare la variabilità tra le immagini all'interno di una sessione. Dopo il riposizionamento del paziente e la macchina fotografica, di ottenere una seconda sessione di due immagini per valutare e controllo per la variabilità. Tutte le immagini saranno in ultima analisi, essere calibrati per il riferimento interno (descritto di seguito).

1. Acquisire immagini solo dopo almeno 20 secondi di "sbianca" (piena esposizione della retina alla luce AF) per ridurre al minimo l'assorbimento della luce da parte rodopsina nella retina sensitiva ^9.
   1. Utilizzare questo periodo per ottimizzare l'allineamento della fotocamera, messa a fuoco e sensibilità.
2. Avere i soggetti lampeggiare prima di ogni acquisizione di immagini come un film lacrimale fresca migliora la qualità del segnale.
3. Evitare le palpebre nel piano di acquisizione.
   Nota: Può essere utile manualmente le palpebre aperte per i pazienti più impegnativi. Gli autori raccomandano che un assistente svolge questo compito.
4. Ottimizzare l'allineamento prima di ogni acquisizione delle immagini per assicurare che la luce non sia ostruita da l'iride con conseguente diminuzione del segnale.
   Nota: Come almeno minore movimento è molto comune, gli autori raccomandano bene riallineamento, se necessario, prima di ogni acquisizione delle immagini. Guidare e incoraggiare il paziente, mentre l'imaging aiuta il movimento diminuzione. Gli autori raccomandano anche tramite pedale della macchina come il "tasto di acquisizione" in modo da ridurre al minimo dell'operatore distrazione.
5. Eseguire l'elaborazione post-immagine calcolando il "medio" della pila 9-frame per aumentare il rapporto segnale-rumore. Calcolare la media di una pila usando il software cSLO selezionando l'opzione per calcolare la media.
   Nota: Ci possono essere pile in cui alcuni fotogrammi non sono di qualità ottimale (cioè, hanno localizzata o generalizzata diminuzione SIsegnal rispetto ai telai ottimali), quindi ispezionare accuratamente ogni pila e deselezionare telai subottimali prima calcolo della media.
   Nota: le immagini medie con rapporti accettabili segnale-rumore possono essere trattati da almeno 3 fotogrammi. E 'normale per i lati e gli angoli di ogni immagine di avere segnale inferiori ai 20 gradi centrali a causa di limitazioni all'interno del cSLO stesso.
   1. Se il software chiede se l'operatore vorrebbe normalizzare i livelli di grigio (vale a dire, allungare l'istogramma) tra 0 e 255, selezionare "No". Questo mantiene inalterati livelli di grigio per l'analisi.

Analisi 5. Immagine

1. Analizzare le immagini AF come descritto in precedenza utilizzando il software di analisi delle immagini sviluppato per la tecnica QAF (IGOR; ^9). Una breve descrizione di una tipica analisi delle immagini utilizzando questo software è riportato qui di seguito.
   1. Caricare il programma Qaf in IGOR e importare le immagini (in formato .bmp) esportati dallasoftware cSLO con proporzioni pixel 768 x 768 (parametro di uscita di default).
   2. Selezionare l'immagine nel menu a discesa e di avviare l'analisi.
   3. Riposizionare indicatori di calibrazione sull'immagine in modo tale che il "mirino" si sovrappongono fovea e della "staffa" confina con la disco ottico (questi indicatori sono utilizzati per scalare e posizionare i ROI). Una volta posizionato correttamente, il software utilizzare i prompt quindi popolare l'immagine con ROI circolari che circondano la fovea (vedi figure 1, 2).
   4. Selezionare l'opzione in IGOR per calibrare i livelli di grigio complessivi di ciascuna immagine a quei livelli presenti nel riferimento fluorescente interna. Nota: Questa fase consente di calibrare fattori correlati alla macchina, compreso il livello elettronico zero ogni immagine e il fattore di calibrazione di riferimento interno di ogni macchina, così come i fattori correlati al paziente, quali l'età, rifrazione e curvatura corneale.
      Nota: Il software di analisi mostra poi il r fissoegioni sull'immagine risultante e un valore di Qaf è dimostrata all'interno di ogni regione. I valori Qaf vengono anche inseriti automaticamente in un formato foglio di calcolo in una finestra separata. "
   5. Generate "mappe di calore" Qaf selezionando l'opzione entro i prompt dei comandi. Tutte le immagini e dati possono essere esportati dal software IGOR in un foglio di calcolo Excel selezionando le opzioni appropriate.

Risultati

Questa tecnica è stata utilizzata per studiare QaF in entrambi i sani e ¹³ di malattia stati ^10-12. In occhi sani (Figura 1), AF emessa dal RPE è distribuito in modo relativamente uniforme in tutto il fondo (Figura 1A). intensità ridotta è visto nella regione maculare centrale dovuto al blocco della luce da pigmento maculare, e ai lati ed angoli dell'immagine dovuto l'ottica dell'occhio e fotocamera. Vasi appaiono scure e dovrebbero...

Discussione

Anormale distribuzione lipofuscina RPE, sia aumentato o diminuito, è un marcatore sensibile della malattia retinica ed è generalmente associata a perdita di funzione retina sensitiva. Qui, descriviamo l'applicazione di Qaf per la valutazione dei RPE lipofuscina. Costituzione di un riferimento fluorescente interna per correggere per la variabile potenza del laser e rilevatore di sensibilità ⁹ a fianco della nostra tecnica di imaging standardizzata consente una quantificazione affidabile dei livelli di AF. ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Spectralis HRA + OCT	Heidelberg Engineering
		oftalmica tropicale allo 0,5%	Qualsiasi marca può essere utilizzata
Soluzione			Qualsiasi marca può essere utilizzata
Riferimento fluorescente interno	Heidelberg Engineering
Software IGOR Pro	WaveMetrics