CN-GELFrEE - Clear nativo Gel-eluito Frazione Liquid Entrapment elettroforesi

Rafael D. Melani; Henrique S. Seckler; Owen S. Skinner; Luis H. F. Do Vale; Adam D. Catherman; Pierre C. Havugimana; Marcelo Valle de Sousa; Gilberto B. Domont; Neil L. Kelleher; Philip D. Compton

doi:10.3791/53597

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Articolo metodologico

CN-GELFrEE - Clear nativo Gel-eluito Frazione Liquid Entrapment elettroforesi

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DOI:

10.3791/53597

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29 febbraio 2016

Rafael D. Melani^*¹^,² , Henrique S. Seckler^*¹ , Owen S. Skinner¹ , Luis H. F. Do Vale¹^,³ , Adam D. Catherman¹ , Pierre C. Havugimana¹ , Marcelo Valle de Sousa³ , Gilberto B. Domont² , Neil L. Kelleher¹ , Philip D. Compton¹

¹Departments of Chemistry and Molecular Biosciences, Chemistry of Life Processes Institute, Proteomics Center of Excellence, Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center, Northwestern University, ²Institute of Chemistry, Proteomics Unit, Federal University of Rio de Janeiro, ³Department of Cell Biology, Brazilian Center for Protein Research, Laboratory of Biochemistry and Protein Chemistry, University of Brasilia

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive come preparare ed eseguire l'elettroforesi di intrappolamento della frazione liquida eluita in gel nativo chiaro (CN-GELFrEE), una tecnica di separazione nativa per assemblaggi biomolecolari non covalenti e proteine da campioni eterogenei compatibile con varie tecniche di analisi delle proteine a valle.

Abstract

complessi proteici svolgono una serie di funzioni cellulari cruciali. Chiarire le loro interazioni non covalenti e la dinamica è fondamentale per la comprensione del ruolo di complessi nei sistemi biologici. Mentre la caratterizzazione diretta di complessi biomolecolari è diventato sempre più importante negli ultimi anni, le tecniche di frazionamento nativi che sono compatibili con le tecniche di analisi a valle, tra la spettrometria di massa, sono necessari per espandere ulteriormente questi studi. Tuttavia, il campo manca di un high-throughput, ad ampio spettro, metodo di separazione ad alta recupero per gli assembly proteina nativa. Qui, presentiamo chiaro nativo frazione liquida gel-elettroforesi eluita intrappolamento (CN-GELFrEE), che è una modalità di separazione nuovo per assiemi proteici non covalenti. prestazioni di separazione CN-GELFrEE è stata dimostrata da complessi di frazionamento estratte dal cuore del mouse. Le frazioni sono state raccolte più di 2 ore e visualizzati bande discrete che vanno da ~ 30 a 500 kDa. A conè stata osservata modello coerente di aumentare larghezze di banda di peso molecolare, ciascuno compreso ~ 100 kDa. Inoltre, la successiva rianalisi delle frazioni native tramite SDS-PAGE ha mostrato peso molecolare sposta coerente con la denaturazione di complessi proteici. Pertanto, CN-GELFrEE stato dimostrato di offrire la possibilità di eseguire ad alta risoluzione e ad alta recupero separazioni native su complessi proteici da un ampio intervallo di peso molecolare, fornendo frazioni compatibili con analisi di proteine a valle.

Introduzione

La maggior parte dei processi biologici che accadono all'interno di una cella si pensa siano svolte da gruppi di proteine piuttosto che singole proteine ^1. Di conseguenza, al fine di chiarire il ruolo biologico specifico di una subunità della proteina in una cellula è necessario comprenderne le interazioni strutturali con altre proteine o leganti in complessi ^2. Tuttavia, lo studio delle proteine in modo nativo, mantenendo le loro interazioni e le attività non covalenti, rimane difficile. Uno dei difetti di studi proteina nativa è una tecnica di separazione adeguato nativa che è compatibile con varie tecniche di analisi delle protein....