Usando Tomoauto: un protocollo per High-throughput automatizzato Cryo-elettrone Tomografia

Summary

Vi presentiamo un protocollo su come utilizzare high-throughput crio-elettroni tomografia per determinare alta risoluzione in strutture in situ di macchine molecolari. Il protocollo permette di grandi quantità di dati da elaborare, evita i colli di bottiglia comuni e riduce i tempi di inattività delle risorse, permettendo all'utente di concentrarsi su importanti questioni biologiche.

Abstract

La crio-tomografia elettronica (Cryo-ET) è una potente tecnica di imaging tridimensionale (3-D) per visualizzare complessi macromolecolari nel loro contesto nativo a livello molecolare. La tecnica prevede inizialmente la conservazione del campione nel suo stato nativo congelando rapidamente il campione nel ghiaccio vitreo, quindi la raccolta di una serie di micrografie da diverse angolazioni ad alto ingrandimento e infine la ricostruzione computazionale di una mappa di densità 3D. Il campione congelato-idrato è estremamente sensibile al fascio di elettroni e quindi le micrografie vengono raccolte a dosi di elettroni molto basse per limitare i danni da radiazioni. Di conseguenza, il crio-tomogramma grezzo ha un rapporto segnale/rumore molto basso caratterizzato da un'immagine intrinsecamente rumorosa. Per visualizzare meglio i soggetti di interesse, l'analisi di imaging convenzionale e la media dei sottotomogrammi in cui i sottotomogrammi del soggetto vengono estratti dal tomogramma iniziale e allineati e mediati vengono utilizzati per migliorare sia il contrasto che la risoluzione. Grandi set di dati di tilt-series sono essenziali per comprendere e risolvere i complessi in diversi stati, condizioni o mutazioni, oltre a ottenere una raccolta sufficientemente ampia di sotto-tomogrammi per la media e la classificazione. La raccolta e l'elaborazione di questi dati può essere un grosso ostacolo che impedisce ulteriori analisi. Qui descriviamo un protocollo crio-ET ad alta produttività basato su un microscopio crioelettronico da 300 kV controllato da computer, una telecamera per dispositivi di rilevamento diretto (DDD) e una libreria di wrapper software per pipeline di elaborazione delle immagini semi-automatizzata altamente efficace sviluppata internamente. Questo protocollo è stato efficacemente utilizzato per visualizzare il sistema di secrezione di tipo III intatto (T3SS) nelle minicellule di Shigella flexneri. Può essere applicabile a qualsiasi progetto adatto alla crio-ET.

Introduction

III sistemi di secrezione di tipo (T3SS) sono fattori di virulenza essenziali per molti patogeni Gram-negativi. Il injectisome, noto anche come il complesso dell'ago, è la macchina centrale T3SS richiesto per traslocazione diretta di proteine ​​effettrici del batterio in cellule ospiti eucariotiche ^{1, 2.} Il injectisome comprende un ago extracellulare, un corpo basale, e un complesso citoplasmatico anche noto come il complesso di smistamento ^3. Precedenti studi hanno chiarito le strutture 3-D di injectisomes purificati da Salmonella e Shigella, insieme con le strutture atomiche delle principali proteine ​​del corpo basale

Protocol

1. Minicell Preparazione

1. Per rendere S. minicells flexneri, trasformano 1 ml di plasmide pBS58, che esprime costitutivamente geni divisione cellulare Escherichia coli ftsQ, FTSA, e FtsZ da un basso copy spectinomicina resistente plasmide in 5 microlitri electrocompetent streptomicina resistente sierotipo 5a (M90T-Sm), le cellule di elettroporazione a 2,5 kV per 5 msec a 1 mm cuvette.
2. Conservare i campioni minicell a -80 ° C in 15% glicerolo in una provetta da 1,5 ml criogenico. Quando si è pronti per l'uso, raschiare circa 5 ml di cellule dalla provetta unthawed con un puntale e sospendere le cellu....

Results

Campioni di minicells S. flexneri stati raccolti e trattati come indicato in figura 1 utilizzando tomoauto schema seguente pipeline descritto nella figura 2. Tilt-series sono stati raccolti utilizzando SerialEM ^10, che permette di high-throughput acquisizione tilt serie nei punti designati da parte dell'utente su mappe montaggio a basso ingrandimento (Figura 3). Micrografie sono sta.......

Discussion

Il metodo di alto-rendimento descritto qui ci ha permesso di elaborare 1.917 crio tilt-serie e produrre oltre 4.500 sub-tomogrammi del intatto S. flexneri injectisome ^19. I dati raccolti hanno portato alla caratterizzazione dettagliata di in situ injectisome, tra cui il citoplasmatica di ordinamento complesso. Il metodo è stato utilizzato anche per visualizzare varie cellule mutanti con specifico delezione di componenti proteiche putativi, che ha contribuito a chiarire la composizio.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glicerolo	Sigma-Aldrich	G9012
Brodo di soia tirptico	Sigma-Aldrich	22092
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S0692
Apparecchio per elettroporazione	Bio-rad	165-2100
Cuvetta da 1 mm	BTX	45-0124
Tubo criogenico da 1,5 ml	Thermoscientific	5000-1020
Provetta per microcentrifuga da 1,5 ml	Sigma-Aldrich	Z336769
Holey Carbon Griglie	Quantifoil (Scienze della microscopia elettronica)	Q2100CR2	R2/2 200 Cu
Dispositivo di scarico a bagliore	Essiccatore sottovuoto disponibile alternativo commerciale	interno
	Sigma-Aldrich	Z119016	Utilizzato nel dispositivo di scarico a bagliore interno
Prodotti elettrotecnici	per generatori ad alta frequenza	BD-10A	utilizzati nel dispositivo di scarica a bagliore interno. ATTENZIONE: Questo dispositivo genera alte tensioni.
Pinze per centrifuga
	Dumont (Microscopia elettronica)	72705-D	Style 5 Anti-magnetico
Colliodal Gold	Aurion		BSA 10nm
Carta da filtro	Whatman		#2
Ethane	Matheson Tri-Gas	UN1035
Azoto	Matheson Tri-Gas	UN1977
Dispositivo a stantuffo	Alternativa commerciale	interna
Scatola di immagazzinaggio della griglia criogenica	Microscopia elettronica	Scienze 71166-30
Microscopio elettronico a trasmissione	FEI		Tecnai Polara F30 (300 KeV)
Dispositivo di rilevamento diretto Fotocamera	Gatan		K2 Summit
Tomogramma Software di acquisizione	SerialEM		http://bio3d.colorado.eud/SerialEM alternative: Tomografia UCSF, Leginon, Tomografia batch FEI
correzione del movimento indotto dal fascio	MOTIONCORR		http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html richiede >2 GB di
GPU	Nvidia Software di allineamento Tilt-SeriesAlternative http://bio3d.colorado.edu/IMOD IMOD		: XMIPP,
software di modellazione automatica di marcatori fiduciali Protomo	IMOD		: RAPTOR (incluso in IMOD0 (utilizzabile in tomoauto)
Software di determinazione CTF	IMOD		: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Utilizzabile in tomoauto)
Software di Ricostruzione Serie	Tilt tomo3d		https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternative: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo
Software di Elaborazione Automatizzata	Serie Tilt tomoauto		https://github.com/DustinMorado/tomoauto
Software di Prelievo di Particelle	i3		http://www.electrontomography.org Alternative: IMOD
Software di media dei sottovolumi	Alternative i3		: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch, PyTom http://pytom.org