Un Test PCR duplex digitale per simultanea quantificazione del Enterococcus spp. E l'umano fecale associata HF183 Marker in Waters

Summary

Questo manoscritto descrive un saggio PCR duplex digitale che può essere utilizzato per quantificare contemporaneamente Enterococcus spp. E marcatori genetici HF183 come indicatori di contaminazione fecale generale e umana associati nelle acque ricreative.

Abstract

Questo manoscritto descrive una PCR digitale duplex (EntHF183 dPCR) per la quantificazione simultanea di Enterococcus spp. E il marcatore HF183 fecale-associata umana. Il EntHF183 duplex dPCR (denominato come EntHF183 dPCR esso contenute) saggio utilizza gli stessi primer e sonda sequenze come le sue singole controparti pubblicati PCR quantitativa (qPCR). Allo stesso modo, le stesse procedure di filtrazione dell'acqua e di estrazione del DNA come eseguita prima di qPCR sono seguiti prima di eseguire dPCR. Tuttavia, il test dPCR duplex ha diversi vantaggi rispetto ai saggi qPCR. Più importante, il dosaggio dPCR elimina la necessità per l'esecuzione di una curva standard e, quindi, la distorsione e variabilità associata, dalla quantificazione diretta dei suoi obiettivi. Inoltre, mentre la stampa duplex (ovvero la quantificazione simultanea) Enterococcus e HF183 in qPCR spesso porta a grave sottovalutazione del target meno abbondanti in un campione, dPCR fornisce la quantificazione coerente di entrambi gli obiettivi, stuzzicarela quantificato singolarmente o contemporaneamente nella stessa reazione. Il dosaggio dPCR è anche in grado di tollerare concentrazioni di inibitori di PCR che sono uno o due ordini di grandezza superiori a quelle tollerate dal qPCR. Questi vantaggi rendono il saggio EntHF183 dPCR particolarmente interessante perché fornisce contemporaneamente informazioni precise e ripetibili sia contaminazione fecale generale e umana associati nelle acque ambientali senza la necessità di eseguire due saggi qPCR separati. Nonostante i suoi vantaggi rispetto qPCR, il limite superiore quantificazione del test dPCR con strumentazione attualmente disponibile è di circa quattro ordini di grandezza inferiore a quella ottenibile con qPCR. Di conseguenza, la diluizione è necessaria per la misura di concentrazioni elevate di organismi bersaglio come quelli tipicamente osservati dopo fuoriuscite di liquami.

Introduction

Metodi quantitativi PCR (qPCR) sono stati ampiamente utilizzati per il monitoraggio della qualità delle acque di ricreazione e microbiche applicazioni di tracciamento fonte perché sono più veloci, più flessibili e specifiche rispetto ai metodi di coltura a base di tradizionali. Di conseguenza, qPCR è consigliato per il raggiungimento di risultati di monitoraggio delle acque rapidi per gli indicatori fecali generali come Enterococcus spp. Nelle riviste USEPA ACQUATICI criteri di qualità ^1. Molti saggi qPCR sono stati sviluppati e validati per identificare le fonti di contaminazione fecale nelle acque ambientali ^2. Tra questi, i saggi mar....

Protocol

1. test di mescole

1. Fare le concentrazioni di 100 micromol / L stock per tutti i primer in acqua grado molecolare e sonde a TE pH 8 tampone [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ ^12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 ^3].
   Nota: Sonde per i due obiettivi sono fluorescente con diversi fluorofori ⁷ come indicato nella lista dei materiali / attrezzature.
2. Preparare master mix mescolando, per reazione prevista, 12 ml digitale mix PCR (2x magazzino, vedere elenco dei materiali / attrezzature), 0.216 ml ciascuno in avanti e di fondo, 0,06 ml ciascuna sonda fluorescente inversa, e 5.016 ml di acqua priva di nucleasi (concentrazione....

Results

Una buona corsa EntHF183 duplex dPCR dovrebbe risultare in numero relativamente elevato di goccioline accettati (circa 10,000-17,000) e differenza relativamente grande (circa 5.000) tra i valori di fluorescenza per le goccioline negativi e positivi ^7. Insolitamente basso numero di goccioline probabilmente indica problemi nel processo di generazione delle gocce, e un taglio di 10.000 goccioline è suggerito basato su dati empirici dal sistema dPCR gocciolina ut.......

Discussion

Ci sono alcuni passaggi critici nel protocollo. In primo luogo, la miscelazione delle miscele test può essere difficile, perché il master mix è più viscoso rispetto ai tradizionali Master Mix qPCR. Semplice vortex può portare a scarsa miscelazione, che a sua volta porta alla distribuzione non uniforme dei modelli di DNA nelle miscele di saggio e successivamente nelle goccioline. La tecnica di miscelazione-by-pipettaggio descritto nel protocollo deve essere seguita per garantire accurata quantificazione dPCR. In secondo .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microprovette a basso legame	Costar	3207	Per la conservazione di reagenti, campioni/produzione di miscele master
Acqua priva di nucleasi	FisherSci	BP2484-50
TE tampone pH 8	FisherSci	BP2473-100
Hardshell Piastra a 96 pozzetti	BioRad	HSP-9601	Per la miscelazione master iniziale e l'inoculazione del campione
Film sigillante	in alluminioBioRad	359-0133	Per sigillare la piastra del campione
Generatore di gocce	BioRad	186-3002
Olio per la generazione di goccioline	BioRad	186-3005
Cartuccia	BioRad	186-4008
DG8 Supporto per cartuccia	BioRad	186-3051
Guarnizione	BioRad	186-3009
20 μ l. puntali per pipette	Rainin	GP-L10F	Per il trasferimento di campioni/master mix a cartidge
200 μ l puntali per pipette	Rainin	GP-L200F	Per il trasferimento di goccioline alla piastra finale Twin.Tec
Piastra a 96 pozzetti	Eppendorf	951020320	Per il ciclo termico e la lettura delle goccioline finali
Lamina termosaldante perforabile	BioRad	181-4040	Per sigillare la piastra Twin.Tec prima del ciclo termico
PX1 Sigillante per piastre PCR BioRad		181-4000
CFX96 Thermalcycler	BioRad	CFX96 e C1000	È necessario solo il termociclatore, nessuna ottica Lettore di
gocce QX100	BioRad	186-3001
Olio per lettore di gocce	BioRad	186-3004
PCR a gocce Supermix	BioRad	186-3024	i.e. la miscela PCR digitale nel software manoscritto
QuantaSoft (v1.3.2)	Quantasoft	QX100	Per la visualizzazione, l'analisi e l'esportazione dei dati ddPCR
Entero Forward Primer (Ent F1A)	Operon	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	È possibile utilizzare un fornitore alternativo
Entero Reverse Primer (Ent R1)	Operon	CAGTGCTCTACCTCCATT	È possibile utilizzare un fornitore alternativo
Entero Probe (GPL813TQ)	Operon	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	È possibile utilizzare un fornitore alternativo, ma il floroforo deve essere FAM
HF183 Forward Primer ( HF183-1)	Operon	ATCATGAGTTCACATGTCCG	È possibile utilizzare un fornitore alternativo
HF183 Reverse Primer (BthetR1)	Operon	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	È possibile utilizzare un fornitore alternativo
HF183 Probe (BthetP1)	Operon	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	È possibile utilizzare un fornitore alternativo, ma il floroforo deve essere HEX (se si utilizza VIC, è necessario scegliere la compensazione matric appropriata.
Controllo			Miscela di DNA genomico E. faecalis e plasmide standard HF183 (ordinato da IDT). Per i metodi dettagliati nella coltura di E. faecalis e le sequenze del plasmide HF183 ordinato, si veda Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Gli standard del DNA Enterococcus disponibili in commercio (ATCC 29212Q-FZ) possono essere utilizzati anche nel controllo positivo al posto del DNA genomico E. faecalis preparato in laboratorio.