Qui vi presentiamo un protocollo per la caratterizzazione di oociti antrali di topo sulla base di organizzazione nucleolare.
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Articolo metodologico
Isolamento e caratterizzazione di mouse Antral ovociti Sulla base Nucleolare cromatina Organizzazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo protocollo descrive un metodo semplice e veloce per isolare e caratterizzare gli ovociti di topo antrale GV (Germinal Vesicle) come in grado (SN, Nucleolus Circondato) o incapace (NSN, Not Surrounded Nucleolus) di svilupparsi allo stadio di blastocisti dopo la maturazione in vitro (IVM) e la fecondazione in vitro (IVF). Si avvale di Hoeschst33342 (o di qualsiasi altro colorante intercalante del DNA) in grado di legarsi all'eterocromatina del nucleolo mostrando o meno un anello negli ovociti SN, come negli ovociti NSN. Questo rappresenta il modo più semplice e veloce per selezionare entrambi gli ovociti antrali che possono essere eventualmente utilizzati per le procedure IVM o IVF.
In sintesi, il protocollo consiste nelle seguenti fasi: iniezione di ormoni per stimolare la crescita follicolare; isolamento degli ovociti allo stadio GV dal compartimento antrale mediante puntura dell'ovaio con un ago sterile; preparazione di sottili pipette di vetro per il pipettaggio orale degli ovociti; selezione degli ovociti con Hoechst33342 preparato a concentrazione sopravitale; IVM, FIV o qualsiasi altra analisi molecolare/cellulare.
Purtroppo ci sono ancora poche prove per selezionare gli ovociti SN e NSN utilizzando tecniche meno invasive. Se e una volta identificati, potrebbero essere potenzialmente applicati alle tecnologie di riproduzione assistita umana, anche se con diversi aspetti che dovrebbero essere modificati. Ad oggi, questa tecnica ha potenziali implicazioni per aumentare notevolmente il successo delle procedure IVM e IVF sia nelle specie in via di estinzione che in quelle di interesse economico.
Introduzione
Antrale ovociti completamente sviluppati (GV, vescicola germinale) isolati dal vano antrale dell'ovario sono abitualmente utilizzati per scopi diversi, come, per esempio, lo studio dei meccanismi cellulari e molecolari alla base maturazione in vitro fino metafase II.
Nonostante le loro bella apparenza oociti antrali più, ma non tutti, sono in grado di completare la meiosi e raggiungere lo stadio di blastocisti; infatti, in molte specie di mammiferi, compreso l'uomo 1,2, circa il 30% del loro arresto loro sviluppo nella fase 2 cellule, se avviene la fecondazione 3-5. Ad oggi, alcuni parametri sono utilizzati p....
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Protocollo
Questo protocollo è condotto in conformità con i principi ispiratori del Europea (UE 63/2010) e Italiano (26/2014) leggi che proteggono gli animali utilizzati per la ricerca scientifica. Cervicale dislocazione l'eutanasia viene utilizzato per l'isolamento ovaie ed è eseguita da esperti e soggetti elencati nel protocollo approvato che copre questo studio addestrato.
1. Gli animali
- Mantenere adulti da 3 a 6 settimane di età topi femmina in una stanza a temperatura e umidità controllate (con fasi di 12L: 12D e alimentati ad libitum).
- Iniettare topi per via intraperitoneale con 2.5 UI di gonadotropina del siero di cavalla inc....
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Risultati
Le seguenti immagini mostrano il metodo utilizzato per isolare oociti antrali da ovaie di topo, a partire dalle pipette preparazione alla selezione degli ovociti 'per mezzo di Hoechst33342. Questo metodo è molto semplice e può essere eseguita in qualsiasi laboratorio dotato di CO 2 incubatore, uno stereomicroscopio e un microscopio a fluorescenza equipaggiato con il filtro corretto per l'osservazione del Hoechst33342 Figura 1 mostra la fase iniziale di.......
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Discussione
Questo protocollo descrive il metodo utilizzato per isolare e classificare il mouse antrali GV ovociti. Non vi sono particolari passaggi critici per sottolineare, con poche eccezioni. Primo: questa procedura deve essere eseguita il più rapidamente possibile: a) mantenere la vitalità degli ovociti e b) evitare variazioni di pH del mezzo utilizzato. Secondo: gli ovociti devono essere brevemente eccitato (5-10 sec) per Hoechst33342 per evitare danni cromatina e la successiva morte degli ovociti, soprattutto se IVM e IVF so.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare
Ringraziamenti
M.M. e C.A.R. riconoscono il sostegno finanziario del Ministero della Salute, Ricerca Finalizzata/giovani ricercatori anno 2009 della Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo, Pavia (I). M.M e C.A.R. ringraziano Marianna Longo per l'aiuto nella preparazione delle immagini.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| PMSG | Sigma | G4527 | |
| EmbrioMax M2 | Millipore | MR-015-PD | |
| Hoechst33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| Olio minerale | Sigma | M8410 | |
| Piatto per colture cellulari 35mmx10mm | Corning | 430165 | |
| µ-Piatto 35mm, fondo di vetro alto | Ibidi | 81158 | |
| Pipetta Pasteur Borosilicato | Corning | 7095D-9 | |
| Tubi aspiratori per pipette micropillari calibrate | Sigma | A5177 |
Riferimenti
- Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data). Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).
- Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O.
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Ristampe e permessi
