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Articolo metodologico

Sintesi di nanoparticelle d'oro liposomi Integrated Photo-reattiva e la misurazione del loro microbolle cavitazione su impulso laser di eccitazione

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DOI:

10.3791/53619

⸱

24 febbraio 2016

 ,  ,  , 
1School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University, 2Division of Physics, School of Physical and Mathematical Sciences, Nanyang Technological University, 3NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine, Nanyang Technological University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo di preparazione semplice per nanoparticelle di oro integrato liposomi foto-reattivo con i materiali disponibili commercialmente. Viene inoltre illustrato come misurare il processo di cavitazione di microbolle dei liposomi sintetizzati sul trattamento di laser pulsato.

Abstract

Le nanoparticelle fotosensibili (NP) hanno ricevuto notevole attenzione a causa del loro potenziale nel fornire un controllo spaziale, temporale e di dosaggio sul rilascio del farmaco. Tuttavia, la maggior parte delle tecnologie pertinenti sono ancora in fase di sviluppo e non sono reperibili dalle cliniche. Qui, descriviamo una facile fabbricazione di queste NP foto-responsive con NP d'oro disponibili in commercio e liposomi termo-responsivi. La calceina viene utilizzata come farmaco modello per valutare l'efficienza di incapsulamento e il profilo cinetico di rilascio in seguito a stimolazione termica/luminosa. Infine, dimostriamo che questo rilascio foto-innescato è dovuto alla rottura della membrana causata dalla cavitazione delle microbolle, che può essere misurata con l'idrofono.

Introduzione

La possibilità di innescare il rilascio del farmaco utilizzando stimoli esterni è un modo interessante per consegnare la droga a mode spazio-, temporo e dosaggio controllato con specificità massimizzata e minimi effetti avversi. Tra una vasta gamma di sistemi esogeni stimoli-reattiva (luce, campo magnetico, ultrasuoni, radiazioni a microonde), piattaforme di luce-triggered sono attraenti, a causa della loro non invasività, semplicità e adattabilità negli ambulatori. 1 Ricerche approfondite negli ultimi dieci anni ha fornito una varietà di tecnologie di piattaforma, come l'oro responsabile nel vicino infrarosso-luce (Au) nanocages rivestiti con polimeri intelligenti, 2 foto-labile, nanoparticelle polimeriche (NP) coniugati con farmaci, 3 e nanovesicles porphysome auto-assemblati. 4 Tuttavia , queste tecnologie sono ancora in fase di sviluppo preclinico, e richiedono una comprensione chiara e ottimizzazione dei parametri legati al processo di avvio e controtolare il rilascio del farmaco.

Uno dei metodi più semplici e facilmente accessibili per la preparazione di un tale sistema è quello di integrare le Au NP con liposomi termicamente sensibili 5,6, entrambi i quali sono ampiamente disponibili sul mercato e sono stati ampiamente studiati in studi preclinici e clinici, anche. Nonostante la limitazione dell'attivazione del tessuto profondo di Au NP alla loro lunghezza d'onda plasmonica, se confrontato con nanostrutture vicino infrarosso attivato Au (ad esempio, nanocages), questo sistema mantiene ancora una grande promessa se ​​usato nei piccoli animali o per la consegna di attualità negli esseri umani. 7 ci sono alcuni primi sforzi in combinando Au NP con liposomi per il rilascio di luce-attivato. 8-11 Mentre la maggior parte di essi riguardano sulla novità dei materiali, problemi di accessibilità e scalabilità devono essere affrontati. Inoltre, i rapporti sui meccanismi di rilascio che utilizzano questi nanovettori sono ancora limitate.

Qui, la fabbricazione di foto-sensibileliposomi, allo stesso tempo carichi di farmaci e idrofili Au NP è stata descritta. Calceina viene utilizzato come composto modello per valutare l'efficienza di incapsulamento e il profilo di rilascio del sistema. Inoltre, in questo sistema, luce assorbita da Au NP dissipa il microambiente circostante sotto forma di calore, con conseguente aumento della temperatura locale. Microbolle d'aria vengono generati durante il riscaldamento laser e causano distruzione meccanica dei liposomi (Figura 1). Il meccanismo della cavitazione microbolle è confermato da misurazioni idrofoni.

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Protocollo

1. Preparazione

  1. Clean 100 ml rotonde palloni a fondo con acqua regia (1 parte di acido nitrico concentrato (HNO 3) e 3 parti di acido cloridrico concentrato (HCl)) e lavare i flaconi con acqua deionizzata. Autoclavare beute e asciugare in un forno ad aria calda a 100 ° C per 15 min. Avvolgere e conservare i flaconi sterili fino al momento dell'uso.
  2. Sterilizzare il set di mini-estrusore portatile utilizzando il 70% di etanolo.
  3. Accendere l'evaporatore rotante e impostare la temperatura del bagno di acqua calda e la torre di raffreddamento a 37 ° C e 4 ° C rispettivamente.
  4. Preparare 60 mM calceina soluzione madre sciogliendo 374 mg di calceina in 10 ml di 0,1 mM tampone fosfato salino (PBS) (pH 7,4). Regolare il pH a 7,4 con 1 M di idrossido di sodio (NaOH).

2. Sintesi di liposomi

  1. Rimuovere i lipidi (1,2-Dipalmitoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (DPPC), 1-palmitoil-2-idrossi-SN -glycero-3-phosphochoLinea (MPPC) e 1, 2-distearoyl- SN -glycero-3-phosphoethanol-quali ammine N - [carbossi (polietilene glicole) -2000] (sale di ammonio) (DSPE-PEG2000)) dal congelatore (-20 ° C) e li scongelare a temperatura ambiente.
  2. Pesare 15,9 mg DPPC, 1,3 mg MPPC, e 2,8 mg di DSPE-PEG2000. li Sciogliere insieme in 2 ml di cloroformio.
  3. Trasferire la soluzione cloroformica al pallone a fondo rotondo sterile ed evaporare il solvente mediante evaporatore rotante a pressione ridotta, per formare un sottile strato lipidico secca,.
  4. Idratare lo strato lipidico a 45 ° C con 2 ml di soluzione acquosa per 30 minuti contenente 1,95 ml 60 mM calceina preparato al punto 1.4 e 50 microlitri Au NPs (3,36 × 10 16 particelle / ml).
  5. Preriscaldare il blocco di riscaldamento a 45 ° C. Mettere un filtro a membrana di policarbonato 200 nm tra i supporti del filtro e montare il set di mini-estrusore. Controllare la potenziale fuoriuscita con acqua deionizzata.
  6. Riempire una delle siringhe con 1 ml di soluzione di liposomi dal punto 2.4 e Extrude l'esempio facendo passare la soluzione alla siringa all'altra estremità del assemblare mini-estrusore. Ripetere 11 volte.
  7. Eseguire i liposomi sintetizzati attraverso una colonna di dissalazione PD-10 per rimuovere le libere Au NP, lipidi e calceina con PBS come eluente secondo il protocollo del produttore.
  8. Conservare i campioni in provette sterili a 4 ° C e utilizzare in 2 giorni.

3. Calceina uscita da liposomi con riscaldamento

  1. Calcolare la molarità lipidico della soluzione di riserva sommando le molarità di DPPC, MPPC, e DSPE-PEG2000 al punto 2.2. Diluire la soluzione di liposomi magazzino di 5 concentrazione di lipidi mm con 0,1 mM tampone PBS (pH 7,4). Trasferire i campioni in una provetta da centrifuga (2 ml).
  2. Collocare la provetta in un bagno di acqua calda, e aumentare gradualmente la temperatura da 25 a 70 ° C. Aumentare la temperatura ad una velocità di 1 ° C / min qui.
  3. Raccogliere aliquote (10 microlitri) in diversi punti di temperatura (27, 32, 37, 39, 41,43, 45, 52, 57, 62, 67 e 70 ° C).
  4. Aggiungere 10 ml di 2% Triton X-100 a 2 ml aliquota della soluzione liposomiale per digerire i liposomi per 10 minuti a RT e realizzare la completa liberazione di calceina.
  5. Trasferire 200 microlitri della soluzione liposomiale per ciascun pozzetto della micropiastra a 96 pozzetti e misurare l'intensità di fluorescenza dei campioni raccolti utilizzando un lettore di fluorescenza per micropiastre. I eccitazione e di emissione di calceina sono rispettivamente 480 e 515 nm.
  6. Prendendo l'intensità di fluorescenza dei campioni Triton X-100 trattate come rilascio 100%, calcolare la percentuale di calceina rilasciato ad ogni punto temporale, utilizzando la formula:
    figure-protocol-1
    Ft è l'intensità di fluorescenza della soluzione in un determinato punto nel tempo. F i e F X Le normalizzati intensità di fluorescenza iniziale e finale della soluzione, rispettivamente.

4. Calceina Relocazione da liposomi con laser pulsato

  1. Trasferire soluzione liposomi 100 ml di una cuvetta di quarzo e collocarlo in un supporto cuvetta. Utilizzare un Nd: YAG con durata dell'impulso di 6 nsec a 532 nm di lunghezza d'onda come fonte di luce. Utilizzare i seguenti parametri Laser - Frequenza di ripetizione: 1 Hz; Densità di energia del laser: 1 mJ / cm 2; Diametro del fascio: 0,5 mm.
  2. Guida il fascio laser collimato attraverso la cuvetta in modo che la luce passa attraverso la soluzione di liposomi e raccogliere aliquote dopo vari impulsi.
  3. Aggiungere 10 ml di 2% Triton X-100 a 2 ml aliquota della soluzione liposomiale per digerire i liposomi per 10 minuti a RT e realizzare la completa liberazione di calceina.
  4. Considerando calceina è sensibile alla luce e potrebbe essere sbiancato durante l'esperimento laser, pre-misurare l'effetto sbiancante del laser impulsato in soluzione calceina per normalizzare i dati dal rilascio liposoma.
    1. In particolare, esporre soluzione calceina (60 mm) a impulsi laser with frequenza di 1 Hz per variare i numeri di impulsi (0, 25, 50 e 100). Misurare l'intensità di fluorescenza della calceina con eccitazione e di emissione di 480 nm e 515, rispettivamente, prima e dopo l'esposizione laser.
    2. Calcolare la quantità di sbiancamento (intensità di fluorescenza di calceina prima di intensità di esposizione del laser / fluorescenza della calceina dopo il numero di impulsi specifico). Utilizzare questo fattore di normalizzazione dei valori ottenuti da campioni di liposomi moltiplicando l'intensità di fluorescenza dei liposomi con il fattore.
  5. Misurare l'intensità di fluorescenza del campione raccolto utilizzando un lettore di fluorescenza per micropiastre alla lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione a 480 e 515 nm, rispettivamente.
  6. Prendendo l'intensità di fluorescenza dei campioni Triton X-100 trattate come rilascio 100%, calcolare la percentuale di calceina rilasciato ad ogni numero di impulsi, utilizzando la formula:
    figure-protocol-2
    Ft è l'intensità di fluorescenza della soluzione ad un dato numero di impulsi dopo la normalizzazione. F i e F X Le normalizzati intensità di fluorescenza iniziale e finale della soluzione, rispettivamente.

5. Determinazione degli impulsi di pressione

  1. Mettere 100 ml di campione su un vetrino microscopico e impostare la messa a fuoco del laser sul campione.
  2. Immergere un idrofono ago (1 mm di diametro e 450 sensibilità nV / Pa) nella soluzione.
    Attenzione: L'idrofono non deve essere illuminata dalla luce laser per evitare il danno.
  3. Irradiare il campione con il laser pulsato con numero variabile di impulsi (0-100) e l'energia di impulso (20-160 μJ / impulso).
  4. Registrare i segnali di pressione utilizzando un oscilloscopio digitale.

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Risultati

I liposomi sono stati preparati utilizzando una tecnica film sottile idratazione convenzionale con DPPC, MPPC e DSPE-PEG2000 in un rapporto molare di 86: 10: 4 o 7,95: 0,65:. 1,39 mg / ml 12 Le dimensioni Au NP è critica per determinare la luce per riscaldare l'efficienza di conversione durante il seguente esperimento eccitazione laser. Minore è la dimensione di Au NP, maggiore è l'efficienza di trasduzione. 13 Così 5 nm Au NP, i più piccoli campioni da part...

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Discussione

idratazione film sottile è il metodo convenzionale per la preparazione di liposomi. Solventi organici (cloroformio in questo caso) sono stati usati per primo dissolvere i lipidi e poi rimosso in un evaporatore rotante a 37 ° C per generare un sottile film lipidico sul pallone. Questo film lipidico venne idratato con la soluzione acquosa contenente 60 mM calceina e 5 nm Au NP. Durante il processo di idratazione, la temperatura è stata mantenuta a circa 50 ° C e il pallone viene agitato costantemente ruotando il pallone. ...

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interesse sono dichiarati.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato parzialmente supportato dagli accademici fondi Tier-1 ricerca per Singapore Ministero della Pubblica Istruzione (RG 64/12 di CX) e NTU-Northwestern Istituto di nanomedicina.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC)Avanti Polar Lipids (Alabama, US)850355Ppolvere, conservare a -20 ° C
1-palmitoil-2-idrossi-sn-glicero-3-fosfocolina (MPPC)Avanti Polar Lipids (Alabama, US)855675Ppolvere, conservare a -20 ° C
1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolo-ammina-N-[metossi(polietilenglicole)-2000] (sale di ammonio) (DSPE-PEG2000)Avanti Polar Lipids (Alabama, US)880120PPolvere, conservare a -20 ° C
Nanoparticelle d'OroSigma Aldrich752568-100mL5  particelle nm, stabilizzate a 0,1  mM PBS
CalceinSigma AldrichC0875-10g60  mM, pH 7,4 (regolato con NaOH)
soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Sigma AldrichP54930,1 mM, pH 7,4
Acqua distillata doppiaSistema di purificazione
Triton X100   Sigma, Life SciencesX-100Per interrompere i liposomi per calcolare l'incapsulamento totale
Rotavapor   Buchi (Svizzera)R 210Utilizzato per la preparazione di Lipososme
Bagno di riscaldamentoBuchi (Svizzera)B 491Utilizzato per la preparazione di Lipososme
Regolatore del vuoto   Buchi (Svizzera)V-850Utilizzato per la preparazione di Lipososme
Pompa a vuotoBuchi (Svizzera)V-700Utilizzato per la preparazione di Lipososme
Bagno di ricircolo con regolatore di temperaturaPolyscienceUtilizzato per la preparazione di Lipososme
Assemblaggio mini-estrusore con blocco riscaldante Avanti Polar Lipids (Alabama, US)610000Utilizzato per l'estrusione di siringhe di liposomi
, 1.000 μ lAvanti Polar Lipids (Alabama, US)610017Utilizzato per l'estrusione di liposomi
Membrana filtrante in policarbonato, 200  nmWhatmann800281Utilizzato per l'estrusione di liposomi Supporto
filtroAvanti Polar Lipids (Alabama, US)610014Utilizzato per l'estrusione di liposomi
PD 10 Coulumns di desalinizzazione, Sephadex G-25 mediumGE Healthcare, Scienze della vita17-0851-01Utilizzato per purificare i liposomi
Centrifuga   Centrifughe da laboratorio Sigma3K30Utilizzate per concentrare la soluzione liposomiale 
RotoreSigma19777-HUtilizzato per concentrare la soluzione liposomiale 
Zetasizer   Nano ZS MalvernUtilizzato per la determinazione delle dimensioni dei liposomi e dello zetapotenziale
Spettrofotometro UV-VisibileShimadzuUV-2450Utilizzato per misurare l'assorbanza dei campioni
Spettrofluorimetro fluorescente   Molecular DevicesSpectraMax M5Utilizzato per misurare l'emissione di fluorescenza dei campioni
Nd:YAG LaserNewWave Research532 nm; Potenza massima: 17  Mj; Larghezza: 406  nsec; Utilizzato per l'irradiazione del campione
Idrofono HNRONDAHNR-1000Diametro 1 mm e sensibilità 450 nV/Pa, Intervallo di frequenza di lavoro corretto: 0,25-10  Megahertz; Calibrazione: 50  mV/Bar; Utilizzato per misurare i segnali acustici
Osciloscopio digitaleLECORY - Wave Runner 64Xi-AFrequenza: 600 MHz; Frequenza di campionamento massima: 10  Gs/sec (a due canali); Utilizzato per registrare i segnali acustici misurati
dell'acqua Millipore Milli-DI

Riferimenti

  1. McCoy, C. P., et al. Triggered drug delivery from biomaterials. Expert Opin. Drug Deliv. 7 (5), 605-616 (2010).
  2. Yavuz, M. S., et al. Gold nanocages covered by smart polymers for controlled release with near-infrared light. Nat. Mater. 8 (12), 935-939 (2009).
  3. Gohy, J. F., Zhao, Y. Photo-responsive block copolymer micelles: design and behavior. Chem. Soc. Rev. 42 (17), 7117-7129 (2013).
  4. Lovell, J. F., et al. Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents. Nat. Mater. 10 (4), 324-332 (2011).
  5. Needham, D., Dewhirst, M. W. The development and testing of a new temperature-sensitive drug delivery system for the treatment of solid tumors. Adv. Drug Deliv. Rev. 53 (3), 285-305 (2001).
  6. Landon, C. D., Park, J. Y., Needham, D., Dewhirst, M. W. Nanoscale drug delivery and hyperthermia: the materials design and preclinical and clinical testing of low temperature-sensitive liposomes used in combination with mild hyperthermia in the treatment of local cancer. Open Nanomed. J. 3, 38-64 (2011).
  7. Sykes, E. A., Dai, Q., Tsoi, K. M., Hwang, D. M., Chan, W. C. Nanoparticle exposure in animals can be visualized in the skin and analysed via skin biopsy. Nat. Commun. 5, 3796(2014).
  8. Paasonen, L., et al. Gold nanoparticles enable selective light-induced contents release from liposomes. J. Control. Release. 122 (1), 86-93 (2007).
  9. Wu, G., et al. Remotely Triggered Liposome Release by Near-Infrared Light Absorption via Hollow Gold Nanoshells. J. Am. Chem. Soc. 130 (26), 8175-8177 (2008).
  10. Leung, S. J., Kachur, X. M., Bobnick, M. C., Romanowski, M. Wavelength-Selective Light-Induced Release from Plasmon Resonant Liposomes. Adv. Funct. Mater. 21 (6), 1113-1121 (2011).
  11. Volodkin, D. V., Skirtach, A. G., Möhwald, H. Near-IR Remote Release from Assemblies of Liposomes and Nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (10), 1807-1809 (2009).
  12. Mills, J. K., Needham, D. Lysolipid incorporation in dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer membranes enhances the ion permeability and drug release rates at the membrane phase transition. Biochim. Biophys. Acta. 1716 (2), 77-96 (2005).
  13. Jiang, K., Smith, D. A., Pinchuk, A. O. Size-dependent Photothermal Conversion Efficiencies of Plasmonically Heated Gold Nanoparticles. J. Phys. Chem. C. 117 (51), 27073-27080 (2013).
  14. Chongsiriwatana, N., Barron, A. Comparing bacterial membrane interaction of antimicrobial peptides and their mimics. Antimicrobial Peptides. Giuliani, A., Rinaldi, A. C. 618, Humana Press. 171-182 (2010).
  15. Egerev, S., et al. Acoustic signals generated by laser-irradiated metal nanoparticles. Appl. Opt. 48 (7), C38-C45 (2009).
  16. González, M. G., Liu, X., Niessner, R., Haisch, C. Strong size-dependent photoacoustic effect on gold nanoparticles by laser-induced nanobubbles. Appl. Phys. Lett. 96, 174104(2010).

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