Descriviamo qui un test con l'accoppiamento di identificazione del DNA adenina metiltransferasi (DamID) ad alto rendimento sequenziamento (DamID-ss). Questo metodo fornisce una migliore risoluzione più elevata e una gamma dinamica più ampia, e permette di analizzare i dati DamID-Seq in combinazione con altri dati di sequenziamento ad alto rendimento, come ChIP-seq, RNA-Seq, etc.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
DamID-seq: Genome-wide Mappatura delle interazioni proteina-DNA da High Throughput Sequencing di Adenina-metilato frammenti di DNA
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il test di identificazione della DNA adenina metiltransferasi (DamID) è un metodo potente per rilevare le interazioni proteina-DNA sia a livello locale che a livello di genoma. Si tratta di un approccio alternativo all'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP). Una proteina di fusione espressa costituita dalla proteina di interesse e dalla DNA adenina metiltransferasi di E. coli può metilare la base adenina nei motivi GATC vicino ai siti di interazione proteina-DNA. I frammenti di DNA metiladenizzato possono quindi essere amplificati e rilevati in modo mirato. Il test DamID originale rileva le posizioni genomiche dei frammenti di DNA metilato mediante ibridazione in microarray di DNA, che è limitata dalla disponibilità di microarray e dalla densità di sonde predeterminate. In questo articolo, riportiamo il protocollo dettagliato di integrazione del sequenziamento del DNA ad alto rendimento in DamID (DamID-seq). L'elevato numero di letture brevi generate da DamID-seq consente di rilevare e localizzare le interazioni proteina-DNA in tutto il genoma con elevata precisione e sensibilità. Abbiamo utilizzato il test DamID-seq per studiare le interazioni genoma-lamina nucleare (NL) nelle cellule di mammifero e abbiamo notato che DamID-seq fornisce un'alta risoluzione e un'ampia gamma dinamica nel rilevare le interazioni genoma-NL. L'approccio DamID-seq consente di sondare le associazioni NL all'interno delle strutture geniche e consente di confrontare le mappe di interazione genoma-NL con altri dati genomici funzionali, come ChIP-seq e RNA-seq.
Introduzione
DNA identificazione adenina metiltransferasi (DamID) 1,2 è un metodo per rilevare le interazioni proteina-DNA in vivo ed è un approccio alternativo per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) 3. Esso utilizza una quantità relativamente bassa di cellule e non richiede reticolazione chimica della proteina con DNA o un anticorpo altamente specifico. Quest'ultima è particolarmente utile quando la proteina bersaglio è liberamente o indirettamente associati con il DNA. DamID è stato utilizzato con successo per mappare i siti di legame di una varietà di proteine tra cui proteine dell'involucro nucleare 4-10, cromatin....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Generazione ed espressione di proteine di fusione e Free Dam proteine
- Clone proteina di interesse nel vettore DamID.
- Amplifica cDNA di proteina di interesse (POI) utilizzando l'alta fedeltà DNA polimerasi desiderato e primer appropriati secondo il protocollo del produttore. Sperimentalmente determinare le condizioni ottimali di amplificazione per garantire la corretta amplificazione inserti.
- Eseguire un gel e purificare amplificato cDNA POI dal kit di estrazione gel secondo il protocollo del produttore.
- CDNA clone del PDI nel vettore pDONR201 utilizzando BP Clonase II secondo il protocollo del produtto....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La proteina di fusione Dam-V5-LmnB1 è stato verificato per essere co-localizzato con il endogena Lamin B proteine mediante immunofluorescenza (Figura 1).
Il successo di amplificazione PCR di frammenti di DNA adenina-metilato è un passo fondamentale per DamID-ss. I campioni sperimentali dovrebbero amplificare una macchia di 0,2 - 2 kb, mentre i controlli negativi (senza DpnI, senza ligasi o senza mascherina P.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Se le proteine con tag Dam mantengono le funzioni delle proteine endogene dovrebbe essere esaminato prima di un esperimento DamID-seq. La localizzazione subcellulare delle proteine dell'involucro nucleare marcate con Dam deve sempre essere determinata e confrontata con quella delle proteine endogene. Per lo studio dei fattori di trascrizione, si suggerisce di esaminare se la proteina di fusione Dam può salvare le funzioni della proteina endogena nella regolazione dell'espressione genica. Questo test funzionale può essere.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. Bas van Steensel per aver fornito i vettori di espressione dei mammiferi DamID. Ringraziamo lo Yale Center for Genome Analysis e il Genomics Core dello Yale Stem Cell Center per i consigli sulla preparazione delle librerie NGS e sull'implementazione del sequenziamento del DNA ad alto rendimento. Questo lavoro è stato supportato dal finanziamento iniziale della Yale School of Medicine, da una sovvenzione per lo sviluppo degli scienziati dell'American Heart Association (12SDG11630031) e da una sovvenzione Seed da Connecticut Innovations, Inc. (13-SCA-YALE-15).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sistemi di espressione lentivirale ViraPower | Life Technologies | K4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20 e K371-20 | |
| Gateway BP Clonase II Enzyme Mix | Life Technologies | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Life Technologies | 11791-020 | |
| DNeasy Blood & Kit fazzoletti (250) | QIAGEN | 69506 o 69504 | |
| Gateway pDONR 201 | Life Technologies | 11798-014 | |
| 293T cellule | di tipo americano Collezione di colture | CRL-11268 | |
| Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo | Life Technologies | 25300-054 | |
| DMEM, alto glucosio, piruvato | Life Technologies | 11995-065 | |
| Siero fetale bovino | Sigma | F4135 | |
| Marca Tris | non critica | ||
| EDTA | non critica | ||
| 200 Marca EtOH | a prova non critica | ||
| Marca Isopropanolo | non critica | ||
| Marca acetato | non critica | ||
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | fornito con |
| adattatori tampone DamID "AdRt" e "AdRb" | integrate di DNA Technologies | disponibili in ref. 24; nessuna fosforilazione dell'estremità 5' o 3' per prevenire l'autolegatura. | |
| T4 DNA Ligasi | Roche Life Science | 10481220001 | fornito con tampone |
| DpnII | New England Biolabs | R0543 | fornito con tampone |
| DamID PCR primer "AdR_PCR" | Sequenze integrate di DNA Technologies | disponibili in ref. 24 | |
| Set di soluzioni di deossinucleotide (dNTP) | New England Biolabs | N0446 | 100 mM ciascuno di dATP, dCTP, dGTP e dTTP |
| Vantaggio 2 Miscela di polimerasi | Clontech | 639201 | fornito con tampone |
| 1Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787018 | 1.0 &; g/µ l |
| Kit di purificazione PCR QIAquick | QIAGEN | 28104 o 28106 | |
| Kit di purificazione PCR MinElute | QIAGEN | 28004 o 28006 | per un volume di eluizione inferiore a 30 µ l |
| Perline SPRI / Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63880 | applicare una miscelazione extra e un tempo di eluizione maggiore se inferiore a 40 & micro; l tampone di eluizione viene utilizzato |
| Tampone EB | QIAGEN | 19086 | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348 | fornito con tampone |
| Tampone di reazione T4 DNA ligasi New | England Biolabs | B0202 | |
| T4 DNA polimerasi | New England Biolabs | M0203 | |
| DNA polimerasi I, grande frammento (Klenow) | New England Biolabs | M0210 | |
| T4 Polinuleotide chinasi | New England Biolabs | M0201 | |
| Frammento di Klenow (3' → 5' exo-) | New England Biolabs | M0212 | fornito con |
| adattatori per il sequenziamento del tampone | Sequenze integrate di DNA Technologies | disponibili in ref. 28 | |
| Kit di legatura rapida | New England Biolabs | M2200 | utilizzato in 3.4.3; fornito con Quick Ligation Reaction Buffer e Quick T4 DNA Ligasi |
| sequencing primer 1 e 2 | Integrated DNA Technologies | disponibili in ref. 28 | |
| KAPA HiFi PCR Kit | Kapa Biosystems | KK2101 o KK2102 | fornito con KAPA HiFi DNA polimerasi, 5x KAPA HiFi Fidelity Buffer e 10 mM dNTP mix |
| agarosio | Sigma Aldrich | A4679 | |
| bromuro | di etidioSigma Aldrich | E1510-10ML | 10 mg/ml |
| Kit di estrazione del gel QIAquick QIAGEN | 28704 o 28706 | ||
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725121 o 1725122 | |
| Spettrofotometro | marca non critico | ||
| 0,45 μ m PVDF Marca del filtro | non critica | ||
| 25 ml Marca di Seringe | non critica | ||
| colture tissutali da 10 cm | marca non critica | ||
| colture tissutali a 6 pozzetti | marca non critica | ||
| Termociclatore S1000 | Bio-Rad Laboratories | ||
| C1000 Touch Termociclatore | Bio-Rad Laboratories | per qPCR | |
| Vortex Mixer | marca non critico | ||
| Dry Block Heater o Thermomixer | marca non critico | ||
| Microcentrifuga | marca non critica | ||
| Sistema di elettroforesi su gel con alimentatore | marca non critica | ||
| Supporto | magneticoper la purificazione del DNA con perle SPRI; dovrebbe contenere provette da 1,5-2 ml; marca non critica | ||
| transilluminatore | marca non critica | ||
| Sistema di elettroforesi E-gel | Life Technologies | G6400, G6500, G6512ST |
Riferimenti
- van Steensel, B., Delrow, J., Henikoff, S. Chromatin profiling using targeted DNA adenine methyltransferase. Nat Genet. 27, 304-308 (2001).
- van Steensel, B., Henikoff, S. Identification of in vivo DNA targets of chromatin proteins using tethered dam methyltr....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
