Selective cellulare eliminazione dalla misto Cultura 3D utilizzando una tecnica Near Infrared Photoimmunotherapy

Sommario

Eliminare cellule specifiche senza danneggiare altre cellule è estremamente difficile, specialmente nei tessuti consolidati, ma c'è un urgente bisogno di un metodo di eliminazione cellulare nel campo dell'ingegneria tissutale. Qui, presentiamo un metodo per l'eliminazione di cellule specifiche da una coltura cellulare 3D mista utilizzando la fotoimmunoterapia nel vicino infrarosso (NIR-PIT).

Abstract

I recenti sviluppi nell'ingegneria tissutale offrono soluzioni innovative per molte malattie. Ad esempio, l'ingegneria tissutale che utilizza cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) è emersa come un nuovo metodo nella medicina rigenerativa. Sebbene questa rigenerazione dei tessuti sia promettente, la contaminazione con cellule indesiderate durante le colture tissutali è una delle principali preoccupazioni. Inoltre, vi è un problema di sicurezza per quanto riguarda la tumorigenicità dopo il trapianto. Pertanto, c'è un urgente bisogno di eliminare cellule specifiche senza danneggiare altre cellule che devono essere protette, specialmente nei tessuti consolidati. Qui, presentiamo un metodo per l'eliminazione di cellule specifiche da una coltura cellulare 3D mista in vitro con fotoimmunoterapia nel vicino infrarosso (NIR-PIT) senza danneggiare le cellule non bersaglio. Questa tecnica consente l'eliminazione di cellule specifiche da colture cellulari o tessuti misti.

Introduzione

Eliminando cellule specifiche senza danneggiare altre cellule è estremamente difficile, soprattutto nel tessuto stabilita, e vi è una necessità urgente di un metodo di eliminazione di cella nel campo dell'ingegneria dei tessuti. Al giorno d'oggi nel campo della medicina rigenerativa, colture di tessuti utilizzando cellule staminali embrionali (ES), le cellule staminali pluripotenti (PSC), o cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) sono materiali promettenti ^1-3.

Anche se questa rigenerazione dei tessuti è promettente, la contaminazione con cellule indesiderate è una preoccupazione importante. Inoltre, vi è un problema di sicurezza di tumorigenicità dopo trapianto ^4,5. Anche se molti studi si sono concentrati su questi temi per eliminare cellule specifiche, in particolare nel campo della medicina rigenerativa ^6-8, nessun metodo pratico è stato sviluppato.

Vicino photoimmunotherapy infrarosso (NIR-PIT) è un trattamento a base di un anticorpo conjugat-photoabsorbere (APC). Un APC è costituito da un anticorpo specifico per cellule monoclonali (mAb) e un photoabsorber, IR700. IR700 è un derivato del idrofila di silice-ftalocianina e non induce di per sé fototossicità ^9. IR700 è covalentemente coniugato all'anticorpo tramite residui ammidici sulla catena laterale di molecole di lisina. L'APC si lega molecole bersaglio sulla membrana cellulare e quindi induce necrosi cellulare quasi immediatamente dopo l'esposizione alla luce NIR a 690 nm. Durante l'esposizione a NIR luce, la rottura della membrana cellulare che portano alla morte batteria ^{9 - 14 anni.} NIR-PIT ha dimostrato di essere efficace con più anticorpi o frammenti di anticorpi, tra cui anti-EGFR, anti-HER2, anti-PSMA, anti-CD25, anti-mesotelina, anti-GPC3, e anti-CEA ^{15 - 21.} Pertanto, NIR-PIT può essere utilizzato contro un'ampia varietà di molecole bersaglio. Inoltre, NIR-PIT è un trattamento ben controllato, che consente il trattamento selettivo di specifiche regioni, limitando la NIR-light irradiazione ^18,22.

Qui, vi presentiamo un metodo di eliminazione cella specifica utilizzando NIR-PIT da culture 3D miste.

Protocollo

Nota: Il protocollo seguente descrive i passi necessari per eliminare le cellule specifici utilizzando NIR-PIT. Controlli e altri dettagli sulla NIR-PIT e vitalità cellulare può essere trovato altrove ^18.

1. Coniugazione del IR700 di anticorpi monoclonali (mAb)

1. Preparare mAb di interesse a 2-5 mg / ml in (8.6 pH) soluzione 0,1 M Na ₂ HPO _4.
2. Mescolare 6.8 nmol di mAb con 30,8 nmol di 10 mm IR700 in 0,1 M Na ₂ HPO ₄ soluzione (pH 8.6) in una provetta e incubare a temperatura ambiente per 1 ora, coperto con un foglio di alluminio.
3. Lavare la colonna PD-10 (vedi tabella dei materiali / attrezzature) con 15 ml di PBS, due volte. Caricare il campione dal punto 1.2.
4. Purificare la miscela tramite la colonna PD-10 da PBS eluizione secondo le istruzioni del produttore.
   Nota: Qui, l'eluizione era lungo la banda di colore di IR700. Per un campione di 300 ml, frazione di eluizione PBS è in genere tra 2,5 ml a 4,4 ml.
5. Determina ilconcentrazione di proteine ​​con Coomassie colorazione misurando l'assorbimento a 595 nm con uno spettrofotometro ^9. Determinare la concentrazione di IR700 con assorbimento a 689 nm per confermare il numero di molecole di fluoroforo coniugati ad ogni molecola mAb ^9.
   Nota: È importante determinare un numero coniugazione ottimale di molecole IR700 in 1 mAb con uno spettrofotometro. Generalmente, circa 3 molecole IR700 in 1 mAb molecola è ottimale sia in vitro che in vivo lavoro. metodi HPLC e SDS-pagina può essere utilizzata per confermare se il mAb e IR700 sono vincolati o meno.
6. Conservare a 4 ° C dopo la determinazione della concentrazione proteica.

2. Preparazione di misto coltura cellulare 3D (misto Spheroid)

1. Applicare acqua sterile (circa 1 ml) nella sezione serbatoio piatto di appendere targhe goccia.
2. Preparare i vari rapporti dei tipi di cellule d'interesse - cellule A431-luc-GFP e cellule 3T3-RFP -con ogni campione contenente 5.000 cellule totali, sospese in 50 ml di terreni di coltura.
   Nota: Preparare 1: 100, 10: 100, 25: 100, 50: 100, ecc rapporti di cellule tipi di interesse in terreni di coltura a seconda del tipo cellulare.
3. Incubare la miscela per 5-7 giorni nel 96 ben appeso piastra goccia in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di anidride carbonica. Modificare i terreni di coltura ogni 2 giorni. Nota: Per rendere il 3D sferoide precisamente, gestire delicatamente la piastra, come gocce che contengono le cellule si staccano facilmente prima di formare forme 3D.
4. Osservare la morfologia e le dimensioni degli sferoidi utilizzando un microscopio campo chiaro invertito a 10X - 40X ingrandimento. Nota: Anche se dipende tipi di cellule e la dimensione di appendere-drop, garantire che il diametro dello sferoide è di circa 400-600 micron dopo 7 giorni di incubazione a 96 ben appesi piastra goccia.

3. In Vitro NIR-PIT per Mixed colture cellulari 3D

1. Modificare i media del ettaringing piastre goccia a 10 ug / ml anticorpo coniugato photoabsorber (APC) supporti contenenti, ed incubare per 6 ore in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di anidride carbonica.
2. Dopo 6 ore di incubazione, lavare la sferoide due volte con terreni di coltura fresco (rosso fenolo libero). trasferire delicatamente il sferoide ad un piatto fondo di vetro da 50 mm con 100 ml di fenolo fresco rosso terreni di coltura gratuitamente utilizzando una sterile 200 ml punta della pipetta con la punta tagliata. Mettere una sferoide in ogni piatto.
3. Osservare il sferoide con un microscopio invertito campo chiaro per rilevare la variazione della morfologia. Per osservare i giornalisti ottici (ad esempio, GFP e RFP) usa microscopio a fluorescenza con le seguenti impostazioni di filtro: GFP - filtro di eccitazione 469 nm e 525 nm filtro per le emissioni; RFP - 559 nm filtro di eccitazione e 630 nm filtro per le emissioni.
4. Posizionare il diodo ad emissione luminosa (LED) sopra il piatto di vetro con il fondo per l'irradiazione.
   Nota: Spheroids possono essere esposti a NIRluce sia sul microscopio o nella cappa laminare.
   1. Misurare la densità di potenza del NIR-luce con un tester di potere ottico ^9. In base a questa misurazione, irradiare NIR-luce tramite diodi emettitori di luce (LED) che emettono luce a lunghezze d'onda di 670-710 nm a 2 J / cm ^2.
      Nota: la luce del LED può penetrare la profondità massima di circa 5 pollici. Effetti citotossici di NIR-PIT dipende solo dato energia a prescindere dalla densità di potenza e la durata dell'esposizione ^23.
5. Dopo l'irraggiamento, trasferire il sferoide in una nuova piastra goccia pendente con 50 ml di terreni di coltura fresco e incubare per 1 giorno in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di anidride carbonica.
6. trasferire delicatamente il sferoide ad un piatto fondo di vetro con 100 ml di terreni di coltura fresco (rosso fenolo libero) utilizzando una sterile 200 ml punta della pipetta con la punta tagliata. Osservare il sferoide con un microscopio a fluorescenza 1 giorno dopo NIR-PIT utilizzando fiimpostazioni ltro descritto al punto 3.3.
   1. Rilevare cellule morte aggiungendo propidio ioduro ai media ad una concentrazione finale di 2 mg / ml, o perdita di citoplasmatica GFP-fluorescenza utilizzando un microscopio a fluorescenza (Figura 2B) ^14,18,22.
7. Ripetere i passaggi 3,1-3,6 se le cellule bersaglio non sono completamente eliminati.

Risultati

Per monitorare otticamente l'effetto di NIR-PIT, la linea cellulare A431, che overexpresses EGFR, è stato geneticamente modificato per esprimere anche GFP e luciferasi (A431-luc-GFP). Come un non-bersaglio di NIR-PIT, la linea di cellule Balb / 3T3 è stato otticamente modificato per esprimere RFP (3T3-RFP). L'APC, panitumumab-IR700 (pan-IR700), è stato sintetizzato. Sferoidi misti, che sono stati composti da vari rapporti di cellule (A431-luc-GFP e 3T3-RFP) sono stati realizzati ...

Discussione

Abbiamo dimostrato un metodo di eliminazione delle cellule specifiche da una coltura cellulare 3D mista senza danneggiare le cellule non bersaglio utilizzando NIR-PIT. Finora, non esiste un metodo pratico di eliminazione delle cellule volta che il tessuto è stabilita o dopo il trapianto. Così, NIR-PIT è un metodo promettente per raggiungere questo obiettivo. Questa tecnica può anche essere utilizzato in vivo ^18,22, poiché APC mostrano una farmacocinetica simile a mAb stessa. Il tipo di cellu...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
IRDye 700DX Estere Colorante a infrarossi	LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)	929-70011
Na2HPO4	SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)	S9763
Colonna Sephadex G25 (PD-10)	GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)	17-0851-01
Coomassie (bradford) Plus saggio delle proteine	Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)	PI-23200
Perfecta3D 96-Well Hanging Drop Plates	3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA)	HDP1096-8
Misuratore di potenza ottica	Thorlabs (Newton, NJ, USA)	PM100
LED: L690-66-60	Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA)	L690-66-60
Vectibix (panitumumab)	Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)
35  mm piatto fondo vetro, piatto misura 35  mm, pozzetto misura 10  mm	Cellvis (Mountain View, CA, USA)	D35-10-0-N