Articolo metodologico

Isolamento di leucociti infiltranti da mouse pelle utilizzando enzimatica Digest e Separazione Gradient

DOI:

10.3791/53638

⸱

25 gennaio 2016

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1Department of Biology, Macalester College, 2Department of Medicine, Division of Rheumatic and Autoimmune Diseases, Center for Immunology, University of Minnesota

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive la digestione enzimatica della pelle di topo in un terreno ricco di sostanze nutritive seguita dalla separazione in gradiente per isolare i leucociti. Le celle così derivate possono essere utilizzate per diverse applicazioni a valle. Si tratta di un'alternativa efficace, economica e migliorata alle macchine per la dissociazione dei tessuti e ai protocolli di digestione dei tessuti più aggressivi basati su tripsina e dispasi.

Abstract

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Dissociare la pelle murina in una sospensione a singola cellula è essenziale per l'analisi cellulare a valle, come la caratterizzazione delle cellule immunitarie infiltranti in modelli di infiammazione cutanea di roditori. Qui, descriviamo un protocollo per la digestione della pelle di topo in una soluzione ricca di sostanze nutritive con collagenasi D, seguita dalla separazione delle cellule ematopoietiche utilizzando un gradiente di densità discontinuo. Le cellule così ottenute possono essere utilizzate per studi in vitro, trasferimento in vivo e altre analisi cellulari e molecolari a valle, compresa la citometria a flusso. Questo protocollo è un'alternativa efficace ed economica ai costosi dissociatori meccanici, alle colonne di separazione specializzate e ai metodi di digestione più severi basati su tripsina e dispasi, che possono compromettere la vitalità cellulare o la densità delle proteine di superficie rilevanti per la caratterizzazione fenotipica o la funzione cellulare. Come mostrato qui nei nostri dati rappresentativi, questo protocollo ha prodotto cellule altamente vitali, conteneva sottogruppi di cellule immunitarie specifiche e non ha avuto alcun effetto sull'integrità delle comuni proteine marcatrici di superficie utilizzate nell'analisi citofluorimetrica.

Introduzione

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Le condizioni della pelle che vanno da dermatite da contatto, eczema, psoriasi, cellulite, infezioni fungine e ascessi a tumori cutanei non-melanoma sono risultati essere tra le 50 malattie più diffuse a livello mondiale, e la quarta causa globale di malattie non mortali nel 2010 1. Di conseguenza, l'indagine dei meccanismi molecolari e cellulari alla base diverse patologie della pelle è una zona necessaria e attiva di ricerca. Modelli di roditori sono stati notevolmente utili per la comprensione delle condizioni infiammatorie della pelle come la dermatite atopica 2, 3 psoriasi, o infezione da Staphylococcus aureus 4. Protocolli economici, efficienti e semplici per la digestione enzimatica del tessuto cutaneo mouse può fornire preparazioni di cellule che possono essere utilizzati per una varietà di applicazioni a valle per comprendere meglio la fisiopatologia di malattie della pelle. Qui, un metodo semplice ed economico è descritto per digerito enzimatico di pelle topotessuto e l'isolamento di leucociti infiltranti pelle che può essere utilizzato per la coltura cellulare, in vivo trasferimento adottivo, analisi citofluorimetrica e smistamento o studi di espressione genica. L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare una sospensione singola cella di leucociti-pelle infiltrante con la vitalità delle cellule di alta minimizzando i costi tipicamente associati con kit di reagenti personalizzate e dissociatori meccanici.

Esistenti tessuto cutaneo metodi di dissociazione 5-7 può provocare vitalità delle cellule e la superficie di integrità basso marcatore, o richiedere i kit di enzimi personalizzate e costose macchine di dissociazione dei tessuti 8-11. Mentre la digestione del tessuto cutaneo orecchio del mouse è ragionevolmente diffusa 12-13, digerire il tessuto della pelle altamente cheratinizzato (ad esempio, dal fianco) può risultare in preparazioni di cellule contaminate con grandi quantità di detriti non cellulare. In un recente studio, Zaid e colleghi hanno digerito la pelle del fianco del mouse per 90 minuti a 2,5 mg / ml dispasi, follocon a capo 45 min a 3 mg / ml di collagenasi 7. In un altro studio, questi ricercatori hanno utilizzato più incubazioni con una digestione combinato di 2,5 ore, compreso l'uso di tripsina / EDTA, collagenasi III, e dispasi 5. L'uso di tripsina non è raccomandato per la digestione enzimatica della pelle, come il trattamento con tripsina da diversi costruttori ha mostrato di influenzare misurabile l'integrità delle proteine ​​di superficie cellulare su cellule di mammifero 14-15. Inoltre, dispasi può avere effetti significativi sulla capacità proliferativa delle cellule CD4 e CD8α T e influenzare l'abbondanza superficie di almeno 20 molecole, tra cui comune T marcatori di attivazione delle cellule, quali CD62L 16. Altri protocolli utilizzano RPMI 1640 nel mezzo di digestione 6. Tuttavia, la presenza di Mg 2+ e Ca 2+ in RPMI può causare aggregazione vasta cella 17.

Un protocollo ideale per la dissociazione di tessuto dovrebbe puntare per la vitalità delle cellule in alto, bassolivelli di aggregazione delle cellule, e il minimo danno al cellulare proteine ​​di superficie. Alta qualità preparazioni cellulari linfonodo stromali sono stati compiuti con protocolli che utilizzano enzimi incubazione più brevi, Ca 2+ e Mg 2+ media liberi, e di evitare tripsina e dispasi 18. Tuttavia, non sono state stabilite protocolli di questo tipo per la dissociazione di tutta la pelle del mouse.

Qui, un protocollo è descritto a dissociarsi, isolare, e arricchire leucociti-pelle infiltrazione dalla pelle del mouse fianco allergene-sfidati. In breve, la pelle asportata è pre-incubato in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) con siero fetale bovino 10% per 1 ora per ammorbidire i tessuti per la digestione e rimuovere il tessuto adiposo della pelle o morti in eccesso. Questa è seguita da una fase 30 min di digestione enzimatica con 0,7 mg / ml di collagenasi D. collagenasi D ha effetti minimi sulla densità di marcatori di superficie cellulare, e nessun effetto sulla proliferazione delle cellule T in vitro 16,18, rendendoparticolarmente adatto per applicazioni che coinvolgono la caratterizzazione delle proteine ​​di superficie. A seguito di digestione enzimatica, discontinua gradiente di densità centrifugazione è stato utilizzato per rimuovere le cellule epiteliali e detriti dalla cella singola sospensione e arricchire per le cellule ematopoietiche. È importante sottolineare che questo procedimento evita costosi cellulari magnetico reagenti separazione basati su colonne e macchine dissociazione tissutale 8-11, e può essere eseguita con attrezzature e materiali trovati in un laboratorio di base ricerca biomedica. Ecco questo protocollo è stato utilizzato per isolare leucociti dalla pelle fianco sfidato tre volte con il oxazolone aptene (bue) in precedenza sensibilizzati topi ND4 svizzeri (adattato da 19). Le cellule sono state analizzate utilizzando citometria a flusso multiparametrica. Questa tecnica ha prodotto una sospensione cellulare con detriti minima e> 95% vitalità dei linfociti isolati che sono state analizzate mediante flusso multi-parametrica citometria a misurare l'infiltrazione di linfociti T e neutrofili nella sk interessatoin.

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Protocollo

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Nota: i topi 8-12 settimane vecchia femmina ND4 svizzero Webster, convenzionalmente sono alloggiati con libero accesso a cibo e acqua, sono stati utilizzati per questi studi Il protocollo sperimentale utilizzato (B13S1) è stato approvato dal IACUC del Macalester College..

1. Sensibilizzazione e sfida con Oxazolone

  1. Giorno 0
    1. Preparare camera di anestesia con l'aggiunta di 3 ml di isoflurano per asciugamani assorbenti posizionati sotto rete in fondo a un 4 L con coperchio vaso di vetro. Per i topi ND4 femminile usato qui, il tempo nella camera è 30-60 secondi fino a quando il soggetto è adeguatamente anestetizzato; ottimizzare la somministrazione di anestetici per utilizzarlo ceppo di topi.
    2. Radere la schiena di ogni topo anestetizzato e affiancare con un trimmer peli di animali.
  2. Giorno 1
    1. Effettuare una soluzione al 2% di 4-ethoxymethylene-2-fenil-2-ossazolin-5-one (Ox) in etanolo assoluto, e incubare a 50 ° C per 15 minuti su un piatto rotante in un incubatore.
    2. Brevemente anestetizzaretopo, utilizzando anestesia isoflurano come descritto al punto 1.1.1 e applicare 100 ml di 2% bue alla schiena rasata in diverse applicazioni di serie di circa 20 ml ciascuno. Attendere 5-10 secondi tra le applicazioni di serie per la soluzione ad asciugare.
    3. Fare attenzione per evitare di versare la soluzione Bue 2% sulle regioni diverse dalla schiena, e aspettare che la soluzione ad asciugare tra le applicazioni.
  3. Giorni 5-7
    1. Fare una soluzione 1% di (Ox) in etanolo assoluto, e incubare a 50 ° C per 15 minuti su un piatto rotante in un incubatore.
    2. Delicatamente ma con fermezza immobilizzare il mouse alla collottola della base del collo e la coda con l'addome rivolto verso l'alto e il collo leggermente inclinata verso il basso (simile a una presa per un'iniezione intraperitoneale) e applicare 100 ml di 1% Bue al fianco rasato in diverse applicazioni di serie e il tempo per asciugare la pelle poi come descritto sopra.
    3. Per i topi di controllo, applicare 100 ml di veicoli etanolo assoluto per il flan rasatoK.

2. Fianco pelle Harvest

  1. Euthanize topi utilizzando anidride carbonica e l'inalazione accise accuratamente la zona desiderata della pelle del fianco (~ 25 mm x 25 mm della cute) con 10 cm forbici chirurgiche.
  2. Utilizzando una lama chirurgica tagliente pulito, raschiare via il grasso in eccesso e il tessuto connettivo della pelle del fianco.
  3. Posizionare 3 pezzi di pelle fianco da 3 topi in una provetta conica da 50 ml contenente 10 ml di HBSS RT [con rosso fenolo, senza calcio o magnesio, 5 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 10 mM 4- (2-idrossietil) -1- L'acido piperazineethanesulfonic (HEPES), e siero fetale bovino al 10% (FBS)].

3. Pre-digestione del tessuto di lavaggio

  1. Luogo tubo contenente frammenti di pelle su un piatto rotante per 30 minuti in un incubatore non gasati secco mantenuto a 37 ° C.
  2. Vortex vigorosamente per 10 secondi al termine del periodo di incubazione.
  3. Filtrare il contenuto del tubo attraverso un 70 microncolino per eliminare il tampone di lavaggio e raccogliere il tessuto. Un unico filtro può essere riutilizzato durante tutta la procedura in un gruppo di trattamento biologico.
  4. Utilizzando un paio di pinze, di trasferire la pelle del fianco dal filtro in un nuovo tubo conico da 50 ml contenente 10 ml di fresco, RT HBSS media (contenenti EDTA, HEPES, e FBS come descritto sopra).
  5. Con un paio di forbici chirurgiche sezionare immersi nel tubo 12,5 centimetri, tritare ogni pezzo di pelle del fianco in modo che il pezzo di tessuto media è di circa 2,2 mm x 2,2 millimetri nella zona.
  6. Luogo tubo contenente frammenti di pelle su un piatto rotante per 30 minuti in un incubatore non gasati secco mantenuto a 37 ° C.
  7. Vortex vigorosamente per 10 secondi alla fine dell'incubazione

4. Collagenase Digestione di pelle

  1. Filtrare il contenuto del tubo attraverso un filtro 70 micron, raccogliere e trasferire i pezzi della pelle del fianco in una nuova provetta conica da 50 ml contenente 10 ml fresh, RT HBSS multimediale integrato con 0,7 mg / ml collagenasi D.
  2. Tubo Luogo terreno contenente la digestione e frammenti di pelle su un piatto rotante per 30 minuti in un incubatore non gasati secco mantenuto a 37 ° C.
  3. Contenuti vortice di tubo vigorosamente per 10 secondi al termine dell'incubazione.
  4. Filtro contenuto della provetta attraverso un filtro 70 micron in una nuova provetta da 50 ml; mantenere il flusso continuo contenente il tessuto digerito e gettare il filtro e affiancare i residui della pelle.
  5. Lavare il flusso continuo in 50 ml di HBSS supporti, centrifugare per 5 minuti a 350 g, e decantare il surnatante.

5. Densità centrifugazione gradiente

  1. Usando una pipetta sierologica, aggiungere 3 ml di RT 67% gradiente di densità centrifugazione media in 1X tampone fosfato salino (PBS) in un nuovo tubo da 15 ml per ogni campione.
  2. Risospendere il pellet di cellule in 5 ml RT 44% di densità supporti centrifugazione in gradiente in HBSS con rosso fenolo.
  3. Gentiluomoly strato 5 ml di media centrifugazione in gradiente di densità 44% contenente le cellule sulla parte superiore del gradiente di densità centrifugazione campione supporti 67% utilizzando una pipetta sierologica. Assicurarsi di impostare la pipetta alla velocità più bassa, e posizionare la pipetta lungo la parete del tubo conico. Fare attenzione a non tremare, interrompere o invertire il gradiente.
  4. Impostare l'accelerazione sul valore più basso, disinserire il freno, e centrifugare il gradiente a 931 xg per 20 minuti a temperatura ambiente facendo in modo che la centrifuga è equilibrata.
  5. Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione il gradiente dalla centrifuga, e trasportare delicatamente per il banco di laboratorio tiene il tubo in posizione verticale. Utilizzando un 5 ml plastica trasferimento pipetta, rimuovere lo strato di cellule all'interfaccia dei mezzi di centrifugazione in gradiente di densità 44% e il 67% e il trasferimento in una nuova provetta conica da 15 ml. Se l'interfaccia non è visibile, è sufficiente rimuovere circa 2 ml di liquido al 67% -44% di confine.
  6. Riempire il tubo conico contenente cellule dal interfaccia con il 2% FBS in 1X PBS freddo, le cellule centrifugare per 5 minuti a 350 xg, e decantare il surnatante.
    Nota: Questa è la prima volta che le cellule possono essere raffreddati / mantenuto freddo, in quanto mineralizzazione sono a 37 ° C e gradini multimediali gradiente di densità di centrifugazione sono a RT. Le celle possono essere risospese in 1: 1 Trypan blue diluizione e conteggi e informazioni redditività possono essere ottenute a questo punto.

6. Blocco e colorazione per analisi citofluorimetrica

  1. Blocco FcγRII / recettori III sulle cellule per prevenire non specifica colorazione anticorpi. Per gli esperimenti descritti, fare Master Mix anticorpo in PBS con il 2% FBS contenente diluizione 1: 100 di anticorpi non coniugato contro CD16 / 32 (2.4G2) per legare e recettori blocco FcγRII / III.
  2. Incubare le cellule bloccate con le opportune Master Mix di anticorpi contro CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8α (53-6,7), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 ( 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14), e Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5), nonché Brilliant Violet 510 vivo macchia / morti per identificare le cellule morte. Utilizzare tutti gli anticorpi sia alla diluizione raccomandata dai produttori o precedentemente ottimizzata dai ricercatori. Per gli esperimenti qui descritti, utilizzare tutti gli anticorpi a diluizione 1: 100.
  3. Lavare le cellule e risospendere in 50 microlitri PBS 1X tampone colorazione con 2% FBS. Tenere in ghiaccio fino a quando i dati di fluorescenza possono essere acquisiti su un citofluorimetro.
    Nota: è importante avere i parametri di compensazione pre-ottimizzati con un tessuto linfoide e un antigene di superficie cellulare comune (come CD4 o CD8) prima acquisizione dei dati di fluorescenza.
  4. Per aumentare il numero di cellule per il flusso downstream citometria acquisire dati da campioni interi di cellule colorate.

7. Analisi Citometria a flusso di dati utilizzando metodi standard per realizzare il procedura descritta di seguito

  1. In primo luogo, porta sulla regione dei linfociti del forward scatter(area) da scatter laterale (area) trama.
  2. Quindi, selezionare singole cellule utilizzando la dispersione in avanti (larghezza) per scatter laterale (larghezza), al fine di evitare l'analisi doppiette. Questo può anche essere realizzato con un altezza scatter in avanti per l'altezza side scatter plot.
  3. Poi, cancello sulla stirpe (CD11b, CD11c, e CD45R / B220) -negativa e CD3 positivi eventi, di escludere i macrofagi, le cellule cellule dendritiche, e B, rispettivamente, e confine analizza al compartimento delle cellule T, se l'obiettivo è, come qui, per valutare infiltrante cellule T.
  4. Avanti, porta in cellule vive che escludono il live macchia / morti.
  5. Infine, cancello sulla popolazione di cellule (vedi rappresentante la sezione risultati).

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Risultati

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Collagenasi D trattata splenociti presentano livelli simili di CD4 e CD8 α sulle cellule T rispetto ai controlli multimediali trattati
In primo luogo, gli effetti potenziali di collagenasi D sulla frequenza e la superficie abbondanza di lignaggio e di attivazione marcatori su sottogruppi di cellule T sono stati valutati utilizzando tessuto linfoide secondario come controllo. Una sospensione di splenociti ottenuti da topi è stato ND4...

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Discussione

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Caratterizzare cambiamenti nei leucociti pelle-residenti in modelli di roditori di malattie della pelle come la dermatite atopica o psoriasi è importante per capire i collegamenti meccanicistici tra afflusso di cellule infiammatorie e la patologia della malattia. Qui si descrive una tecnica economica per isolare leucociti dal tessuto della pelle con attrezzature di base trova nella maggior parte dei laboratori di ricerca biomedica. Questa tecnica relativamente rapida evita l'uso di macchine dissociazione tissue cost...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno interessi finanziari o di altro da dichiarare.

Ringraziamenti

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Il National Institutes of Health (NIH R15 NS067536-01A1 a DC), la National Association Vulvodinia (premio a DC), e Macalester College di sostenuto questo lavoro. CB ha ricevuto una borsa di studio dalla Macalester College di Beckman Scholars Program, finanziato dal Arnold e Mabel Beckman Foundation. BTF e TM sono supportati da JDRF 2-2011-662. Ringraziamo il Dr. Jason Schenkel e il Dr. Giuliana Lewis per un parere tecnico, e tutti i membri attuali e precedenti del laboratorio Chatterjea per il loro aiuto e sostegno.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
HBSS con rosso fenolo, senza calcio, senza magnesio, liquidoSigma Aldrich55021CConservare sterile fino al giorno dell'uso.
HEPES, ≥ 99,5% (titolazione)Sigma AldrichH3375
Soluzione di sale disodico EDTASigma AldrichE7889Conservare sterile fino al giorno dell'uso.
Siero fetale bovino, USDA, inattivato al calore, Premium SelectMidSciS01520HIConservare sterile fino al giorno dell'utilizzo.
Percoll, pH 8,5-9,5 (25° C)Sigma AldrichP1644Mantenere sterile. Prima dell'uso, il Percoll deve essere reso isotonico con 10X PBS sterile.
Kit combinato per rifinitoreKent ScientificCL9990-1201 Usa il rifinitore più grande per radere il fianco e la schiena.
4-etossimetilene-2-fenil-2-ossazolin-5-oneSigma AldrichE0753-10Gsi scioglie in 100% EtOH a 50 gradi; C per 15 minuti su un piatto rotante.
Anti-topo purificato CD16/CD32 (2.4G2)Tonbo Biosciences70-0161Anticorpo utilizzato per bloccare il legame anticorpale non specifico durante la colorazione degli anticorpi per citometria a flusso
anti-CD3ε-BV650 (145-2C11)Becton Dickinson564378Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per la citometria a flusso
anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)eBioscience47-0042-80Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per il flusso citometria
anti-CD8&alfa;-BV785 (53-6.7)BioLegend100749Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per citometria a flusso
anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)eBioscience48-0112-80Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per citometria a flusso
anti-CD11c-eFluor450 (N418)eBioscience48-0114-80Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per citometria a flusso
anti-CD44-BV711 (IM7)Becton Dickinson563971Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per citometria a flusso
anti-CD45-FITC (30-F11)Tonbo Biosciences35-0451-U025Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per citometria a flusso
anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)eBioscience48-0452-80Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per citometria a flusso
anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)BioLegend104431Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per citometria a flusso
anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)BioLegend108407Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per citometria a flusso
Ghost Dye-BV510Tonbo Biosciences13-0870-T100Colorante di vitalità per citometria a flusso
LSR FortessaBecton DickinsonAnalizzatore cellulare N/A(18 parametri)
Collagenasi D da Clostridium histolyticumRoche Applied Science11088858001Aliquot enzima liofilizzato a 5 mg/ml in HBSS con rosso fenolo, senza calcio e senza magnesio in aliquote da 1 ml. Conservare immediatamente a -20 gradi C per un massimo di sei mesi.
ND4 Topi femmina svizzeriHarlan0-328-12 settimane; alloggiati convenzionalmente con libero accesso a cibo e acqua e utilizzati secondo le linee guida IACUC del Macalester College.

Riferimenti

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