Esame di proteine ​​legate al DNA Nascente in cellule di mammifero utilizzando la tecnica BrdU-chip-Slot-occidentale

Srividya Bhaskara

doi:10.3791/53647

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Articolo metodologico

Esame di proteine legate al DNA Nascente in cellule di mammifero utilizzando la tecnica BrdU-chip-Slot-occidentale

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DOI:

10.3791/53647

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14 gennaio 2016

Srividya Bhaskara¹

¹Department of Radiation Oncology, Department of Oncological Sciences, Huntsman Cancer Institute, University of Utah School of Medicine

In questo articolo

Sommario

In questo protocollo, descriviamo una nuova tecnica BrdU-ChIP-Slot-Western per esaminare le proteine e le modificazioni istoniche associate al DNA appena sintetizzato o nascente.

Abstract

Istone deacetilasi 1 e 2 (HDAC1,2) localizzano ai siti di replicazione del DNA. Nello studio precedente, utilizzando un inibitore selettivo e di un sistema atterramento genetica, abbiamo dimostrato le funzioni nuovi per HDAC1,2 nella progressione della forcella replica e nascente manutenzione cromatina in cellule di mammifero. Inoltre, abbiamo utilizzato una tecnica BrdU-chip-Slot-occidentale che combina immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di bromo-deossiuridina (BrdU) DNA -labeled con macchia slot e occidentale analisi per misurare quantitativamente proteine o modificazione degli istoni associati con il DNA nascente.

Attivamente cellule in divisione sono state trattate con HDAC1,2 inibitore selettivo o trasfettate con siRNA contro HDAC1 e HDAC2 e quindi il DNA di nuova sintesi è stato etichettato con il bromodeossiuridina timidina analogico (BrdU). L'etichettatura BrdU è stata fatta in un punto di tempo in cui non c'era significativo arresto del ciclo cellulare o apoptosi a causa della perdita delle funzioni HDAC1,2. Seguendo lAbeling di cellule con BrdU, immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di marchi di acetilazione degli istoni o la cromatina-remodeler è stata effettuata con anticorpi specifici. BrdU marcato DNA ingresso e l'immunoprecipitato (o chip) DNA è stato poi trasferite su una membrana con la tecnica di slot blot ed immobilizzati mediante UV. La quantità di DNA nascente in ciascuno slot è stata poi valutata quantitativamente mediante analisi Western con un anticorpo anti-BrdU. L'effetto della perdita di funzioni HDAC1,2 sui livelli di nuova sintesi degli istoni marchi acetilazione DNA associate e cromatina remodeler è stato quindi determinato normalizzando il segnale di BrdU-Chip ottenute dai campioni trattati ai campioni di controllo.

Introduzione

Riparazione del DNA difettosa e / o replicazione del DNA sono una delle principali cause di instabilità genomica, che può innescare la morte cellulare. Un singolo non riparato doppia interruzione filo è sufficiente a causare la morte delle cellule ^1. Organizzazione della cromatina è transitoriamente alterata sia in fase di replica e riparare ^2,3, e l'incapacità di mantenere le informazioni epigenetiche nel corso di questi processi si tradurrà in una minaccia per l'integrità del genoma. Perdita di HDAC3 o della funzione HDAC1,2 impedisce progressione fase S, la replicazione e riparazione del DNA che porta a stress genotossico (danni al DN....