Analisi quantitativa di espressione della proteina per studiare Lineage specifica nel topo preimpianto embrioni

Summary

Questo protocollo presenta un metodo per eseguire quantitativa, cella singola analisi in situ di espressione della proteina per studiare specifiche lignaggio in embrioni di topo preimpianto. Le procedure necessarie per la raccolta di blastocisti, tutto il montaggio di rilevamento di immunofluorescenza di proteine, l'imaging di campioni su un microscopio confocale, e la segmentazione nucleare e l'analisi delle immagini sono descritte.

Abstract

Questo protocollo presenta un metodo per eseguire quantitativa, monocellulari in situ analisi dell'espressione della proteina per studiare specifica lineage in embrioni di topo preimpianto. sono descritte le procedure necessarie per la raccolta degli embrioni, immunofluorescenza, imaging su un microscopio confocale, e la segmentazione di immagine e di analisi. Questo metodo consente la quantificazione dell'espressione dei diversi marcatori nucleari e spaziali (XYZ) coordina tutte le cellule nell'embrione. Si avvale di minuti, uno strumento software per la segmentazione di immagini appositamente sviluppato per l'analisi di immagini confocale di embrioni preimpianto e colonie di cellule staminali embrionali (ESC). MINS svolge segmentazione nucleare senza supervisione di tutti i X, Y e Z dimensioni, e produce le informazioni sulla posizione della cella in uno spazio tridimensionale, così come i livelli di fluorescenza nucleari per tutti i canali con input dell'utente minima. Mentre questo protocollo è stato ottimizzato per l'analisi di immaginidi preimpianto embrioni fase di topo, può essere facilmente adattato per l'analisi di altri campioni che presentano un buon rapporto segnale-rumore e dove ad alta densità nucleare pone un ostacolo alla segmentazione dell'immagine (ad es., analisi di espressione di cellule staminali embrionali (ESC ) colonie, differenziando cellule in coltura, gli embrioni di altre specie o stadi, ecc.)

Introduction

L'embrione di topo preimpianto è un paradigma per studiare la formazione e il mantenimento della pluripotenza in vivo, così come un modello per lo studio della determinazione del fato cellulare e de novo epitelizzazione nei mammiferi. Le fasi preimpianto dello sviluppo dei mammiferi sono dedicati alla creazione di tre linee cellulari che compongono la blastocisti, vale a dire la epiblasto pluripotente - che dà luogo alla maggior parte dei tessuti somatici e le cellule germinali - e due linee extraembrionali, il trophectoderm (TE) e la endoderma primitivo (PRE) (Figura 1A) ^1,2. Questo protocollo descrive le procedure p....

Protocol

Etica dichiarazione: Tutti i lavori animale, compreso l'allevamento, l'allevamento e il sacrificio è stato approvato dal Comitato Memorial Sloan Kettering Cancer del Centro Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC), il protocollo # 03-12-017.

1. Embrione Collection

Nota: Tutti i lavori animale deve essere stato approvato dalle autorità istituzionali e locali e conformi alle norme locali e istituzionali.

1. Mate un topo femmina vergine con un perno maschio fertile dei genotipi desiderati.
   Nota: Se la creazione di accoppiamenti naturali, selezionando le femm....

Results

Per facilitare l'interpretazione e la presentazione dei dati, si deve prestare attenzione a non danneggiare gli embrioni durante la raccolta e la manipolazione, in modo che tutte le cellule e la loro posizione relativa possono essere analizzati Figura 2A -. D mostra esempi di blastocisti intatti in diverse fasi, con una cavità estesa. In caso di danni, la cura dovrebbe essere presa quando l'analisi e l'interpretazione dei risultati.

Discussion

Il presente protocollo descrive un metodo per eseguire un'analisi quantitativa di tutto il montaggio immunofluorescenza su preimpianto degli embrioni palco del mouse. Un robusto protocollo di immunofluorescenza ²² è seguito da ad alta risoluzione, tutto il montaggio confocale e dalla segmentazione delle immagini utilizzando un pezzo su misura del software ^4. Mentre la scelta del protocollo immunofluorescenza non è critica, troviamo quello qui presentato ²² per essere veloce, affidabi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Raccolta embrioni
Sonda smussata per il controllo dell'otturatore	Roboz	Pinze RS-9580
Roboz		RS-4978
Forbici chirurgiche	Roboz	RS-5910
Pipette in vetro Pasteur	Fisher	13-678-20C
Tubo aspiratore preassemblato e bocchino	Sigma	A5177
Tubo in gomma più lungo	Fisher	14-178-2AA
M2	Millipore	MR-015-D
FHM	Millipore	MR-024-D
Soluzione di Tyrode acido	Millipore	MR-004-D
Penicillina/Streptomicina	Gibco	15140
Siero bovino Albumina	Sigma	A9647
piastre a 4 pozzetti	Nunc/Thermo-Fisher	12-566-300
Immunofluorescenza
Piastre con fondo a U a 96 pozzetti	Fisher	14-245-73
Triton X-100	Sigma	T8787
Glycine	Sigma	G7403
Siero di cavallo	Sigma	H0146
Anticorpi primari			Concentrazione
CDX2	Biogenex	AM392-5M	1:200
GATA6	R& D	AF1700	1:100
GATA4	Santa Cruz	sc-9053	1:100, fissazione 10 min
GATA4	Santa Cruz	sc-1237	1:100, fissazione O/N
SOX17	R& D	AF1924	1:100
Nanog	ReproCELL	RCAB0002P-F	1:500
OCT4	Santa Cruz	sc-5279	1:100, 10 min a fissazione O/N
DAB2	BD	BD-610464	1:200
Anticorpi secondari	Life	Technologies Vari	1:500
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
Imaging
35 mm con fondo in vetro	MatTek	P35G-1.5-14-C
Segmentation
Computer con sistema operativo		n/a	Verificare i requisiti minimi di sistema presso http://katlab-tools.org e in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports
MATLAB (software)	Mathworks	n/a
MINS (software)	Gratuito	n/a	http://katlab-tools.org