Qui, descriviamo in dettaglio un approccio di microscopia video time-lapse per misurare il reclutamento temporale di EYFP-Parkin durante la rimozione selettiva dei mitocondri danneggiati. Questo processo dinamico di rimozione dei mitocondri danneggiati da EYFP-Parkin-dipendente può essere utilizzato come indicatore della salute cellulare in diverse condizioni sperimentali.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Time-Lapse Video Microscopia per la valutazione di EYFP-Parkin aggregazione come marcatore per cellulare Mitophagy
In questo articolo
Sommario
Abstract
La microscopia video time-lapse può essere definita come l'imaging in tempo reale di cellule viventi. Questa tecnica si basa sulla raccolta di immagini in diversi punti temporali. Gli intervalli di tempo possono essere impostati tramite un'interfaccia computer che controlla la fotocamera integrata nel microscopio. Questo tipo di microscopia richiede sia la capacità di acquisire eventi molto rapidi sia il segnale generato dalla struttura cellulare osservata durante questi eventi. Dopo che le immagini sono state raccolte, un filmato dell'intero esperimento viene assemblato per mostrare la dinamica degli eventi molecolari di interesse. La microscopia video time-lapse ha una vasta gamma di applicazioni nel campo della ricerca biomedica ed è uno strumento potente e unico per seguire la dinamica degli eventi cellulari in tempo reale. Attraverso questa tecnica, possiamo valutare eventi cellulari come la migrazione, la divisione, la trasduzione del segnale, la crescita e la morte. Inoltre, utilizzando sonde molecolari fluorescenti siamo in grado di marcare molecole specifiche, come DNA, RNA o proteine e seguirle attraverso i loro percorsi molecolari e le loro funzioni. La microscopia video time-lapse presenta molteplici vantaggi, il principale dei quali è la capacità di raccogliere dati a livello di singola cellula, che la rendono una tecnologia unica per la ricerca nel campo della biologia cellulare. Tuttavia, la microscopia video time-lapse presenta limitazioni che possono interferire con l'acquisizione di immagini di alta qualità. Le immagini possono essere compromesse da entrambi i fattori esterni; sbalzi di temperatura, vibrazioni, umidità e fattori interni; pH, motilità cellulare. In questo articolo, descriviamo un protocollo per l'acquisizione dinamica di una proteina specifica, Parkin, fusa con la proteina fluorescente gialla potenziata (EYFP) al fine di tracciare la rimozione selettiva dei mitocondri danneggiati, utilizzando un approccio di microscopia video time-lapse.
Introduzione
La macro autofagia è un processo intracellulare che coinvolge la degradazione catabolica di componenti cellulari sia danneggiati che disfunzionali, come organelli e proteine allo scopo di riciclare o produrre energia. Per avviare questo processo metabolico, la cellula inghiotte i componenti cellulari danneggiati in una struttura a doppia membrana, nota come autofagosoma, che si fonde con un lisosoma e il suo contenuto viene degradato e riciclato 1,2. Esistono due tipi principali di autofagia, quella non selettiva e quella selettiva. Il processo di autofagia non selettiva si verifica quando la cellula si trova in condizioni di privazione di nutrienti e ha bi....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. elettroporazione di fibroblasti con entrambi vettori di espressione EYFP-Parkin e pDsRed2-Mito
- Far crescere le cellule di fibroblasti embrionali di topo immortalato su 10 centimetri piatto di tessuto-cultura con DMEM (modificata mezzo di Eagle di Dulbecco) medio supplementato con 10% di siero fetale bovino, 2 mmol / l L-glutammina, 100 U / ml di penicillina, e 100 mg / ml streptomicina in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO 2 a 37 ° C.
- Alla confluenza cella 80%, scartare il mezzo DMEM completo per aspirazione sterile e aggiungere 10 ml di 1x sterile tampone fosfato (PBS) (80 g di NaCl, 2,0 g di KCl, 14,4 g di Na 2....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Qui, si mostra come il video time-lapse microscopia è una tecnica potente che può essere utilizzato per seguire gli eventi molecolari di proteine fluorescenti-taggato in una singola cella. I risultati rappresentativi mostrano anche come questa tecnica permette l'acquisizione di immagini di alta qualità. Quando le immagini del processo molecolare, si ottengono, abbiamo la possibilità di analizzare in modi diversi. Qui, analizziamo l'intervallo di tempo tra l'inizio del proce.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
microscopia time-lapse può essere definita come la tecnica che si estende cellule vive da una singola osservazione in tempo per l'osservazione delle dinamiche cellulari per lunghi periodi di tempo. Questa metodologia è distinto da un semplice confocale microscopia cellule in vivo perché permette all'osservatore di identificare in tempo reale una singola proteina fluorescente-tag e seguire la sua dinamica all'interno di una singola cella vivo. Infatti, la microscopia confocale può facilmente identifica protei.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato in parte da sovvenzioni NIH (1R01CA137494, R01CA132115, R01CA086072 a R.G.P.), dal Kimmel Cancer Center NIH Cancer Center Core grant P30CA056036 (R.G.P.), da una sovvenzione della Breast Cancer Research Foundation, da generose sovvenzioni dal Dr. Ralph e Marian C. Falk Medical Research Trust (R.G.P.) e da una sovvenzione del Dipartimento della Salute della Pennsylvania (R.G.P.). In parte questo lavoro è stato supportato da una borsa di studio post-dottorato (G.D.) dell'American Italian Cancer Foundation e dalla Bioimaging Shared Resource del Sidney Kimmel Cancer Center (NCI 5 P30 CA-56036). Il Dipartimento declina specificamente la res....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM | Corning Life Science | 10-013-CV | Pre-riscaldamento a 37 ° C prima dell'uso |
| DMEM senza fenolo | Corning Life Science | 17-205-CV | Preriscaldare a 37 ° C prima dell'uso |
| Siero Fetale Bovino | Sigma-Aldrich | F2442 | Pre-riscaldare a 37 ° C prima dell'uso |
| L-Glutammina | Gibco | 25030 | Pre-riscaldare a 37 ° C prima dell'uso |
| Penicillina/streptomicina | Corning Life Science | 30-002-CI | Pre-riscaldare a 37 ° C prima dell'uso |
| Vettore di espressione EYFP-PARKIN | Addgene | 23955 | |
| pDsRed2-Mito vettore di espressione | Clontech | 632421 | |
| Nucleofector 2B device | LONZA | AAD-1001S | |
| Nucleofector for kit R NIH/3T3 | LONZA | VCA-1001 | |
| ZEISS AXIOVERT 200M microscopio invertito | CARL ZEISS | ||
| Cianuro di carbonile 4-(trifluorometossi)-fenilidrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Costruttore | |
| ImageJ | National Institute of Health | Costruttore |
Riferimenti
- Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 9-14 (2011).
- Zhi, X., Zhong, Q. Autophagy in cancer. F1000Prime Rep. 7, 18(2015).
- Ding, W. X., Yin, X. M.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
