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Articolo metodologico

Time-Lapse Video Microscopia per la valutazione di EYFP-Parkin aggregazione come marcatore per cellulare Mitophagy

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DOI:

10.3791/53657

⸱

4 maggio 2016

 ,  ,  , 
1Department of Cancer Biology, Thomas Jefferson University, SKCC, 2Department of Medical Oncology, Thomas Jefferson University, SKCC, 3Kazan Federal University

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo in dettaglio un approccio di microscopia video time-lapse per misurare il reclutamento temporale di EYFP-Parkin durante la rimozione selettiva dei mitocondri danneggiati. Questo processo dinamico di rimozione dei mitocondri danneggiati da EYFP-Parkin-dipendente può essere utilizzato come indicatore della salute cellulare in diverse condizioni sperimentali.

Abstract

La microscopia video time-lapse può essere definita come l'imaging in tempo reale di cellule viventi. Questa tecnica si basa sulla raccolta di immagini in diversi punti temporali. Gli intervalli di tempo possono essere impostati tramite un'interfaccia computer che controlla la fotocamera integrata nel microscopio. Questo tipo di microscopia richiede sia la capacità di acquisire eventi molto rapidi sia il segnale generato dalla struttura cellulare osservata durante questi eventi. Dopo che le immagini sono state raccolte, un filmato dell'intero esperimento viene assemblato per mostrare la dinamica degli eventi molecolari di interesse. La microscopia video time-lapse ha una vasta gamma di applicazioni nel campo della ricerca biomedica ed è uno strumento potente e unico per seguire la dinamica degli eventi cellulari in tempo reale. Attraverso questa tecnica, possiamo valutare eventi cellulari come la migrazione, la divisione, la trasduzione del segnale, la crescita e la morte. Inoltre, utilizzando sonde molecolari fluorescenti siamo in grado di marcare molecole specifiche, come DNA, RNA o proteine e seguirle attraverso i loro percorsi molecolari e le loro funzioni. La microscopia video time-lapse presenta molteplici vantaggi, il principale dei quali è la capacità di raccogliere dati a livello di singola cellula, che la rendono una tecnologia unica per la ricerca nel campo della biologia cellulare. Tuttavia, la microscopia video time-lapse presenta limitazioni che possono interferire con l'acquisizione di immagini di alta qualità. Le immagini possono essere compromesse da entrambi i fattori esterni; sbalzi di temperatura, vibrazioni, umidità e fattori interni; pH, motilità cellulare. In questo articolo, descriviamo un protocollo per l'acquisizione dinamica di una proteina specifica, Parkin, fusa con la proteina fluorescente gialla potenziata (EYFP) al fine di tracciare la rimozione selettiva dei mitocondri danneggiati, utilizzando un approccio di microscopia video time-lapse.

Introduzione

La macro autofagia è un processo intracellulare che coinvolge la degradazione catabolica di componenti cellulari sia danneggiati che disfunzionali, come organelli e proteine allo scopo di riciclare o produrre energia. Per avviare questo processo metabolico, la cellula inghiotte i componenti cellulari danneggiati in una struttura a doppia membrana, nota come autofagosoma, che si fonde con un lisosoma e il suo contenuto viene degradato e riciclato 1,2. Esistono due tipi principali di autofagia, quella non selettiva e quella selettiva. Il processo di autofagia non selettiva si verifica quando la cellula si trova in condizioni di privazione di nutrienti e ha bisogno di cercare sia i nutrienti essenziali che l'energia. Tuttavia, l'autofagia selettiva si verifica per mediare la rimozione sia di organelli disfunzionali/danneggiati che di proteine che altrimenti potrebbero essere tossiche. Uno dei processi di autofagia selettiva più studiati è la rimozione dei mitocondri, chiamata mitofagia 1,3-5.

I mitocondri sono gli organelli centrali per il metabolismo cellulare e la fonte primaria di adenosina trifosfato (ATP) attraverso la fosforilazione ossidativa attraverso la catena di trasporto degli elettroni, l'ossidazione degli acidi grassi e il ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA). Inoltre, i mitocondri regolano la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e rilasciano proteine che partecipano alle vie di morte cellulare 6-8.

La chinasi putativa 1 indotta da PTEN (PINK1) e la Parkin RBR E3 ubiquitina ligasi (Parkin) sono le proteine chiave implicate nel processo di mitofagia. La parkina può proteggere dalla morte cellulare mantenendo la cellula sana attraverso il controllo di qualità mitocondriale9. Dopo la perdita del potenziale di membrana mitocondriale, la Parkin citosolica viene reclutata nei mitocondri da PINK1. Questo reclutamento innesca gli eventi sequenziali della mitofagia 10. Esiste un'ampia gamma di prove che la mitofagia è un processo fondamentale di controllo della qualità dei mitocondri e le anomalie in questo processo guidano la malattia 7. Ad esempio, la malattia di Parkinson autosomica recessiva è stata associata a mutazioni nei geni che codificano per Parkin e PINK1 (PARK2 e PINK1, rispettivamente) 11. Il controllo di qualità della salute mitocondriale è essenziale per la rimozione dei mitocondri che contribuiscono all'accumulo di ROS12. Un'eccessiva presenza di ROS intracellulari può portare a danni sia del DNA nucleare che del DNA mitocondriale (DNA e DNA mt, rispettivamente).

Qui, mostriamo un approccio di microscopia video time-lapse per seguire l'aggregazione di Parkin dopo l'induzione della mitofagia mediata da Parkin in fibroblasti embrionali di topo immortalizzati tramite somministrazione in vitro di cianuro di carbonile 4-(trifluorometossi)-fenilidrazone (FCCP), un agente di disaccoppiamento. FCCP interrompe la sintesi di ATP cortocircuitando i protoni attraverso la membrana esterna dei mitocondri e quindi disaccoppiando la fosforilazione ossidativa dalla catena di trasporto degli elettroni 13. L'innesco della depolarizzazione della membrana mitocondriale porta alla rottura dei mitocondri e alla rimozione selettiva Parkin-dipendente. Pertanto, la trasfezione delle cellule di interesse con un vettore di espressione codificante Parkin fusa con un marcatore fluorescente (enhanced yellow fluorescent protein, EYFP) può essere utilizzata come tag fluorescente per seguire il reclutamento di Parkin durante il processo mitofagico. Al fine di visualizzare i mitocondri, abbiamo co-trasfettato pDsRed2-Mito, che codifica per la proteina fluorescente rossa (DsRed2) che contiene una sequenza mitocondriale di targeting della subunità VIII della citocromo c ossidasi (Mito). pDsRed2-Mito è progettato per la marcatura fluorescente dei mitocondri14. Il tempo necessario per la traslocazione di Parkin nella membrana mitocondriale può essere misurato e fornisce una misura indiretta della salute cellulare. Ad esempio, possiamo dire che se una linea cellulare knock-out per un particolare gene di interesse mostra un reclutamento più rapido o più lento di Parkin dopo l'induzione della mitofagia da parte di FCCP, quel prodotto genico sarebbe un attore chiave al fine di mantenere i tassi metabolici della cellula allo stato fisiologico e prevenire lo sviluppo di malattie. Pertanto, la microscopia video time-lapse fornisce uno strumento molto potente per applicazioni di ricerca di base e cliniche nel seguire la dinamica delle proteine marcate durante i loro processi molecolari e comprendere come questi processi sono influenzati durante una condizione patologica.

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Protocollo

1. elettroporazione di fibroblasti con entrambi vettori di espressione EYFP-Parkin e pDsRed2-Mito

  1. Far crescere le cellule di fibroblasti embrionali di topo immortalato su 10 centimetri piatto di tessuto-cultura con DMEM (modificata mezzo di Eagle di Dulbecco) medio supplementato con 10% di siero fetale bovino, 2 mmol / l L-glutammina, 100 U / ml di penicillina, e 100 mg / ml streptomicina in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO 2 a 37 ° C.
    1. Alla confluenza cella 80%, scartare il mezzo DMEM completo per aspirazione sterile e aggiungere 10 ml di 1x sterile tampone fosfato (PBS) (80 g di NaCl, 2,0 g di KCl, 14,4 g di Na 2 HPO 4, 2,4 g di KH 2 PO 4 e 1 L distillata H 2 O, PH: 7.4).
    2. Eliminare il PBS mediante aspirazione sterile e aggiungere 1 ml di tripsina-EDTA 0,25%. Incubare la piastra a 37 ° C finché le cellule vengono staccate (2 - 3 min). Aggiungere 4 ml di terreno DMEM completo, sospendere nuovamente le cellule ed estrarre 10 _6; l di sospensione cellulare per il conteggio emocitometro.
      NOTA: Il emocitometro è progettato in modo che il numero di cellule in un set di 16 quadrati angolo è equivalente al numero di cellule x 10 4 / ml.
  2. Seed 1 x 10 6 cellule su 10 cm piatti di coltura di tessuti 24 ore prima del processo di elettroporazione.
  3. Eliminare il terreno completo DMEM per aspirazione sterile e aggiungere 10 ml di PBS sterile. Eliminare il PBS mediante aspirazione sterile e aggiungere 1 ml di tripsina-EDTA 0,25%. Incubare la piastra a 37 ° C finché le cellule vengono staccate (2 - 3 min). Aggiungere 4 ml di terreno DMEM completo e risospendere le cellule in una provetta da 15 ml.
  4. Spin le celle in basso a 250 xg per 5 minuti usando un-centrifuga refrigerata (4 ° C). Eliminare il supernatante mediante aspirazione sterile e risospendere il pellet in 1 ml di PBS sterile. Spin le cellule giù a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C.
  5. Eliminare il surnatante tramite aspirazione sterili, e aggiungere 100 ml of soluzione mix per l'elettroporazione (82 ml di soluzione elettroporazione V + 18 ml di soluzione supplementare 1) al pellet e risospendere delicatamente il pellet pipettando (Per maggiori dettagli fare riferimento alla guida per l'utente). Aggiungere 2 mg di EYFP-Parkin (eccitazione / emissione 514/527) e 1 mg pDsRed2-Mito (eccitazione / emissione 565/620) alla sospensione cellulare.
  6. Trasferire la soluzione nella cuvetta sterile utilizzando una Pasteur monouso (entrambi gli strumenti sono forniti con il kit) e l'elettroporazione utilizzando il programma di pre-set NIH / 3T3 U-030 (impulso singolo, tensione a 200 V, capacità 960 uF, tempo di impulso 20 millisecondi , numero di impulsi: 1).
  7. Subito dopo l'elettroporazione, aggiungere 500 ml di mezzo fresco pre-riscaldato DMEM completo e inseminare la cella in 6 cm Piatto tessuto-coltura live-imaging grado e incubate in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO 2 a 37 ° C per 24 ore.

2. Time-Lapse Video Microscopia

  1. impostare la temperatura della camera del microscopio a 37 ° C prima dell'uso.
  2. A questo punto, preparare un supporto specifico imaging dal vivo di procedere con il protocollo sperimentale. Preparare il supporto di immagini dal vivo come segue; miscela DMEM privo di fenolo supplementato con 10% di siero fetale bovino, 2 mmol / l L-glutammina, 100 U / ml di penicillina, e 100 mg / ml di streptomicina. Pre-riscaldare il mezzo di imaging in tempo reale a 37 ° C in un bagno d'acqua.
  3. Eliminare il medium delle cellule elettroporate di aspirazione sterile e aggiungere 1 ml di terreno di immagini dal vivo pre-riscaldato, con una pipetta P1000 e incubare la piastra per 30 minuti a 37 ° C.
  4. Durante il periodo di incubazione piatto, afflusso 5% di CO 2 nella camera già del microscopio ad una temperatura stabile di 37 ° C.
  5. Posizionare la piastra con le cellule elettroporate nella camera del microscopio evitando i principali movimenti o oscillazioni.
  6. Utilizzando l'interfaccia software, impostare il microscopio per rilevare sia fluoresegnali scence dalle proteine ​​di fusione codificate dai vettori co-trasfettate, EYFP-Parkin (range eccitazione 495-510 nm e la gamma di emissione 520-550 nm, verde) e il pDsRed2-Mito (eccitazione massima 558 nm ed emissione massima 583 nm, rosso).
    1. Aprire il software di video microscopia time-lapse. Nel menu superiore selezionare il FITC per EYFP-Parkin e rodamina per pDsRed2-Mito. Nel menu superiore selezionare l'ingrandimento (20X).
  7. Utilizzando l'interfaccia del software, cercare la singola cellula che esprime entrambi i vettori co-trasfettate e registrare la posizione. Ripetere questa operazione fino a quando viene raccolto un minimo di 10 cellule per ogni condizione sperimentale (gruppo sperimentale).
    1. Selezionare il menu "Applicazioni" e cliccare su Multi Dimensional acquisizione. Nelle finestre Multi Dimensional Acquisizione selezionare i parametri necessari, quali il numero di acquisizioni, l'intervallo di tempo tra ogni acquisizione e la posizione della cella registrata. Clicca su "Acquisisci"Per avviare il processo di acquisizione.
  8. Avviare l'acquisizione basale sia EYFP-Parkin e segnale fluorescente DsRed2-Mito raccolta immagini ogni 5 min per un intervallo totale di 15 min.
  9. Preparare pre-riscaldato mezzo di imaging in tempo reale con una concentrazione di FCCP due volte superiore alla concentrazione finale di lavoro (0,1 - 10 pM, dipendente dal tipo cellulare).
  10. Interrompere il processo di acquisizione e aggiungere delicatamente 1 ml di pre-riscaldato medie immagini dal vivo con FCCP nella piastra all'interno della camera del microscopio con una pipetta P1000.
  11. Riavviare il processo di acquisizione come precedentemente descritto, per un periodo totale di 3 ore, utilizzando la posizione registrata. Salvare tutte le immagini acquisite per analizzare e creare un video del processo mitophagic quando l'acquisizione è finita.

3. Analisi

  1. Raccogliere tutte le immagini acquisite in formato ".tiff" su un personal computer
  2. Aprire le immagini con una grafica morbidaware e definire l'intervallo temporale si è verificato dal mitocondriale indotta depolarizzazione con FCCP alla prima immagine che mostra il reclutamento di Parkin nella membrana mitocondriale (Le immagini sono acquisite ogni 5 minuti). Ripetere questa analisi per ogni cella nel gruppo sperimentale.
  3. Etichettare la prima cella della colonna su un foglio con il nome sperimentale gruppo. Per ogni gruppo sperimentale, misurare gli intervalli temporali per Parkin assunzione di un minimo di 10 cellule. Fare una media degli intervalli temporali calcolati per Parkin reclutamento e definire la deviazione standard per ciascun gruppo sperimentale (Media ± SD, N = 10).
    1. Organizzare in colonne singoli intervalli temporali calcolati. Ogni colonna contiene il n = 10 misurazioni del gruppo sperimentale.
    2. Selezionare la "media" funzione dal menu Formula Builder. Selezionare i dati nella colonna. Selezionare la funzione "deviazione standard" dal menu Formula Builder. Select i dati nella colonna.
  4. Usando un approccio statistico, confrontare i gruppi sperimentali che applicano la statistica appropriata per definire una differenza significativa nella dinamica mitophagy tra i gruppi sperimentali. (Per esempio, due gruppi = di Student t-test, tre o più gruppi = ANOVA più un test post-hoc)

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Risultati

Qui, si mostra come il video time-lapse microscopia è una tecnica potente che può essere utilizzato per seguire gli eventi molecolari di proteine ​​fluorescenti-taggato in una singola cella. I risultati rappresentativi mostrano anche come questa tecnica permette l'acquisizione di immagini di alta qualità. Quando le immagini del processo molecolare, si ottengono, abbiamo la possibilità di analizzare in modi diversi. Qui, analizziamo l'intervallo di tempo tra l'inizio del proce...

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Discussione

microscopia time-lapse può essere definita come la tecnica che si estende cellule vive da una singola osservazione in tempo per l'osservazione delle dinamiche cellulari per lunghi periodi di tempo. Questa metodologia è distinto da un semplice confocale microscopia cellule in vivo perché permette all'osservatore di identificare in tempo reale una singola proteina fluorescente-tag e seguire la sua dinamica all'interno di una singola cella vivo. Infatti, la microscopia confocale può facilmente identifica protei...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato in parte da sovvenzioni NIH (1R01CA137494, R01CA132115, R01CA086072 a R.G.P.), dal Kimmel Cancer Center NIH Cancer Center Core grant P30CA056036 (R.G.P.), da una sovvenzione della Breast Cancer Research Foundation, da generose sovvenzioni dal Dr. Ralph e Marian C. Falk Medical Research Trust (R.G.P.) e da una sovvenzione del Dipartimento della Salute della Pennsylvania (R.G.P.). In parte questo lavoro è stato supportato da una borsa di studio post-dottorato (G.D.) dell'American Italian Cancer Foundation e dalla Bioimaging Shared Resource del Sidney Kimmel Cancer Center (NCI 5 P30 CA-56036). Il Dipartimento declina specificamente la responsabilità per un'analisi, interpretazioni o conclusioni. Non ci sono conflitti di interesse associati a questo manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEMCorning Life Science10-013-CVPre-riscaldamento a 37 ° C prima dell'uso
DMEM senza fenoloCorning Life Science17-205-CVPreriscaldare a 37 ° C prima dell'uso
Siero Fetale BovinoSigma-AldrichF2442Pre-riscaldare a 37 ° C prima dell'uso
L-GlutamminaGibco25030Pre-riscaldare a 37 ° C prima dell'uso
Penicillina/streptomicinaCorning Life Science30-002-CIPre-riscaldare a 37 ° C prima dell'uso
Vettore di espressione EYFP-PARKINAddgene23955
pDsRed2-Mito vettore di espressioneClontech632421
Nucleofector 2B deviceLONZAAAD-1001S
Nucleofector for kit R NIH/3T3LONZAVCA-1001
ZEISS AXIOVERT 200M microscopio invertitoCARL ZEISS
Cianuro di carbonile 4-(trifluorometossi)-fenilidrazone (FCCP)Sigma-AldrichC2920
MetaMorphMolecular DevicesCostruttore
ImageJNational Institute of HealthCostruttore
sperimentale sperimentale

Riferimenti

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