Articolo metodologico

Sviluppo di un Rat modello Alfa-sinucleina per la malattia di Parkinson mediante iniezione stereotassica di un ricombinante vettore virale adeno-associato

DOI:

10.3791/53670

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28 febbraio 2016

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1Laboratory for Neurobiology and Gene Therapy, Department of Neurosciences, KU Leuven, 2Division of Nuclear Medicine, Leuven University Hospital - KU Leuven, 3Laboratory for Molecular Virology and Gene Therapy, Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, KU Leuven, 4Leuven Viral Vector Core, KU Leuven

In questo articolo

Sommario

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Questo manoscritto descrive come la consegna genica locale mediata da vettori virali fornisca un modo attraente per esprimere i transgeni nel sistema nervoso centrale. Il protocollo delinea tutti i passaggi cruciali per eseguire un'iniezione di vettore virale nella substantia nigra del ratto per sviluppare un modello animale basato su vettore virale per la malattia di Parkinson.

Abstract

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Al fine di studiare i meccanismi molecolari della malattia di Parkinson (PD) e di sviluppare nuove strategie terapeutiche, ricercatori scientifici si basano su modelli animali. L'identificazione di geni PD-associata ha portato allo sviluppo di modelli di PD genetiche. modelli murini α-SYN più transgenici sviluppano progressiva patologia α-SYN, ma non riescono a visualizzare perdita di cellule dopaminergiche chiaro e deficit comportamentali dopamina-dipendente. Questo ostacolo è stato superato con il targeting diretto della substantia nigra con vettori virali sovraesprimono geni PD-associata. Locale consegna del gene utilizzando vettori virali fornisce un modo interessante per esprimere transgeni nel sistema nervoso centrale. Regioni specifiche del cervello possono essere mirati (ad esempio, la substantia nigra), espressione può essere indotta nella cornice adulti e alti livelli di espressione può essere raggiunto. Inoltre, possono essere utilizzati diversi sistemi di vettori basati su vari virus. Il protocollo descrive tutti i passi fondamentali per eseguire un vettore viraleiniezione nella substantia nigra del ratto di sviluppare un modello animale virale basato su vettori alfa-sinucleina per il morbo di Parkinson.

Introduzione

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Per studiare la fisiopatologia del PD e di sviluppare nuove strategie terapeutiche, vi è un urgente bisogno di modelli animali che assomigliano da vicino le neuropatologia, fisiologia e motorie sintomi di PD umana. Più alto è il valore predittivo, il meglio che possiamo tradurre le nuove terapie da modelli animali per i pazienti.

La scoperta di alfa-sinucleina (α-SYN) come primo gene PARCO nel 1997 ha portato allo sviluppo dei primi modelli di PD genetiche. Molti topi transgenici che sovraesprimono wild-type umana (WT) o mutante (A30P, A53T) α-SYN sono stati generati negli ultimi dieci anni. I livelli di α-SYN sovraespressione hanno dimos....

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono svolte in conformità con la Direttiva del Consiglio Comunità europee del 24 novembre 1986 (86/609 / CEE) e approvati dal Comitato di Bioetica dell'Università di Lovanio (Belgio).

1. ricombinante AAV produzione e purificazione

Nota: la produzione di vettore rAAV e purificazione è stata eseguita dal Leuven Viral Vector core (LVVC) come descritto in precedenza 17.

  1. Brevemente, transfect subconfluenti bassa (<50) passaggio cellule HEK 293T aderenti utilizzando lineare polietilenimmina 25kD 150 soluzione trasfezione nM NaCl e tre differenti plasmidi in un rapporto di 1: 1: 1 in terreno DMEM ....

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Risultati

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Lo schema generale di questo esperimento è raffigurato in figura 1

sovraespressione rAAV 2/7 mediata di A53T α-SYN induce deficit motori dopamina-dipendente.
Per verificare se il livello di α-SYN sovraespressione è sufficiente per indurre difficoltà motorie nei ratti, abbiamo sottoposto i topi al test del cilindro per valutare l'uso degli arti anteriori spontanea (Figura 3A).

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Discussione

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Ci sono diversi passaggi critici all'interno del protocollo. Il titolo di vettore e la purezza vettoriale influenza direttamente l'esito fenotipica del modello. Eccessive titoli vettoriali o lotti vettore non sufficientemente purificate possono causare tossicità non-specifica. Pertanto, l'uso di lotti vettoriali di alta qualità e appropriati vettori di controllo è indispensabile. Inoltre, l'esatto posizionamento della testa del ratto nel telaio stereotassico e la determinazione accurata delle coordinate .......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto reale o potenziale di interesse.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano Joris Van Asselberghs e Ann Van Santvoort per la loro eccellente assistenza tecnica. La ricerca è stata finanziata dal IWT-Vlaanderen (IWT SBO / 80020), la FWO Vlaanderen (G.0768.10), dal programma EC-FP6 'Dimi' (LSHB-CT-2005-512.146), il progetto del 7 ° PQ di RST MEFOPA (HEALTH -2.009-241.791), il programma del 7 ° PQ 'inmind' (HEALTH-F2-2011-278850), la KU Leuven (IOF-KP / 07/001, OT / 08 / 052A, IMIR PF / 10/017), e la MJFox Foundation (validazione del target 2010). A. Van der Perren e C. Casteels sono un post-dottorato compagni del Fondo fiamminga della ricerca scientifica. K. Van Laere è un collega clinica di alto livello ....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Femmina di ratti Wistar di 8 settimaneJanvier/200-250 g
Ketamina (Nimatek)Eurovet animal health804132
Medetomidine (Dormitor)Orion-Pharma/ Janssen Animal Health1070-499
  Anestetico locale per cuoio capelluto e orecchie: Xilocaï ne 2% gelAstrazeneca0137-547
TerramycinePfizer0132-472
Bupré norfina (vetergesic)Ecuphar2623-627
Jodium 1% isopropanoloVWR0484-0100
della testa stereotassicaSiringa di Stoeling/
Hamilton (30 gauge -20 mm -pst 2)Hamilton/ Filter Service7803-07
atipamezole (Antisedan)Orion-Pharma/Elanco1300-185
rAAV A53T & vettore alfa;-SYNLVVC, KU Leuven/https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/
pentobarbital sodio (Nembutal)Ceva Santé0059-444
microtomoMicromHM650
sinucleina policlonale di coniglio AbChemicon50381:5.000
policlonale di coniglio TH AbChemicon1521:1.000
rivelatore di ossiortosilicato di lutezio tomografo FOCUS 220Siemens/ Concorde Microsystems/
radioligando: 18F-FECT/
L-dopa: Prolopa 125Roche6 mg/kg i.p.
DMEM, GlutamaxLife TechnologiesN° 31331-093
Siero bovino fetaleLife TechnologiesN° 10270-106
25 kD polietilenimmina lineare (PEI)Polysciences/
OptiPrep Gradiente di densità Medium: IodixanolSigmaD1556-250ML
OptimenLife TechnologiesN° 51985-026
Paxinos 1 atlante steretattico watston, quarta edizioneElsevier/
telaio

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Magen, I., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of Parkinson's disease The state of the art. Prog Brain Res. 183, 53-87 (2010).
  2. Masliah, E., et al. Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha-synuclein mice: implic....

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Alpha synuclein ModelParkinson s DiseaseStereotactic InjectionViral VectorSubstantia NigraRecombinant AAVDopaminergic NeuronsMicroinjection ProcedureBehavioral TestsPET Imaging

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