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Articolo metodologico

Imaging Fibre serotoninergici nel midollo spinale mouse Uso del CHIAREZZA / Tecnica CUBIC

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DOI:

10.3791/53673

⸱

26 febbraio 2016

 ,  , 
1Brain Structure and Function Group, Neuroscience Research Australia, 2School of Medical Sciences, The University of New South Wales

In questo articolo

Sommario

Le proiezioni sopraspinali sono importanti per la percezione del dolore e altri comportamenti, e le fibre serotoninergiche sono uno di questi sistemi di fibre. Il presente studio si è concentrato sull'applicazione del protocollo combinato CLARITY/CUBIC al midollo spinale del topo al fine di studiare la terminazione di queste fibre serotoninergiche.

Abstract

fibre lunghe che scendono verso il midollo spinale sono essenziali per la locomozione, percezione del dolore, e altri comportamenti. Il modello terminazione in fibra nel midollo spinale della maggior parte di questi sistemi in fibra non sono state esaminate a fondo in qualsiasi specie. fibre serotoninergici, che proiettano al midollo spinale, sono stati studiati nei ratti e opossum su sezioni istologiche e il loro significato funzionale è stata dedotta in base al loro modello di terminazione in fibra nel midollo spinale. Con lo sviluppo della chiarezza e tecniche cubica, è possibile studiare questo sistema di fibre e la sua distribuzione nel midollo spinale, che rischia di rivelare caratteristiche precedentemente sconosciuti di percorsi supraspinal serotoninergici. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l'imaging delle fibre serotoninergici nel topo midollo spinale utilizzando la nitidezza, associato e le tecniche cubi. Il metodo prevede la perfusione di un mouse con una soluzione idrogel e chiarificazione del tessuto con una combinzione di compensazione reagenti. tessuto del midollo spinale è stato eliminato in poco meno di due settimane, e la conseguente colorazione immunofluorescenza contro la serotonina è stata completata in meno di dieci giorni. Con un microscopio a fluorescenza multi-fotone, il tessuto è stato digitalizzato e l'immagine 3D è stata ricostruita utilizzando il software OsiriX.

Introduzione

Le proiezioni sopraspinali sono responsabili della modulazione di diversi comportamenti come la percezione del dolore. Una delle proiezioni che trasportano informazioni nocicettive contiene fibre serotoninergiche, che originano dal rafe rombencefalico e dai nuclei reticolari adiacenti1,2. Studi fisiologici e farmacologici hanno dimostrato un aumento del rilascio di serotonina nel corno dorsale del midollo spinale dopo stimolazione elettrica dei nuclei del rafe nel rombencefalo3-5. Nel ratto e nell'opossum, le fibre serotoninergiche del rafespino hanno terminali densi, non solo nel corno dorsale6-8, ma anche nella zona intermedia7,9,10, nel corno ventrale7,11 e persino nella lamina 1012,13. Non ci sono studi simili sul topo. Il presente studio mirava a mappare il pattern di terminazione delle fibre serotoninergiche derivanti dai nuclei del rafe rombencefalico e dai loro nuclei reticolari adiacenti nel midollo spinale del topo utilizzando il metodo CLARITY14 recentemente pubblicato e la sua modifica - CUBIC15.

La fluorescenza convenzionale o l'immunoistochimica della perossidasi del midollo spinale mostra chiaramente la distribuzione delle fibre serotoninergiche nella sostanza grigia del midollo spinale in sezioni trasversali spesse 30-40 μm. Tuttavia, questo approccio non mostra la continuità dei tratti di fibre serotoninergiche nella sostanza bianca e dei loro collaterali nella sostanza grigia. Sebbene la ricostruzione 3D delle sezioni istologiche abbia fatto progredire la nostra conoscenza dei tratti di fibre, rimane una sfida per istologi e anatomisti seguire un singolo tratto a causa di piccole distorsioni nel tessuto causate dal taglio. Per aggirare questo ostacolo, un certo numero di ricercatori ha sviluppato vari protocolli per rendere trasparente l'intera struttura del tessuto e raccogliere un'immagine del tessuto inalterato in un unico file video17-21. Finora, la tecnica di idrogel tissutale (CLARITY), rigida a scambio lipidico, ibridata con acrilammide, compatibile con imaging/immunocolorazione (CLARITY), sviluppata dal gruppo14,15 di Deisseroth, così come CUBIC, sviluppata da Susaki et al16 sono le più riuscite. Dalla pubblicazione dei protocolli, molti ricercatori hanno iniziato a utilizzare queste tecniche per studiare vari aspetti dei tessuti biologici, tra cui, non solo il cervello22-25, ma anche il cuore, i reni, l'intestino e i polmoni26,27.

Fissando il midollo spinale del topo con la soluzione di idrogel (CLARITY) e purificando con i reagenti CUBIC (che è un metodo molto più veloce di quello descritto dal protocollo CLARITY originale14,15), un blocco di tessuto del midollo spinale di 2-3 mm di lunghezza è stato eliminato entro due settimane e la colorazione in immunofluorescenza per la serotonina è stata completata in otto giorni. Con una semplice combinazione di agenti chimici, l'immunoistochimica convenzionale può essere utilizzata per creare un'immagine dei singoli tratti di fibre in un file video 3D in circa un mese.

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Protocollo

Etica Dichiarazione: Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali seguono le linee guida del Comitato Animal Care and Ethics (ACEC) presso l'Università del New South Wales (il numero ACEC approvato è di 14 / 94A).

1. Preparazione del cavo del mouse trasparente spinale

  1. Preparazione di Ice Cold Hydrogel Soluzione
    1. Preparazione della soluzione di paraformaldeide al 16% (PFA)
      1. Aggiungere 16 g di polvere di paraformaldeide in 70 ml-pre riscaldato acqua distillata (50-55 ° C) e mescolare su un agitatore magnetico riscaldata fino paraformaldeide si scioglie. Nota: Non lasciare che la soluzione per il riscaldamento oltre 55 ° C ed essere consapevoli del fatto che paraformaldeide è tossico.
      2. Trasferire la soluzione paraformaldeide ad un cilindro e aggiungere acqua distillata fino a 100 ml. Raffreddare la soluzione paraformaldeide utilizzando un C frigorifero a 4 °.
    2. Sciogliere 125 mg VA-044 iniziatore 26,25 ml di acqua distillata e raffreddare la soluzione in un 4° C frigo.
    3. Raffreddare 5 ml di soluzione di acrilammide (40%), 1,25 ml di soluzione di bis (2%) (ATTENZIONE: Bis e le soluzioni di acrilamide sono tossici, può causare difetti genetici o il cancro), 5 ml di 10X PBS, 12,5 ml al 16% soluzione PFA, e la soluzione di iniziatore VA-044 su ghiaccio.
    4. Mescolare le soluzioni sopra sul ghiaccio.
      Nota: il volume totale è di 50 ml.
  2. Perfusione e Raccolta del cavo del mouse spinale
    1. Anestetizzare un mouse con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (80 mg / kg) e xyzaline (5 mg / kg) diluito in soluzione fisiologica 0,9% normale. Il dosaggio per mouse può essere inferiore a quello dei ratti.
    2. Su una superficie di plastica adatta in una cappa aspirante, fissare gli arti del mouse lontano dal corpo (nastro adesivo è efficace) una volta che il mouse non risponde a una presa per la sua pelle del piede.
    3. Tagliare la pelle del mouse sopra il petto e poi il torace osso per esporre il cuore con una forbice.
    4. Utilizzando una pompa peristaltica, con un ago 25 G collegato a the estremità del tubo, inserire l'ago nel ventricolo sinistro del cuore, snip l'atrio destro per creare un punto di uscita per il sangue e quindi avviare il lavaggio con 40 ml 0,9% soluzione fisiologica una velocità di circa 10 ml / min.
    5. Al termine, profumato il mouse con 35 ml di ghiaccio soluzione idrogel freddo.
      Nota: profumato ad una velocità di 10 ml / min per evitare gonfiore del tessuto nervoso.
    6. Incidere la pelle sul dorso con una lama e quindi rimuovere i muscoli vicino al vertebrati. Dopo il taglio archi vertebrali da un lato e facendoli ruotare verso l'altro lato, prendere il midollo spinale dalla colonna vertebrale, con una multa forbice.
  3. Cancellazione del cavo del mouse spinale
    1. Posizionare il midollo spinale in 15 ml di soluzione di idrogel notte a 4 ° C.
    2. Rimuovere 10 ml della soluzione di idrogel e versare il resto della soluzione con i segmenti del midollo spinale in una provetta 5 ml. Riempire il tubo 5 ml con la soluzione di idrogel fino a quando non è completamente pieno.
    3. Stretch un piccolo pezzo di parafilm sopra la parte superiore del tubo 5 ml e poi avvolgere parafilm intorno al collo del tubo. Nota: Assicurarsi che i contatti parafilm la soluzione idrogel e non vi siano bolle tra la soluzione idrogel e il parafilm.
    4. Inserire il tubo 5 ml a 37   ° C forno durante la notte. Osservare la soluzione idrogel fino a farla diventare un gel.
    5. Prendere il tubo 5 ml dal forno e rimuovere il gel dal tubo con una chiave (come un shoveled 1 ml puntale). Rimuovere il gel dal tessuto del midollo spinale da attaccare il tessuto grossolano al gel e poi prendere il tessuto grossolano di distanza (il gel si attacca al tessuto e quindi sarà rimosso dal tessuto).
    6. Dopo aver rimosso il gel dal tessuto del midollo spinale, lavare il midollo spinale 4 volte con PBS 1x (pH 7,4) per 24 ore su un agitatore.
    7. Preparare la soluzione di compensazione CUBIC sciogliendo 3,85 g di urea e 3,85 g N, N, N ', N'-tetrakis (2-idrossipropil) ethylenediamine a 5.38 ml di acqua distillata.
      Nota: Un agitatore caldo viene utilizzato. Aggiungere 2,31 g di polietilene glicole mono-p-isooctylphenyl etere / Triton X-100 alla soluzione una volta che è chiaro e si raffredda a temperatura ambiente.
      Nota: 10 g di questi tre sostanze chimiche sono per un mouse.
    8. Tagliare il mouse midollo spinale coronale in segmenti lunghi 2-3 mm con una lametta e metterli in 5 ml di soluzione di compensazione CUBIC sopra. Posizionare su un agitatore in forno a 37   ° C per 3 giorni.
    9. Tre giorni dopo, cambiare la soluzione di compensazione per una nuova. Nota: la suddetta soluzione viene preparata prima dell'uso.
    10. Due o tre giorni più tardi, dopo l'aggiornamento della soluzione di compensazione CUBIC, controllare la trasparenza del tessuto contro una carta con carattere 8 lettere. Se è trasparente, le lettere sono visibili attraverso il tessuto eliminato. Rimuovere la soluzione di compensazione e aggiungere 4 ml di PBST (0,1% Triton-X100) per lavare il tessuto 4 volte al giorno (ogni 6 ore).

2. immunofluorescenza

  1. Incubare i segmenti del midollo spinale nella soluzione di anticorpo primario (anti-serotonina, cresciuto a coniglio, diluito 1: 100 in PBST) per 3 giorni su un agitatore in forno a 37 °.
  2. Rimuovere la soluzione di anticorpi e aggiungere 4 ml di PBST (0,1% Triton-X100) per lavare i segmenti del midollo spinale 4 volte al giorno (ogni 6 ore) in un forno a 37 ° C.
  3. Rimuovere la soluzione PBST e aggiungere la soluzione di anticorpo secondario (594 coniugato capra anti-IgG di coniglio, diluito 1: 100 in PBST) incubare il tessuto per 3 giorni su un agitatore in forno a 37 °.
  4. Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario e aggiungere 4 ml di PBST per lavare i segmenti del midollo spinale 4 volte al giorno (ogni 6 ore) su un agitatore in forno a 37 °. Il giorno successivo il tessuto è pronto per l'imaging.

3. Imaging

  1. Rimuovere la soluzione PBST e aggiungere 4 ml di 85% glicerolo per rendere l'indice di rifrazione del tessuto anche.
  2. Controllare la chiarezza del tessuto. Una volta chiarito in circa 1 ora, mettere il tessuto su una grande, scivolo vetro sottile che si adatta il telaio del multi-photo fluorescente microscopio tenuta.
  3. Mettere qualche goccia di 85% glicerolo accanto al tessuto del midollo spinale e applicare il coprioggetto con un bicchiere coprioggetto 22 x 50 mm 2.
    Nota: L'orientamento del midollo spinale decide come l'immagine assomiglia.
  4. Mettere il vetrino sul telaio del microscopio a fluorescenza multi-photon tenuta e spostare il tessuto nel percorso della luce.
  5. Scegliere l'elio neon linea laser 594 nm e regolare l'intensità del laser al livello ottimale controllando la luminosità del segnale positivo nell'immagine live.
  6. Selezionare l'area di scansione del tessuto del midollo spinale con l'obiettivo 20X (in acqua, NA 0,7) e preparare per creare un z-stack, e la profondità di ogni passo impostato a 3 micron.
  7. Acquisire il tessuto dalla parte superiore alla parte inferiore del z-stack sotto la obiet 20Xtiva e quindi obiettivo 63X (in olio, NA 1.4) (dimensione del passo è stato di 1 micron), rispettivamente. Ricostruire i video 3D utilizzando un software 3D 28.

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Risultati

Questa sezione mostra i risultati di anticorpi serotonina colorazione nel topo trasparente midollo spinale utilizzando una combinazione di chiarezza e protocolli cubi. Abbiamo dimostrato che le fibre serotoninergici sono presenti in tutti lamine del midollo spinale con una predominanza nella porzione ventrale del corno ventrale (Figura 1, vedi anche Video 1). Il tessuto di controllo non ha avuto fibre positive (risultato non è stato mostrato). Nel corno ...

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Discussione

Il protocollo descritto mostra come le fibre immagine serotoninergici nel topo midollo spinale con la chiarezza combinato e tecniche di cubi. Si introduce un processo di compensazione più veloce rispetto al protocollo di compensazione passiva sviluppato da Cheung et al. 14 e Tomer et al. 15 e permette il tessuto del midollo spinale per essere ben supportato dal idrogel durante compensazione.

Un passo importante durante la fissazione del mouse midollo s...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dall'Australian Research Council Centre of Excellence for Integrative Brain Function (ARC Centre Grant CE140100007), da una sovvenzione per un progetto NHMRC (#1086643). Il Prof. George Paxinos è supportato da una sovvenzione NHMRC (#1043626).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Fotoiniziatore VA044Wakova-044/225-02111http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
soluzione di acrilammide al 40%Bio Rad161-0140http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution
soluzione al 2% Bis BioRad161-0142http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31-
879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d
paraformaldeideSigma158127http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en®ion=AU
ureaMerck Millipore66612http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612
N,N,N',N'-tetrakis (2-idrossipropil) etilendiamminaMerck Millipore821940http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanolo,MDA_CHEM-821940
Triton-X 100Merck Millipore648462http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462
saccarosioSigmaS0389http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en®ion=AU
anticorpo della serotoninaMerck MilliporeAB938http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938
capra anti coniglio IgG (H + L) anticorpo secondario, Alexa Fluor® 594 coniugatoLife Technologies. A-11012
Microscopio multifotoneLeicaLeica TCS SP5 MP STEDhttp://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/
https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012

Riferimenti

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