Le proiezioni sopraspinali sono importanti per la percezione del dolore e altri comportamenti, e le fibre serotoninergiche sono uno di questi sistemi di fibre. Il presente studio si è concentrato sull'applicazione del protocollo combinato CLARITY/CUBIC al midollo spinale del topo al fine di studiare la terminazione di queste fibre serotoninergiche.
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Articolo metodologico
Imaging Fibre serotoninergici nel midollo spinale mouse Uso del CHIAREZZA / Tecnica CUBIC
In questo articolo
Sommario
Abstract
fibre lunghe che scendono verso il midollo spinale sono essenziali per la locomozione, percezione del dolore, e altri comportamenti. Il modello terminazione in fibra nel midollo spinale della maggior parte di questi sistemi in fibra non sono state esaminate a fondo in qualsiasi specie. fibre serotoninergici, che proiettano al midollo spinale, sono stati studiati nei ratti e opossum su sezioni istologiche e il loro significato funzionale è stata dedotta in base al loro modello di terminazione in fibra nel midollo spinale. Con lo sviluppo della chiarezza e tecniche cubica, è possibile studiare questo sistema di fibre e la sua distribuzione nel midollo spinale, che rischia di rivelare caratteristiche precedentemente sconosciuti di percorsi supraspinal serotoninergici. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l'imaging delle fibre serotoninergici nel topo midollo spinale utilizzando la nitidezza, associato e le tecniche cubi. Il metodo prevede la perfusione di un mouse con una soluzione idrogel e chiarificazione del tessuto con una combinzione di compensazione reagenti. tessuto del midollo spinale è stato eliminato in poco meno di due settimane, e la conseguente colorazione immunofluorescenza contro la serotonina è stata completata in meno di dieci giorni. Con un microscopio a fluorescenza multi-fotone, il tessuto è stato digitalizzato e l'immagine 3D è stata ricostruita utilizzando il software OsiriX.
Introduzione
Le proiezioni sopraspinali sono responsabili della modulazione di diversi comportamenti come la percezione del dolore. Una delle proiezioni che trasportano informazioni nocicettive contiene fibre serotoninergiche, che originano dal rafe rombencefalico e dai nuclei reticolari adiacenti1,2. Studi fisiologici e farmacologici hanno dimostrato un aumento del rilascio di serotonina nel corno dorsale del midollo spinale dopo stimolazione elettrica dei nuclei del rafe nel rombencefalo3-5. Nel ratto e nell'opossum, le fibre serotoninergiche del rafespino hanno terminali densi, non solo nel corno dorsale6-8, ma anche nella zona intermedia7,....
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Protocollo
Etica Dichiarazione: Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali seguono le linee guida del Comitato Animal Care and Ethics (ACEC) presso l'Università del New South Wales (il numero ACEC approvato è di 14 / 94A).
1. Preparazione del cavo del mouse trasparente spinale
- Preparazione di Ice Cold Hydrogel Soluzione
- Preparazione della soluzione di paraformaldeide al 16% (PFA)
- Aggiungere 16 g di polvere di paraformaldeide in 70 ml-pre riscaldato acqua distillata (50-55 ° C) e mescolare su un agitatore magnetico riscaldata fino paraformaldeide si scioglie. Nota: Non lasciare che la soluzione per il riscald....
- Preparazione della soluzione di paraformaldeide al 16% (PFA)
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Risultati
Questa sezione mostra i risultati di anticorpi serotonina colorazione nel topo trasparente midollo spinale utilizzando una combinazione di chiarezza e protocolli cubi. Abbiamo dimostrato che le fibre serotoninergici sono presenti in tutti lamine del midollo spinale con una predominanza nella porzione ventrale del corno ventrale (Figura 1, vedi anche Video 1). Il tessuto di controllo non ha avuto fibre positive (risultato non è stato mostrato). Nel corno .......
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Discussione
Il protocollo descritto mostra come le fibre immagine serotoninergici nel topo midollo spinale con la chiarezza combinato e tecniche di cubi. Si introduce un processo di compensazione più veloce rispetto al protocollo di compensazione passiva sviluppato da Cheung et al. 14 e Tomer et al. 15 e permette il tessuto del midollo spinale per essere ben supportato dal idrogel durante compensazione.
Un passo importante durante la fissazione del mouse midollo s.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dall'Australian Research Council Centre of Excellence for Integrative Brain Function (ARC Centre Grant CE140100007), da una sovvenzione per un progetto NHMRC (#1086643). Il Prof. George Paxinos è supportato da una sovvenzione NHMRC (#1043626).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Fotoiniziatore VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| soluzione di acrilammide al 40% | Bio Rad | 161-0140 | http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution |
| soluzione al 2% Bis Bio | Rad | 161-0142 | http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31- 879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d |
| paraformaldeide | Sigma | 158127 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en®ion=AU |
| urea | Merck Millipore | 66612 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612 |
| N,N,N',N'-tetrakis (2-idrossipropil) etilendiammina | Merck Millipore | 821940 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanolo,MDA_CHEM-821940 |
| Triton-X 100 | Merck Millipore | 648462 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462 |
| saccarosio | Sigma | S0389 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en®ion=AU |
| anticorpo della serotonina | Merck Millipore | AB938 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938 |
| capra anti coniglio IgG (H + L) anticorpo secondario, Alexa Fluor® 594 coniugato | Life Technologies | . A-11012 | |
| Microscopio multifotone | Leica | Leica TCS SP5 MP STED | http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/ |
Riferimenti
- Rivot, J. P., Chaouch, A., Besson, J. M. Nucleus raphe magnus modulation of response of rat dorsal horn neurons to unmyelinated fiber inputs: partial involvement of serotonergic pathways. J Neurophysiol. 44 (6), 1039-1057 (1980).
- Liang, H., Paxinos, G., Watson, C.
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Ristampe e permessi
